كفاءة النسخ التي تسيطر عليها نظام التعبير Plasmid للتحقيق في استقرار نصوص مرنا في الخلايا الظهارية الألفيولار الابتدائية
Summary
هنا ، نقدم أداة يمكن استخدامها لدراسة التشكيل ما بعد النسخ من نسخة في الخلايا الظهارية السنخية الأولية باستخدام نظام تعبير غير قابل للاختزال إلى جانب تقنية الكهربية ماصة.
Abstract
دراسة التنظيم بعد النسخ أمر أساسي لفهم تعديل الحمض النووي الريبي رسول معين (مرنا) وتأثيره على التوازن الخلية والتمثيل الغذائي. في الواقع ، يمكن للتقلبات في التعبير عن النص تعديل كفاءة الترجمة وفي نهاية المطاف النشاط الخلوي للنص. وقد وضعت عدة نهج تجريبية للتحقيق في نصف عمر مرنا على الرغم من أن بعض هذه الأساليب لديها قيود تمنع الدراسة السليمة للتشكيل بعد النسخ. يمكن لنظام التعريفي المروج التعبير عن جين ذات أهمية تحت سيطرة مروج الاصطناعية التتراسيكلين المنظمة. تسمح هذه الطريقة بتقدير نصف العمر لـ مرنا معين تحت أي حالة تجريبية دون التوازن الخلوي المزعج. عيب رئيسي واحد من هذه الطريقة هو ضرورة الخلايا transfect، مما يحد من استخدام هذه التقنية في الخلايا الأولية المعزولة التي هي مقاومة للغاية لتقنيات الترانزفيشن التقليدية. وقد استخدمت الخلايا الظهارية الألفية في الثقافة الأولية على نطاق واسع لدراسة البيولوجيا الخلوية والجزيئية للظهارة السنخية. الخصائص الفريدة والنمط الظاهري للخلايا السنخية الأولية تجعل من الضروري دراسة التشكيلات الما بعد النسخ من الجينات ذات الأهمية في هذه الخلايا. لذلك ، كان هدفنا هو تطوير أداة جديدة للتحقيق في التشكيلات المابعد النسخية من mRNAs ذات الاهتمام في الخلايا الظهارية السنخية في الثقافة الأولية. قمنا بتصميم بروتوكول نقل عابر سريع وفعال لإدراج نظام تعبير البلازميد الذي يتم التحكم فيه بشكل نصي في الخلايا الظهارية السنخية الأولية. هذه الاستراتيجية الاستنساخ، وذلك باستخدام epitope الفيروسية لوضع علامة على بناء، يسمح للتمييز السهل من بناء التعبير من ذلك من mRNAs الذاتية. باستخدام طريقة تعديل دورة القياس الكمي (Cq) ، يمكن بعد ذلك قياس التعبير عن النص في فترات زمنية مختلفة لقياس نصف عمره. توضح بياناتنا كفاءة هذا النهج الجديد في دراسة التنظيم بعد النسخ في مختلف الظروف الفسيولوجية المرضية في الخلايا الظهارية السنخية الأولية.
Introduction
وقد تم تطوير العديد من التقنيات لتحديد نصف عمر mRNAs. تسمح تقنية الاضمحلال التي تطارد النبض ، والتي تستخدم mRNAs المسمى ، بإجراء تقييم متزامن لمجموعة كبيرة من الحمض النووي الريبي مع الحد الأدنى من الاضطراب الخلوي. ومع ذلك ، فإن هذا النهج لا يسمح بتقدير مباشر لنصف عمر نسخة جينية واحدة ولا يمكن تنفيذه لدراسة التشكيل بعد النسخ من مرنا بعد التحفيز مع عوامل النمو ، ROS ، alarmins ، أو الالتهاب1.
استخدام مثبطات النسخ، مثل actinomycin D و α-amanitin، هو طريقة بسيطة نسبيا لقياس حركية تدهور مرنا مع مرور الوقت. وتعتمد إحدى المزايا الرئيسية لهذا النهج على التقنيات السابقة (أي مطاردة النبض) على القدرة على تقدير نصف عمر نسخة معينة مباشرة ومقارنة الكيفية التي يمكن أن تؤثر بها العلاجات المختلفة على حركية تدهورها. ومع ذلك ، فإن التأثير الضار الكبير لمثبطات النسخ على فسيولوجيا الخلايا يمثل عيبًا رئيسيًا للنهج2. في الواقع ، فإن تثبيط النسخ الخلوي كله مع هذه الأدوية له آثار جانبية سلبية من اضطراب تخليق العناصر الرئيسية المشاركة في استقرار مرنا ، مثل microRNAs (miRNAs) ، وكذلك التعبير وتوليف البروتينات الملزمة للحمض النووي الريبي ، والتي تعتبر مهمة لتدهور وثبات مرنا. وبالتالي فإن الاضطرابات الشديدة للنسخ الجيني من قبل هذه الأدوية يمكن أن تعدل في الواقع منحنيات تدهور النصوص.
