Summary
Denne arbeidsflyten beskriver ytelsen til tids- og kostnadseffektiv berikelse av flere proteinpost-translational modifikasjoner (PTMs) samtidig for kvantitativ global proteomisk analyse. Protokollen benytter ptm berikelse på peptidnivå med flere konjugerte antistoffer, etterfulgt av datauavhengig oppkjøpsmassespektrometrianalyse for å få biologisk innsikt i PTM crosstalk.
Abstract
Å studere flere post-translational modifikasjoner (PTMs) av proteiner er et avgjørende skritt for å forstå PTM crosstalk og få mer helhetlig innsikt i proteinfunksjon. Til tross for viktigheten av multi-PTM berikelse studier, få studier undersøke mer enn én PTM om gangen, delvis på grunn av utgifter, tid, og store proteinmengder som kreves for å utføre flere globale proteomiske analyse av PTMs. Den "one-pot" affinitet berikelse beskrevet i denne protokollen overvinner disse barrierene ved å tillate samtidig identifisering og kvantifisering av peptider med lysin rester som inneholder acetylering og kortfattet PTMs med lave mengder prøve Input. Protokollen innebærer utarbeidelse av proteinlysate fra muselever av SIRT5 knockout mus, ytelse av trypsin fordøyelse, berikelse for PTMs, og ytelse av masse spektrometrisk analyse ved hjelp av en data-uavhengig oppkjøp (DIA) arbeidsflyt. Fordi denne arbeidsflyten gjør det mulig å berike to PTMer fra samme prøve samtidig, gir den et praktisk verktøy for å studere PTM crosstalk uten å kreve store mengder prøver, og det reduserer i stor grad tiden som kreves for prøveforberedelse, data oppkjøp, og analyse. DIA-komponenten i arbeidsflyten inneholder omfattende PTM-spesifikk informasjon. Dette er spesielt viktig når du studerer PTM-lokalisering, da DIA gir omfattende sett med fragmentioner som kan deputeres for å skille mellom ulike PTM lokalisering isoformer.
Introduction
En myriade av post-translational modifikasjoner dynamisk regulere proteiner og veier gjennom effekter på aktiviteten1, signaliserer2,og omsetning3,4. For eksempel aktiveres proteinkinaser eller deaktiveres ved tilsetning av fosfatgrupper5,og histoneacetylasjon og andre modifikasjoner gir en mekanisme for å endre kromatinstrukturen og tjene som transkripsjonelle regulatoriske mekanismer6,7. I de senere årene har bevis montert at flere PTMs fungerer i konsert eller konkurrere om å regulere proteinfunksjon eller aktivitet8,9,10,11. Derfor er forståelse av PTM crosstalk et voksende behov i PTM forskning. De fleste tilgjengelige proteomiske arbeidsflyter for å identifisere og kvantifisere PTM-områder fokuserer imidlertid på enkeltendringer, i stedet for samspillet mellom flere endringer. Den beskrevne arbeidsflyten korrelerer spesifikk proteinmodifisering "hot-spots" og lysin rester som er endret av flere forskjellige PTMs.
Det er et økende behov i det vitenskapelige samfunnet for mulige metoder for å studere flere PTMer samtidig12. De fleste metoder for å globalt identifisere og kvantifisere nettstedene til flere typer PTMer er utfordrende på grunn av de høye kostnadene og mengden vev som kreves12,13. Ikke bare er multi-PTM berikelse eksperimenter tidkrevende i form av prøveforberedelse, datainnsamling, og dataanalyse, men disse studiene krever vanligvis store og ofte uoverkommelige mengder protein11. Beskrevet her er en protokoll for samtidig berikelse og analyse av flere PTMer, som også adresserer flere av disse barrierene og muliggjør storskala PTM profilering og vurdering av kryssbehandling mellom ulike PTMs14. Denne en-pot arbeidsflyten skisserer en praktisk måte for biomedisinske forskere å globalt profilere flere PTMer, identifisere komodifiserte peptider, og studere PTM crosstalk på en effektiv måte14,15.
