생체 재료 멤브레인에 인간과 양 각막 내피 세포 층의 성장
Summary
이 프로토콜은 인간 또는 양 조직의 이식에서 각막 내피 세포 배양을 확립하고 성장하는 데 필요한 중요한 단계를 설명합니다. 각막 내피 세포를 membranous 생체 재료에 소양성하는 방법도 제시된다.
Abstract
각막 내피 세포 배양세포는 세포 대 세포 접촉의 손실 후에 상피-중간엽 전이 (EMT)를 겪는 경향이 있습니다. EMT는 성숙하고 기능적인 층을 형성하는 그들의 기능을 감소시키기 때문에 세포에 대한 해로운 입니다. 여기서, 우리는 세포 대 세포 접촉의 손실을 최소화하는 인간과 양 각막 내피 세포 배양을 확립하고 subculcul하는 방법을 제시한다. 각막 내피 /Descemet의 막의 이식은 기증자 각막에서 취하고 세포가 집합적으로 배양 표면에 이동하는 것을 허용하는 조건하에서 조직 배양으로 두는. 문화가 확립되면, 이식은 새로운 문화를 시작하기 위해 신선한 접시로 전송됩니다. Dispase II는 부드럽게 세포의 덩어리를 들어 올리는 데 사용 됩니다 조직 배양 플레이트 에서 subculcul. 이 프로토콜을 사용하여 확립된 각막 내피 세포 배양은 동물 실험에서 이식을 위한 조직 공학세포 층을 생산하기 위하여 생체 재료 막으로 전송하기에 적당하다. 조직 배양 시 생체재료 막을 지지하기 위한 맞춤형 장치가 설명되고, 콜라겐 타입 I 막의 양쪽에 각막 내피 세포층과 각막 기질 세포의 층으로 구성된 조직 공학 이식편의 예가 제시된다.
Introduction
각막은 눈의 앞에 있는 투명한 조직입니다. 그것은 3개의 중요한 층으로 구성됩니다: 외부 표면에 상피 층, 중간 기질 층 및 각막 내피에게 불린 내부 층. 각막 내피는 Descemet의 막에게 불린 지하 막에 앉는 세포의 단층이고 근본적인 수성 유머에서 기질로 들어가는 액체의 양을 통제해서 각막의 투명성을 유지합니다. 기질 내의 너무 많은 액체는 각막 팽윤, 불투명도 및 비전 손실을 일으키는 원인이 됩니다. 내피는 그러므로 비전을 유지하기 위해 생명입니다.
각막 내피는 노화, 질병 및 상해를 포함하여 여러 가지 이유로 기능 장애가 될 수 있으며 현재 유일한 치료법은 이식 수술입니다. 이 수술 동안, 내피와 Descemet의 막은 환자의 각막에서 제거하고 기증자 각막에서 얻은 내피와 Descemet의 막의 접목으로 대체됩니다. 많은 내피 이식편은 또한 숙주 각막에 취급 그리고 부착을 돕기 위하여 기질 조직의 얇은 층을포함합니다 1.
전 세계적으로, 이식 수술을 위한 각막 기증자 조직에 대한 수요는 안구 은행에 의해 공급될 수 있는 양보다 더 큽하다2. 그러므로 이 부족을 완화하기 위하여 이용될 수 있던 조직 공학한 각막 내피 이식을 개발하기 위하여 드라이브가 있었습니다3. 이것에 대한 근거는 현재, 개별 각막에서 내피는 단 하나 환자에게만 전달될 수 있다는 사실에 근거를 두었습니다, 그러나, 각막 내피 세포가 조직 배양에 있는 생체 물자 비계에 첫째로 확장되고 성장한 경우에, 그(것)들은 다중 환자를 취급하기 위하여 이용될 수 있었습니다.
조직 공학각막 내피 이식이 외과 의사를 위한 실행 가능한 선택권이 되기 전에 해결될 필요가 있는 중요한 도전은 다음을 포함합니다: (1) 고품질의 각막 내피 세포를 확장하고 성숙한 및 생산을 위한 기술을 확립하십시오 기능성 각막 내피 세포층은 시험관내, (2) 현재 사용되고 있는 공여체 각막 유래 이식편과 동등하거나 더 나은 조직 공학 적 이식편을 생산하기 위해 생체 재료 스캐폴드상에서 세포를 성장시키는 기술을 확립한다.