يمثل نظام التعريفي المروج نهجًا ثالثًا لقياس نصف عمر مرنا محددة. يقيس هذا الأسلوب تدهور مرنا محددة بطريقة مماثلة للطرق التي تستخدم مثبطات النسخ. وكثيرا ما تستخدم نوعين من نظم التعريفي: المصل الناجم عن c-fos المروج3 ونظام Tt-Off inducible4. مع نظام c-fos ، لا توجد حاجة إلى استخدام مثبطات النسخ التي يمكن أن تكون سامة للخلية. ومع ذلك، تتطلب هذه الطريقة مزامنة دورة الخلية، مما يمنع تقييم الاستقرار الفعلي للنص أثناء المرحلةالبينية 5. وعلى النقيض من ذلك، يسمح نظام Tet-Off بالتعبير القوي عن جين الاهتمام (GOI) تحت سيطرة مروج اصطناعي منظم من التتراسيكلين. يتطلب هذا النظام وجود عنصرين يجب أن يتم إصابة cotransفي الخلية لتكون وظيفية. أول plasmid (pTet-Off) يعبر عن البروتين التنظيمي tTA-Adv، وهو عامل النسخ الاصطناعية الهجينة تتألف من المثبط prokaryotic TetR (من إتشيريشيا كولاي) تنصهر إلى ثلاثة مجالات تحويل النسخ من البروتين الفيروسي HSV VP16. يتم استنساخ GOI في البلازميد pTRE-Tight تحت سيطرة مروج اصطناعي (PTight)، والذي يتألف من الحد الأدنى من التسلسل للمروج الفيروس المضخم للخلايا (CMV) المنصهر إلى سبعة تكرارات لتسلسل مشغل tetO. النسخ من الجين المصب من فضيق يعتمد على تفاعل TetR مع tetO. في وجود التتراسيكلين أو مشتقها ، دوكسيسيكلين ، يفقد المكتم TtR تقاربه لمشغل tetO ، مما يؤدي إلى وقف النسخ4. خصائص نظام تيت حالا جعله نموذجا مثاليا لدراسة التعبير مرنا محددة في الخلايا eukaryotic مع تجنب الآثار التجنبية المحتملة التي هي ثانوية لعدم وجود تسلسل التنظيمية prokaryotic في الخلية eukaryotic6. عادة، يتم استخدام خطوط خلية Tet-Off المستقرة بشكل مضاعف (HEK 293 و HeLa و PC12) مع هذا النظام لدمج نسخ من بلازميدات المنظم والاستجابة للوصول المريح إلى التعبير الجيني القابل للتحكم7و8و9.
وقد استخدمت عدة نماذج من الخلايا الظهارية السنخية في الثقافة لدراسة البيولوجيا الخلوية والجزيئية للظهارة السنخية. لسنوات، وقد استخدم الباحثون على نطاق واسع الإنسان أو القوارض الخلايا الأولية10،11 وكذلك خطوط الخلايا الخالدة مثل A549 الإنسان أو الفئران RLE-6TN الخلايا12،13. على الرغم من أنها عموما أقل تكاثرية وأكثر صعوبة للثقافة وtransfect، الخلايا الظهارية السنخية في الثقافة الأولية لا تزال المعيار الذهبي لدراسة وظيفة وخلل وظيفي من ظهارة السنخية في الظروف الفسيولوجية والمرضية. في الواقع ، لا تظهر خطوط الخلايا الخالدة مثل خلايا A549 الخصائص المعقدة والأنماط الظاهرية للخلايا الأولية ، في حين أن الخلايا الظهارية السنخية في الثقافة الأولية تلخص الخصائص الرئيسية للظهارة السنخية ، ولا سيما القدرة على تشكيل حاجز مستقطب وضيق14،15. لسوء الحظ ، فإن هذه الخلايا مقاومة للغاية لتقنيات الترانزفيشن التقليدية ، مثل تلك التي تستخدم الليبوزومات ، مما يجعل استخدام نظام مستحث ًا للمروج مثل Tet-Off أمرًا صعبًا للغاية.