Her vises denne metoden ved å undersøke mitokondrieproteinacylasjon, som først ble studert for over 50 år siden16. Det konsentrerer seg spesifikt om lysin acetylation17 og succinylation18, inkludert samtidig forekomst av disse modifikasjoner på proteiner og til og med samtidig modifisering på peptidnivå. Siden studien bruker en sirtuin 5 (SIRT5) knockout musemodell, ble det valgt å fokusere på berikelse av acetylering og kortfattede nettsteder. Denne beslutningen ble gjort fordi kortfattede nettsteder er mål for SIRT5 desuccinylase og forventes dermed å vise betydelig upregulation i KO mus, noe som gjør dem til de mest relevante PTMs i dette tilfellet. Begge PTM er biologisk relevante som nylig oppsummert av Carrico et al.19. Generelt viser acetylering viktige effekter på genuttrykk og metabolisme, og kortfattet er rapportert å regulere hjertemetabolismen og funksjon20.
Den beskrevne protokollen kan utføres med en lav mengde proteininndatamateriale (f.eks. 1 mg proteinlysat) og reduserer den totale varigheten av forsøket ved å redusere tiden som brukes til prøvebehandling, MS-innhenting og dataanalyse. En arbeidsflytskjematisk er angitt i figur 1. Vi har også brukt enda lavere mengder startmateriale (ned til 100 μg proteinlysat, skalering ned mengdene perler som brukes tilsvarende), noe som som forventet reduserer den totale avkastningen av identifiserte asiret peptider; Det gir imidlertid fortsatt svært verdifulle resultater og kvantifiserbare asiret peptider.
Mens såkalte ovenfra og ned-arbeidsflyter vanligvis ikke bruker proteolytiske fordøyelsestilnærminger (og dermed opprettholder tilkoblingen til flere PTMer i ett protein), fokuserer denne protokollen på en peptidbasert affinitetsberikelsestilnærming for å få ekstra dybde og følsomhet for PTM-identifikasjon og kvantifisering(figur 1). I tillegg benytter denne peptid-sentriske arbeidsflyten moderne massespektrometrimetoder, inkludert 1) en kombinasjon av dataavhengig oppkjøp (DDA) for å generere spektrale biblioteker, og 2) datauavhengig oppkjøp (DIA) for nøyaktig PTM-kvantifisering i en etikettfri arbeidsflyt.
DIA arbeidsflyter overvinne prøvetaking stochasticity av typiske DDA scan ordninger ved omfattende fragmentering alle peptid signaler innenfor samplet m / z rekkevidde21. Denne funksjonen er også svært gunstig når det gjelder lokalisering av nettstedet, fordi det er lettere å få informasjon om hvilke spesifikke fragmentioner som endres i peptidet. I tillegg tillater DIA-arbeidsflyter identifikasjon og kvantifisering av mindre PTM-peptidisoformer med identiske forløperioner. DIA-metoder kan også bestemme en bestemt LOKALLOKALISERING av PTM-området i et peptid basert på spesifikke tilsvarende fragmentioner som er grundig målt til enhver tid. DDA tilnærminger bruker imidlertid ofte "dynamisk ekskludering" funksjoner som utelukker flere prøvetaking av MS / MS for samme forløper ion, og dermed mangler mindre PTM isoformer.
Den samtidige berikelsesstrategien som er beskrevet her, er ideelt egnet for studier som vil dra nytte av den globale profileringen og kvantifiseringen av flere PTMer, undersøke PTM-krysssnakk og forstå de dynamiske interaksjonene til post-translasjonelle modifikasjoner. Identifisering av flere berikede PTMer i en kombinert arbeidsflyt er beskrevet av: global, seriell eller parallell berikelse av PTM som inneholder proteolytiske peptider, eller alternativt ved analyse av intakte proteiner. I direkte sammenligning med serieberikelse av acetylering og succinylation, ble effektiviteten av en-pot metodikk etablert som svært lik14. Disse alternative protokollene krever betydelige mengder startmateriale og tid og kan være uoverkommelig dyrt. I motsetning gir en-pot-protokollen en billig og effektiv metode for berikelse av mer enn én PTM med påfølgende analyse og identifikasjon.
