Effizientes transkriptionsgesteuertes Plasmidexpressionssystem zur Untersuchung der Stabilität von mRNA-Transkripten in primären Alveolar-Epithelzellen
Summary
Hier stellen wir ein Werkzeug vor, mit dem die posttranskriptionische Modulation eines Transkripts in primären Alveolarepithelzellen mithilfe eines induzierbaren Expressionssystems, das an eine Pipettenelektroporationstechnik gekoppelt ist, untersucht werden kann.
Abstract
Das Studium der posttranskriptionalen Regulation ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Modulation einer gegebenen Boten-RNA (mRNA) und ihrer Auswirkungen auf die Zellhomöostase und den Stoffwechsel. Tatsächlich könnten Schwankungen des Transkriptsausdrucks die Übersetzungseffizienz und letztlich die zelluläre Aktivität eines Transkripts verändern. Mehrere experimentelle Ansätze wurden entwickelt, um die Halbwertszeit von mRNA zu untersuchen, obwohl einige dieser Methoden Einschränkungen haben, die die ordnungsgemäße Untersuchung der posttranskriptiellen Modulation verhindern. Ein Promotor-Induktionssystem kann ein Gen von Interesse unter der Kontrolle eines synthetischen Tetracyclin-regulierten Promotors ausdrücken. Diese Methode ermöglicht die Halbwertszeitschätzung einer gegebenen mRNA unter jeder experimentellen Bedingung ohne störende Zellhomöostase. Ein großer Nachteil dieser Methode ist die Notwendigkeit, Zellen zu transfekten, was den Einsatz dieser Technik in isolierten Primärzellen einschränkt, die sehr resistent gegen herkömmliche Transfektionstechniken sind. Alveolare Epithelzellen in der Primärkultur wurden ausgiebig verwendet, um die Zell- und Molekularbiologie des Alveolar-Epithels zu untersuchen. Die einzigartigen Eigenschaften und der Phänotyp der primären Alveolarzellen machen es wichtig, die posttranskriptionalen Modulationen von Genen zu untersuchen, die für diese Zellen von Interesse sind. Daher war es unser Ziel, ein neuartiges Werkzeug zu entwickeln, um die posttranskriptionischen Modulationen von mRNAs von Interesse in alveolar epitheliaalen Zellen in der Primärkultur zu untersuchen. Wir haben ein schnelles und effizientes transientes Transfektionsprotokoll entwickelt, um ein transkriptionsgesteuertes Plasmidexpressionssystem in primäre Alveolar-Epithelzellen einzufügen. Diese Klonstrategie, die ein virales Epitop verwendet, um das Konstrukt zu markieren, ermöglicht die einfache Diskriminierung des Konstruktausdrucks von der von endogenen mRNAs. Mit der modifizierten Methode des Quantifizierungszyklus (Cq) kann die Expression des Transkripts dann in verschiedenen Zeitintervallen quantifiziert werden, um seine Halbwertszeit zu messen. Unsere Daten zeigen die Effizienz dieses neuartigen Ansatzes bei der Untersuchung der posttranskriptionalen Regulation unter verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen in primären Alveolarepithelzellen.
Introduction
Mehrere Techniken wurden entwickelt, um die Halbwertszeit von mRNAs zu bestimmen. Die Puls-Chase-Zerfallstechnik, die markierte mRNAs verwendet, ermöglicht die gleichzeitige Auswertung eines großen Pools von mRNAs mit minimaler zellulärer Störung. Dieser Ansatz erlaubt jedoch keine direkte Schätzung der Halbwertszeit eines einzelnen Gentranskripts und kann nicht implementiert werden, um die posttranskriptionelle Modulation einer mRNA nach Stimulation mit Wachstumsfaktoren, ROS, Alarminen oder Entzündungen zu untersuchen1.
