Croissance des couches cellulaires endothéliales coréennes humaines et brebis sur les membranes biomatériaux
Summary
Ce protocole décrit les étapes critiques nécessaires pour établir et cultiver les cultures endothéliales cornéennes de cellules des explants des tissus humains ou de mouton. Une méthode pour subculturing cellules endothéliales cornéennes sur les biomatériaux membranaires est également présentée.
Abstract
Les cultures épithéliales de cellules endothéliales cornéennes ont tendance à subir la transition épithéliale-à-mesenchymal (EMT) après perte du contact de cellule-à-cellule. EMT est délétère pour les cellules car il réduit leur capacité à former une couche mature et fonctionnelle. Ici, nous présentons une méthode pour établir et subculper les cultures endothéliales endotales cornées humaines et breturantes qui minimisent la perte de contact de cellule à cellule. Les explants de l’endothélium cornéen/de la membrane de Descemet sont prélevés sur des cornées donneuses et placés dans la culture tissulaire dans des conditions qui permettent aux cellules de migrer collectivement sur la surface de la culture. Une fois qu’une culture a été établie, les explantations sont transférées dans des assiettes fraîches pour initier de nouvelles cultures. Dispase II est utilisé pour soulever doucement des amas de cellules des plaques de culture tissulaire pour la subculturing. Les cultures de cellules endothéliales cornéennes qui ont été établies en utilisant ce protocole sont appropriées pour le transfert aux membranes de biomatériaux pour produire des couches cellulaires tissulaires pour la transplantation dans les essais sur les animaux. Un dispositif fait sur mesure pour soutenir des membranes de biomatériau pendant la culture de tissu est décrit et un exemple d’une greffe tissulaire-engineered composée d’une couche des cellules endothéliales cornéennes et d’une couche des cellules stromal cornéennes de chaque côté d’une membrane de type de collagène I est présentée.
Introduction
La cornée est un tissu transparent qui est situé à l’avant de l’œil. Il est composé de trois couches principales : une couche épithéliale sur la surface extérieure, une couche de stroma moyenne, et une couche intérieure appelée l’endothélium cornéen. L’endothélium cornéen est une monocouche de cellules qui se trouve sur une membrane de sous-sol appelée membrane de Descemet et il maintient la transparence de la cornée en régulant la quantité de liquide qui pénètre dans le stroma de l’humour aqueux sous-jacent. Trop de liquide dans le stroma provoque un gonflement cornéen, l’opacité et la perte de vision. L’endothélium est donc essentiel pour maintenir la vision.
L’endothélium cornéen peut devenir dysfonctionnel pour un certain nombre de raisons, y compris le vieillissement, la maladie et les blessures, et le seul traitement actuel est la chirurgie de transplantation. Pendant cette chirurgie, l’endothélium et la membrane de Descemet sont enlevés de la cornée du patient et remplacés par une greffe de l’endothélium et de la membrane de Descemet obtenues d’une cornée de distributeur. Beaucoup de greffes d’endothélium contiennent également une fine couche de tissu stromal pour faciliter la manipulation et l’attachement à la cornée hôte1.
Dans le monde entier, la demande de tissus de donneurs cornéens pour les chirurgies de transplantation est supérieure à la quantité qui peut être fournie par les banques oculaires2. Il y a donc eu une volonté de développer des greffes d’endothélium cornéen tissulaire qui pourraient être utilisées pour pallier ce manque à gagner3. La raison d’être de ceci est basée sur le fait qu’actuellement, l’endothélium d’une cornée individuelle ne peut être transféré à un seul patient, cependant, si les cellules endothéliales cornéennes ont été d’abord étendues et cultivées sur des échafaudages de biomatériaux dans la culture de tissu, elles pourraient être employées pour traiter plusieurs patients.
Les principaux défis qui doivent être relevés avant que les greffes d’endothélium cornéen tissulal deviennent une option réalisable pour les chirurgiens comprennent: (1) l’établissement de techniques pour l’expansion des cellules endothéliales cornéennes de haute qualité et pour la production de maturité et couches endothéliales endothéliales cornées fonctionnelles in vitro, et (2) établissant des techniques pour cultiver les cellules sur des échafaudages de biomatériaux pour produire des greffes tissulaires qui sont égales, ou meilleures que, les greffes cornées de donneur qui sont actuellement employées.