Mus levervev er hentet fra SIRT5 knockout mus og brukes her som startmateriale. Denne protokollen kan også utføres for proteinlysates fra forskjellige vev eller cellekultur eksperimenter. Denne protokollen kan brukes på proteinlysates hentet fra vev eller cellekulturpellets.
Protocol
Alle eksperimenter som er beskrevet i protokollen, følger retningslinjene til Buck Institute Institutional Animal Research Committee.
1. Ekstraksjon av protein fra homogenisert vev og fordøyelse med protease
- Klargjør ny lysisbufferen til en endelig konsentrasjon på 8 M urea, 50 mM triethylammonium bikarbonat (TEAB), 1 μM trichostatin A (TSA), 20 mM nikotinamid, 75 mM natriumklorid (NaCl), 1x protease/fosfatasehemmercocktail (PIC) med HPLC-grade vann.
- Tilsett en steril stålperle til et 2 ml rør kompatibelmed en perlemølle homogenisator, og plasser vevstykket (ertstørrelse) inn i røret. Tilsett lysisbuffer (500 μL) og vortex kort for å sikre at bufferen dekker vevsstykket (tilsett mer lysebuffer om nødvendig). Plasser rørene på forhåndskjølte adaptersett, noe som sikrer at rørene er balansert mellom homogenisatorens to adaptere.
- Homogenisere prøver 2x ved 25 Hz i 3 min hver ved 4 °C. Hvis vevet ikke er fullstendig homogenisert, snurrrørene kort og overfører det homogeniserte lysatet til et nymerket 1,5 ml rør. Deretter legger du til ekstra lysisbuffer til det gjenværende vevstykket, og gjenta homogeniseringen 2x ved 25 Hz i 3 min hver. To runder med homogenisering er vanligvis tilstrekkelig til å bryte opp vevet.
- Fjern metallperlen med pinsett. Mellom hver prøve skyller du pinsettmed hplc-vann, Metanol i HPLC-klasse og HPLC-vann igjen.
- Kombiner de homogeniserte lysates hvis to runder med homogenisering ble brukt og soniker prøver med en ultrasonicator for 10 sykluser på 30 s på / 30 s av og 4 ° C på høy effekt.
- Sentrifuge de homogeniserte lysates ved 14.000 x g i 10 min ved 4 °C for å fjerne lysate. Overfør supernatanten (ryddet lysat) til et nytt 1,5 ml mikrocentrifugerør, og unngå fettlag som kan sitte på toppen av supernatanten og eventuelle rusk nederst i røret.
- Utfør en bicinchoninic acid (BCA) analyse for å måle proteinkonsentrasjonen av den ryddet lysate med en riktig fortynning (for eksempel 1:20 og / eller 1:200). Ifølge BCA resultater, aliquot 1 mg protein fra hver prøve.
- Reduser proteiner i 4,5 mM dithiothreitol (DTT) ved 37 °C i 30 min med agitasjon ved 1400 o/min. Deretter alkylate proteiner i 10 mM iodoacetamid (IAA) med inkubasjon i mørket (plasser i skuff eller skap) ved romtemperatur (RT) i 30 min.
MERK: Alternative reagenser kan brukes, for eksempel N-etylmaleimid (NEM) i stedet for IAA. - Tilsett 50 mM TEAB i prøvene for å fortynne urinkonsentrasjonen til under 2 M. Spot 1 μL av prøven på et pH-papir for å sikre at pH-en til den fortynnede prøven er mellom 7,0-8,5. Tilsett trypsin til hver prøve med et forhold på 1:50 (trypsin-til-protein, wt/wt) og fordøye proteinet med agitasjon ved 37 °C over natten (ca. 14-16 h).
- Slukke fordøyer med 10% maursyre for å nå 1% maursyre neste dag. Vortex og spinn kort. Spot 1 μL av prøven på pH strimler for å sikre at fordøyd er pH = 2-3. Sentrifugeprøver på 1800 x g i 15 min ved RT for å pellet noe uoppløselig materiale.