각막 내피 세포는 생체 내에서 매우 낮은 증식 잠재력을 가지고 있지만시험관내 4에서 분할자극 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 그(것)들은 성숙한, 기능적인 내피 층을 형성하는 그들의 수용량을 감소시키는 시험관 상피-중간엽 전이를 겪는 강한 경향이 있습니다. 각막 내피 세포에 있는 EMT를 위한 알려진 트리거는 특정 성장 인자에 노출 및 세포 대 세포 접촉의 손실을포함합니다 5. 따라서 하위 배양 중에 효소적으로 해리되는 각막 내피 세포 배양이 EMT와 관련된 변화를 겪을 것이라는 것은 거의 피할 수 없습니다. 여기서, 우리는 EMT에 대한 잠재력을 감소시키기 위해 격리, 확장 및 하위 배양 단계 동안 세포 대 세포 접촉의 중단을 최소화하도록 설계된 인간 또는 양 각막 내피 세포에 대한 세포 배양 방법을 제시한다. 또한, 우리는 기증자 각막 유래 내피/Descemet의 막/기질 조직 이식과 유사한 조직 공학 접목이 맞춤형 장착 장치에서 생체 재료 막의 양쪽에 배양된 세포층을 성장시킴으로써 어떻게 생성될 수 있는지 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간 각막 내피 세포를 설치하고 확장하는 것과 관련된 중요한 기술적 도전은 EMT가 배양에서 발생하는 것을 방지하고 있습니다. EMT는 세포 대 세포 접촉의 손실에 의해 각막 내피 세포에서 트리거될 수 있고, 그러나 이 세포를 위한 대부분의 세포 배양 프로토콜은 격리 및 subcultureculture 동안 단 하나 세포에 효소 해리를 관련시킵니다10. 여기에서 우리는 격리와 하위 배양 단계 도…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
그림 7을준비하는 동안 그녀의 도움을 노에미 갈로리니 에게 감사드립니다. 이 작품은 호주의 국립 건강 및 의학 연구위원회 (프로젝트 보조금 1099922)에 의해 DH에 수여 된 프로젝트 보조금에 의해 지원되었다, 퀸즐랜드 안과 연구소 재단에서받은 보충 기금에 의해.
Materials
| Attachment factor | Gibco | S006100 | A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C. |
| Bovine pituitary extract | Gibco | 13028014 | A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots. |
| Calcium chloride | Merck | C5670 | Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Centrifuge tube, 50 ml | Labtek | 650.550.050 | |
| Chondroitin sulphate | LKT Laboratories | C2960 | This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Ethanol | Labtek | EA043 | 100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces. |
| Foetal bovine serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.03 | This is a HyClone brand of foetal bovine serum. |
| Coverglass No. 1, Ø 13 mm | Proscitech | G401-13 | Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture. |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride. |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Merck | A8960 | Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Micro-Boyden chamber | CNC Components Pty. Ltd. | Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007 | Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE). |
| O-ring for micro-Boyden chamber | Ludowici Sealing Solutions | RSB012 | Composed of silicon rubber. |
| Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1 | Gibco | 51985-034 | A reduced serum medium containing glutamine. |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride. |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin. |
| Petri dish | Sarstedt | 82.14473.001 | Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections. |
| Tissue culture plate, 24 well | Corning Incorporated | Costar 3524 | A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2. |
| Tissue culture plate, 6 well | Corning Incorporated | Costar 3516 | A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2. |
| TrypLE Select | Gibco | 12563-011 | A 1X enzyme solution for dissociating cells. |
| Versene | Gibco | 15040-066 | A 1X EDTA solution for dissociating cells. |
| Watchmaker forceps | Labtek | BWMF4 | Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas. |
References
- Güell, J. L., El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases. Ophthalmology and Therapy. 3, 1-15 (2014).
- Tan, D. T. H., Dart, J. K. G., Holland, E. J., Kinoshita, S. Corneal transplantation. The Lancet. 379 (9827), 1749-1761 (2012).
- Soh, Y. Q., Peh, G. S. L., Mehta, J. S. Translational issues for human corneal endothelial tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regnerative Medicine. 11 (9), 2425-2442 (2017).
- Senoo, T., Joyce, N. C. Cell Cycle Kinetics in Corneal Endothelium from Old and Young Donors. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 41 (3), 660-667 (2000).
- Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Thériault, M., Proulx, S. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 56, 1228-1237 (2015).
- Harkin, D. G., et al. Mounting of Biomaterials for Use in Ophthalmic Cell Therapies. Cell Transplantation. 26 (11), 1717-1732 (2017).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).
- Walshe, J., Harkin, D. G. Serial explant culture provides novel insights into the potential location and phenotype of corneal endothelial progenitor cells. Experimental Eye Research. 127, 9-13 (2014).
- Al Abdulsalam, N. K., Barnett, N. L., Harkin, D. G., Walshe, J. Cultivation of corneal endothelial cells from sheep. Experimental Eye Research. 173, 24-31 (2018).
- Parekh, M., Ferrari, S., Sheridan, C., Kaye, S., Ahmad, S. Concise Review: An Update on the Culture of Human Corneal Endothelial Cells for Transplantation. Stem Cells Translational Medicine. 5 (2), 258-264 (2016).
- Peh, G. S., Toh, K. P., Wu, F. Y., Tan, D. T., Mehta, J. S. Cultivation of human corneal endothelial cells isolated from paired donor corneas. PLoS One. 6 (12), 28310 (2011).