Die Verwendung von Transkriptionsinhibitoren, wie Actinomycin D und Amanitin, ist eine relativ einfache Methode zur Messung der mRNA-Abbaukinetik im Laufe der Zeit. Ein Hauptvorteil dieses Ansatzes gegenüber früheren Techniken (d. h. Pulse-Chase) beruht auf der Fähigkeit, die Halbwertszeit eines bestimmten Transkripts direkt abzuschätzen und zu vergleichen, wie verschiedene Behandlungen seine Abbaukinetik beeinflussen könnten. Die signifikante schädliche Wirkung von Transkriptionsinhibitoren auf die Zellphysiologie stellt jedoch einen großen Nachteil des Ansatzes2dar. Tatsächlich hat die Hemmung des gesamten Zelltranskriptoms mit diesen Medikamenten die negative Nebenwirkung, die Synthese von Schlüsselelementen, die an der mRNA-Stabilität beteiligt sind, wie z. B. microRNAs (miRNAs), sowie die Expression und Synthese von RNA-bindenden Proteinen, die für den mRNA-Abbau und die Stabilität wichtig sind, zu stören. Die starke Störung der Gentranskription durch diese Medikamente könnte daher die Abbaukurven von Transkripten arteffakt verändern.
Das Promotor-Induktionssystem stellt einen dritten Ansatz zur Messung der Halbwertszeit einer bestimmten mRNA dar. Diese Methode misst den Abbau einer spezifischen mRNA in ähnlicher Weise wie Methoden, die Transkriptionsinhibitoren verwenden. Häufig kommen zwei Arten von Induktionssystemen zum Einsatz: der seruminduzierte c-fos-Promoter3 und das Tet-Off Induzierbare System4. Mit dem c-fos-System ist die Verwendung von Transkriptionsinhibitoren, die toxisch für die Zelle sein können, nicht erforderlich. Diese Methode erfordert jedoch eine Zellzyklussynchronisierung, die die Auswertung der tatsächlichen Stabilität eines Transkripts während der Interphase5verhindert. Im Gegensatz dazu ermöglicht das Tet-Off-System die starke Expression des Gens von Interesse (GOI) unter der Kontrolle eines synthetischen Tetracyclin-regulierten Promotors. Dieses System erfordert das Vorhandensein von zwei Elementen, die in die Zelle kotransfiziert werden müssen, um funktionsfähig zu sein. Das erste Plasmid (pTet-Off) drückt das regulatorische Protein tTA-Adv aus, einen hybriden synthetischen Transkriptionsfaktor, der aus dem prokaryotischen Repressor TetR (aus Escherichia coli) besteht, das zu drei Transkriptionstransaktivierungsdomänen aus dem viralen Protein HSV VP16 verschmolzen ist. Die GOI wird unter der Kontrolle eines synthetischen Promotors (PTight) in das pTRE-Tight-Plasmid geklont, das die minimale Sequenz des Cytomegalievirus-Promotors (CMV) umfasst, die zu sieben Wiederholungen der tetO-Operatorsequenz verschmolzen ist. Die Transkription des Gens flussabwärts von PTight ist abhängig von der Wechselwirkung von TetR mit tetO. In Gegenwart von Tetracyclin oder seinem Derivat Doxycyclin verliert der TetR-Repressor seine Affinität zum tetO-Operator, was zu einer Einstellung der Transkription4führt. Die Eigenschaften des Tet-Off-Systems machen es zu einem idealen Modell für die Untersuchung der spezifischen mRNA-Expression in eukaryotischen Zellen unter Vermeidung potenzieller pleiottroper Effekte, die sekundär zum Fehlen prokaryotischer regulatorischer Sequenzen in der eukaryotischen Zelle6sind. Normalerweise werden doppelt stabile Tet-Off-Zelllinien (HEK 293, HeLa und PC12) mit diesem System verwendet, um Kopien des Reglers und Reaktionsplasmide für einen bequemen Zugriff auf die kontrollierbare Genexpression7,8,9zu integrieren.
Mehrere Modelle von Alveolar-Epithelzellen in der Kultur wurden verwendet, um die Zell- und Molekularbiologie des Alveolarenepithels zu untersuchen. Seit Jahren nutzen Forscher ausgiebig menschliche oder Nagetier-Primärzellen10,11 sowie verewigte Zelllinien wie menschliche A549- oder Ratten-RLE-6TN-Zellen12,13. Obwohl sie im Allgemeinen weniger proliferativ und schwieriger zu kultur- und transfektionsmittel sind, bleiben Alveolare Epithelzellen in der Primärkultur der Goldstandard für die Untersuchung der Funktion und Dysfunktion des Alveolarers epithel unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Tatsächlich weisen verewigte Zelllinien wie A549-Zellen nicht die komplexen Eigenschaften und Phänotypen von Primärzellen auf, während alveolare Epithelzellen in der Primärkultur die Haupteigenschaften des Alveolarenepithels rekapitulieren, insbesondere die Fähigkeit, eine polarisierte und enge Barriere14,15zu bilden. Leider sind diese Zellen sehr resistent gegen herkömmliche Transfektionstechniken, wie diejenigen, die Liposomen verwenden, was den Einsatz eines Promotor-induzierten Systems wie Tet-Off sehr schwierig macht.