2. Desalting av ikke-beriket proteolytiske peptider via storskala solidfaseekstraksjon
- Få patroner som inneholder C18 harpiks som kan binde opptil 10 mg protein. Monter disse patronene i et vakuumapparat for å bruke vakuumsuging som kan trekke væsken gjennom sylinderampullen under hvert av de følgende trinnene. Angi én sylinderampulle for hver peptidprøve.
- Tilsett 800 μL 80 % acetonitrile (ACN) i 0,2 % maursyre til sylinderampuller med 19,8 % vann og bruk vakuumsuging til å trekke væsken gjennom. Gjenta dette trinnet 1x, unngå tørking av patronene helt.
- Equilibrate patroner ved å legge 800 μL på 0,2% maursyre i vann med vakuumsuging for å trekke hele volumet gjennom filteret. Gjenta denne 2x. Legg peptider på patronene med vakuumsuging. Vask peptider 2x med 800 μL 0,2% maursyre i vann under vakuumsuging.
- Ordne 1,5 ml mikrocentrifugerør under hver sylinderampulle for å samle peptideluting i siste trinn. Under vakuumsugende elute peptider fra patroner, først med 800 μL på 80% ACN i 0,2% maursyre og 19,8% vann, deretter med 400 μL av samme løsning. Tørk de saltede peptidprøvene helt i en vakuumkonsentrator (2-3 h).
3. Samtidig berikelse av K-acetylated og K-succinylated peptider med immunoaffinaffinaffinperler
- Resuspender tørkede peptider i 1,4 ml kald 1x immunaffinitetrensing (IAP) buffer. Vortex å blande og sikre en pH på ~ 7. Sentrifugeprøver ved 10.000 x g i 10 min ved 4 °C. En liten pellet kan vises.
- Sett peptider til side på is mens du forbereder antistoffperler. Til et rør med K-acetyl og rør av K-succinyl antistoff perle slurry (volum: 100 μL slurry per rør), tilsett 1 ml kald 1x fosfatbufret saltvann (PBS) og bland ved pipettering. Overfør hele løsningen til et nytt 1,5 ml rør og spinn i en miniatyr sentrifuge for 30 s på RT.
- Aspirer PBS, pass på å unngå å aspirere av noen perler. Gjenta vasken 3x ved å vaske igjen med 1 ml kald 1x PBS, sentrifuging i 30 s ved RT og aspirating av PBS.
- Re-suspendere perlene i ca 440 μL av PBS. En fjerdedel av antall perler i hvert PTM-rør (100 μL, levert av produsenten) brukes til en-pot berikelse (rundt 62,5 μg av hvert immobilisert antistoff for både K-acetyl og K-succinyl antistoffperler). Pipette perlene flere ganger for å blande godt. Fjern 100 μL acetyllysin antistoffperler og overfør til ett rør med 200 μL forhåndssnittsspisser, noe som sikrer at mesterblandingen forblir konsekvent godt blandet.
- Gjør det samme med de succinyl-lysin antistoffperlene ved å fjerne 100 μL succinyl-lysin antistoffperler til røret for å nå like deler av acetyllysinantistoffet og succinyl-lysin antistoff i hvert rør. Spinn ned i 30 s i en miniatyr sentrifuge og aspirere av media med gel loader tips (perler vil bli hvite).
MERK: Hvert rør skal ha en lignende perlepellet nederst. - Pipette resuspendert peptid direkte på de vasket perlene. Vær forsiktig så du unngår pellets (legg raskt for å unngå å tørke ut perlene). Inkuber peptidene med perler ved 4 °C over natten med agitasjon.
4. Elution av peptider bundet til antistoff perler
- Spinn peptidprøvene ved 2000 x g i 30 s ved 4 °C. Fjern supernatanten som inneholder ubundne peptider og spar for fremtidige eksperimenter hvis ønskelig. Tilsett 1 ml kald 1x IAP-buffer til perlene for å vaske og blande ved å invertere 5x. Spin ved 2000 x g i 30 s ved 4 °C. Apirer av IAP-løsningen og gjenta IAP-vasketrinn 1x for totalt to vasker.