Les cellules endothéliales cornéennes ont un très faible potentiel de prolifération in vivo, mais peuvent être stimulées pour diviser in vitro4. Néanmoins, ils ont une forte tendance à subir une transition épithéliale-mésenchymale in vitro (EMT), ce qui réduit leur capacité à former une couche endothéliale fonctionnelle et mature. Les déclencheurs connus de l’EMT dans les cellules endothéliales cornéennes comprennent l’exposition à certains facteurs de croissance et la perte de contact cellule-cellule5. Il est donc presque inévitable que les cultures endothéliales endothéliales cornéennes qui sont enzymatiquement dissociées pendant la sous-culture subiront des changements associés à l’EMT. Ici, nous présentons une méthode de culture cellulaire pour les cellules endothéliales cornéennes humaines ou brebis qui est conçue pour minimiser la perturbation des contacts de cellule à cellule pendant les étapes d’isolement, d’expansion et de sous-culture, afin de réduire le potentiel d’EMT. En outre, nous démontrons comment les greffes tissulaires qui ressemblent à l’endothélium/greffes de tissu stromal de la cornée dérivée de la cornée de donneur peuvent être produites en cultivant des couches de cellules cultivées des deux côtés d’une membrane de biomatériau dans un dispositif de montage fait sur mesure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un défi technique important lié à l’établissement et à l’expansion des cellules endothéliales cornéennes humaines empêche l’EMT de se produire dans les cultures. L’EMT peut être déclenchée dans les cellules endothéliales cornéennes par la perte du contact cellule-cellule, pourtant la plupart des protocoles de culture cellulaire pour ces cellules impliquent la dissociation enzymatique aux cellules simples pendant l’isolement et la sous-culture10. Ici nous présentons un proto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Merci à Noémie Gallorini pour son aide lors de la préparation de la Figure 7. Ces travaux ont été soutenus par une subvention de projet accordée à La DH par le National Health and Medical Research Council of Australia (Project Grant 1099922), et par un financement supplémentaire reçu de la Queensland Eye Institute Foundation.
Materials
| Attachment factor | Gibco | S006100 | A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C. |
| Bovine pituitary extract | Gibco | 13028014 | A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots. |
| Calcium chloride | Merck | C5670 | Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Centrifuge tube, 50 ml | Labtek | 650.550.050 | |
| Chondroitin sulphate | LKT Laboratories | C2960 | This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Ethanol | Labtek | EA043 | 100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces. |
| Foetal bovine serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.03 | This is a HyClone brand of foetal bovine serum. |
| Coverglass No. 1, Ø 13 mm | Proscitech | G401-13 | Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture. |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride. |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Merck | A8960 | Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Micro-Boyden chamber | CNC Components Pty. Ltd. | Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007 | Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE). |
| O-ring for micro-Boyden chamber | Ludowici Sealing Solutions | RSB012 | Composed of silicon rubber. |
| Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1 | Gibco | 51985-034 | A reduced serum medium containing glutamine. |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride. |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin. |
| Petri dish | Sarstedt | 82.14473.001 | Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections. |
| Tissue culture plate, 24 well | Corning Incorporated | Costar 3524 | A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2. |
| Tissue culture plate, 6 well | Corning Incorporated | Costar 3516 | A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2. |
| TrypLE Select | Gibco | 12563-011 | A 1X enzyme solution for dissociating cells. |
| Versene | Gibco | 15040-066 | A 1X EDTA solution for dissociating cells. |
| Watchmaker forceps | Labtek | BWMF4 | Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas. |
References
- Güell, J. L., El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases. Ophthalmology and Therapy. 3, 1-15 (2014).
- Tan, D. T. H., Dart, J. K. G., Holland, E. J., Kinoshita, S. Corneal transplantation. The Lancet. 379 (9827), 1749-1761 (2012).
- Soh, Y. Q., Peh, G. S. L., Mehta, J. S. Translational issues for human corneal endothelial tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regnerative Medicine. 11 (9), 2425-2442 (2017).
- Senoo, T., Joyce, N. C. Cell Cycle Kinetics in Corneal Endothelium from Old and Young Donors. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 41 (3), 660-667 (2000).
- Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Thériault, M., Proulx, S. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 56, 1228-1237 (2015).
- Harkin, D. G., et al. Mounting of Biomaterials for Use in Ophthalmic Cell Therapies. Cell Transplantation. 26 (11), 1717-1732 (2017).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).
- Walshe, J., Harkin, D. G. Serial explant culture provides novel insights into the potential location and phenotype of corneal endothelial progenitor cells. Experimental Eye Research. 127, 9-13 (2014).
- Al Abdulsalam, N. K., Barnett, N. L., Harkin, D. G., Walshe, J. Cultivation of corneal endothelial cells from sheep. Experimental Eye Research. 173, 24-31 (2018).
- Parekh, M., Ferrari, S., Sheridan, C., Kaye, S., Ahmad, S. Concise Review: An Update on the Culture of Human Corneal Endothelial Cells for Transplantation. Stem Cells Translational Medicine. 5 (2), 258-264 (2016).
- Peh, G. S., Toh, K. P., Wu, F. Y., Tan, D. T., Mehta, J. S. Cultivation of human corneal endothelial cells isolated from paired donor corneas. PLoS One. 6 (12), 28310 (2011).