Die posttranskriptionelle Modulation von mRNAs ist eine der effektivsten Methoden zur schnellen Modulation der Genexpression eines Transkripts16. Die mRNA 3′ unübersetzte Region (3′ UTR) spielt in diesem Mechanismus eine wichtige Rolle. Es hat sich gezeigt, dass im Gegensatz zur 5′ UTR eine exponentielle Korrelation zwischen der Länge der 3′ UTR und den zellulären und morphologischen Komplexitäten eines Organismus besteht. Diese Korrelation legt nahe, dass die 3′ UTR, wie die mRNA-Codierungsregionen, einer natürlichen Selektion unterzogen wurde, um eine immer komplexere posttranskriptive Modulation während der gesamten Evolution17zu ermöglichen. Die 3′ UTR enthält mehrere Bindungsstellen für Proteine und miRNAs, die die Stabilität und Übersetzung des Transkripts beeinflussen.
In der vorliegenden Arbeit haben wir ein Werkzeug entwickelt, um die Rolle hochkonservierter Domänen in der 3′ UTR einer GOI zur Kontrolle der Transkriptstabilität zu untersuchen. Wir konzentrierten uns auf den epithelialen Natriumkanal, die Alpha-Untereinheit (ENaC), die eine Schlüsselrolle in der alveolar epithelialen Physiologie18spielt. Alveolare Epithelzellen in der Primärkultur wurden erfolgreich transfiziert mit den beiden Komponenten des Tet-Off-Systems transfiziert, was die Untersuchung der Rolle der 3′ UTR in der mRNA-Stabilität mit einem System ermöglicht, das die Zellphysiologie und den Stoffwechsel im Vergleich zur Verwendung von Transkriptionsinhibitoren mit anderen Protokollen minimal beeinflusst. Es wurde eine Klonstrategie entwickelt, um die Expression der goI von der des endogenen Gens unter Verwendung eines nicht endogen exprimierten Epitops (V5) zu unterscheiden. Die Reaktions- und regulatorischen Plasmide wurden dann mit hilfe einer Pipettenelektroporationstechnik in Alveolar-Epithelzellen übertragen. Anschließend wurde die Expression des Transkripts durch Inkubation der Zellen mit Doxycyclin in unterschiedlichen Zeitintervallen gemessen. Die Halbwertszeit des Transkripts wurde von RT-qPCR mit einer modifizierten Cq-Methode unter Verwendung des transfizierten tTA-Ad mRNA-Produkts zur Normalisierung bewertet. Durch unser Protokoll bieten wir eine bequeme Möglichkeit, die posttranskriptionelle Modulation eines Transkripts unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen und die Einbeziehung der nicht übersetzten Regionen genauer zu definieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die niedrige Transfektionsrate von Alveolarenepithelzellen in der Primärkultur war eine ernsthafte Einschränkung für die Verwendung des Tet-Off-Systems zur Beurteilung der mRNA-Stabilität in diesen Zellen. Diese Einschränkung wurde jedoch durch die Pipettenelektroporation überwunden, die eine Transfektionseffizienz von 25-30 % ermöglichte (Abbildung 1 und Abbildung 3)26.
Die Messung der Transkriptstabili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Francis Migneault wurde durch ein Stipendium des Quebec Respiratory Health Network und des Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Lungentrainingsprogramms, ein Studium der FRSQ und ein Studentenwerk der Faculté des études Supérieures et unterstützt. Postdoktoranden, Université de Montréal. Diese Arbeit wurde vom Gosselin-Lamarre-Lehrstuhl für klinische Forschung und den Canadian Institutes of Health Research [YBMOP-79544] unterstützt.
Materials
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | – | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol – Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
References
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