التشكيل posttranscriptional من mRNAs هي واحدة من أكثر الطرق فعالية لتعديل سريع التعبير الجيني للنص16. وتلعب المنطقة غير المترجمة من قبل مرنا 3 ‘(3’ UTR) دوراً هاماً في هذه الآلية. وقد ثبت أنه، على عكس 5 ‘UTR، هناك ارتباط أسي بين طول UTR 3 ‘والتعقيدات الخلوية والمورفولوجية للكائن الحي. هذا الارتباط يشير إلى أن UTR 3 ‘ ، مثل مناطق ترميز مرنا ، قد تعرضت للاختيار الطبيعي للسماح لتعديل ما بعد النسخ معقدة على نحو متزايد في جميع أنحاء تطور17. يحتوي UTR 3 ‘على العديد من المواقع الملزمة للبروتينات وmiRNAs التي تؤثر على استقرار وترجمة النص.
في هذا العمل ، وضعنا أداة للتحقيق في دور المجالات المحفوظة للغاية في UTR 3 ‘ من GOI للسيطرة على استقرار النص. ركزنا على قناة الصوديوم الظهارية ، وحدة ألفا الفرعية (αENaC) ، والتي تلعب دورًا رئيسيًا في فسيولوجيا الظفية الظهارية18. تم نقل الخلايا الظهارية الألفية في الثقافة الأولية بنجاح بشكل عابر مع المكونين من نظام Tet-Off ، والذي يسمح بدراسة دور UTR 3 ‘في استقرار مرنا مع نظام يؤثر بشكل أدنى على فسيولوجيا الخلايا والتمثيل الغذائي بالمقارنة مع استخدام مثبطات النسخ مع بروتوكولات أخرى. ووُضعت استراتيجية للاستنساخ للتمييز بين تعبير الـ GOI والتعبير عن الجين الذاتي باستخدام نسخة غير منسّبة (V5). ثم تم نقل الاستجابة والبلازميدات التنظيمية إلى الخلايا الظهارية السنخية باستخدام تقنية الكهربية ماصة. وفي وقت لاحق، تم قياس التعبير عن النص من خلال احتضان الخلايا مع الدوكسيسيكلين على فترات زمنية مختلفة. تم تقييم نصف عمر النص من قبل RT-qPCR باستخدام طريقة CQ معدلة باستخدام منتج tTA-Ad مرنا عبر العدوى للتطبيع. من خلال بروتوكولنا، نقدم طريقة مريحة لدراسة التشكيل اللاحق للنسخة من نسخة في ظل ظروف مختلفة وتحديد مشاركة المناطق غير المترجمة بمزيد من التفصيل.
Protocol
Representative Results
Discussion
كان انخفاض معدل الترانسفيكال للخلايا الظهارية السنخية في الثقافة الأولية قيدًا خطيرًا على استخدام نظام Tet-Off لتقييم استقرار مرنا في هذه الخلايا. ومع ذلك ، تم التغلب على هذا القيد عن طريق الكهربية ماصة ، مما يسمح بكفاءة نقل 25-30 ٪(الشكل 1 والشكل 3)26.</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تلقى فرانسيس Migneault الدعم من زمالة قدمتها شبكة الصحة التنفسية في كيبيك والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) برنامج تدريب الرئة ، ومنحة طلابية من FRSQ ومنحة طلابية من كلية الدراسات العليا وغيرها ما بعد الدكتوراه، جامعة مونتريال. وقد دعم هذا العمل كرسي جوسلين لاماري في البحوث السريرية والمعاهد الكندية للبحوث الصحية [YBMOP-79544].
Materials
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | – | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol – Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
References
- Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
- Ljungman, M. The transcription stress response. Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).
- Ross, J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).
- Harkin, D. P., et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell. 97 (5), 575-586 (1999).
- Formisano, L., et al. The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway. Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).
- Yin, D. X., Schimke, R. T. BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells. 암 연구학. 55 (21), 4922-4928 (1995).
- Johnstone, R. W., et al. Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival. Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).
- Olotu, C., et al. Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).
- Goldmann, T., et al. Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis. Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).
- Huang, C., et al. Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).
- Gao, R., et al. Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway. Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).
- Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).
- Hirakata, Y., et al. Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).
- Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. Regulatory functions of 3’UTRs. Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).
- Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. Lengthening of 3’UTR increases with morphological complexity in animal evolution. Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).
- Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease. Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).
- Boncoeur, E., et al. Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).
- Ke, S. H., Madison, E. L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube ‘megaprimer’ PCR method. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).
- Gossen, M., Bujard, H., Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. . Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. , (2001).
- Migneault, F., et al. Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3′ Untranslated Region. Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).
- Migneault, F. . Modulation de la stabilité de l’ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3′ non traduites. , (2015).
- Grzesik, B. A., et al. Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).
- Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells. Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).
- Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide. Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).
- Hovel, H., Frieling, K. H. The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis. Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