- Tilsett 1 ml kaldt HPLC-vann til perlene og bland ved å invertere 5x. Spin ved 2000 x g i 30 s ved 4 °C. Aspirere av vannet. Gjenta vannvasktrinnet to ganger for totalt tre vask. Spinn en ekstra tid ved 2000 x g i 30 s ved 4 °C for å samle inn gjenværende vann i bunnen av røret. Aspirer av ekstra vann som kan ha samlet med flat-tipped gel lasting tips. Vær forsiktig så du unngår å aspirere perlene.
- Tilsett 55 μL 0,15% trifluoreddiksyre i vann til perlene. Inkuber perlene i 10 min på RT mens du av og til trykker på bunnen av røret for å blande. Spinn perlene på RT i 30 s i en miniatyr sentrifuge. Fjern de eluted peptider og sett til side ved hjelp av en flat-tipped gel-lasting tips.
- Tilsett 45 μL 0,15% trifluoreddiksyre i vann til perlene. Inkuber i 10 min på RT mens du trykker på bunnen av røret av og til for å blande. Spinn perlene på RT i 30 s i en miniatyr sentrifuge. Fjern den andre elution en flat-tipped gel-lasting tips og kombinere med den første elution.
- Spinn de kombinerte eluted peptider på 12,000 x g i 5 min på RT å pellet noen perler som bærer over. Overfør peptiderprøveløsningen til et nytt 500 μL-rør.
MERK: Protokollen kan settes på pause her.
5. Desalting av berikede peptider
MERK: PH av prøver bør være mindre enn 4 for optimal binding til spissen som inneholder C18 harpiks. Bruk en 10 μL pipettespiss som inneholder 0,6 μL C18 harpiks og en 10 μL pipette for å kontrollere spissen.
- Forhåndsfukt C18-spissen ved å pipettere 10 μL acetonitrile inn i spissen. Dispenser acetonitrile i avfall. Gjenta dette trinnet to ganger til.
- Equilibrate spissen ved å vaske 3x med 10 μL på 0,2% maursyre i vann. Dispenser oppløsningen i avfall etter hver likevekt.
- Legg peptider fra prøven på spissen ved å kontinuerlig pipettere og dispensere beriket peptidprøve med spissen. Pipette opp og ned gjentatte ganger minst 20x og dispenser gjenværende oppløsning fra spissen.
- Vask spissen som inneholder bundet peptid med 10 μL 0,2 % maursyre i vann. Dispenser oppløsning en avfall. Gjenta dette trinnet 9x.
- Elute peptider i et nytt rør ved hjelp av 10 μL av en elutionbuffer som inneholder 0,2% maursyre, 50% acetonitrile og 49,8% vann. Pipette og dispenser 10 μL oppløsning i det nye røret 15x gjentatte ganger. Gjenta dette trinnet med ytterligere 10 μL elutionbuffer, gjentatte ganger pipettering i samme rør som forrige elution.
- Tørre peptider helt i vakuumkonsentrator (ca. 20 min). Resuspender de tørkede peptidene i riktig volum på 0,2% maursyre i vann.
MERK: Protokollen kan settes på pause her.
6. Datainnsamling ved hjelp av DDA og DIA
MERK: Analyser prøvene med Metodene DDA og DIA LC-MS/MS, som kan justeres avhengig av det tilgjengelige massespektrometriske instrumentet. Her ble prøvene analysert ved hjelp av et nano-LC 2D HPLC-system kombinert med et høyoppløselig massespektrometer.
- Bruk et HPLC-system kombinert med et chip-basert plattform HPLC-system som er direkte koblet til et massespektrometer (mange LC-MS-konfigurasjoner og -systemer kan også brukes).
- Analyse av prøver ved hjelp av omvendt fase HPLC-ESI-MS/MS
- Etter injeksjon, overfør peptidblandingene til en C18 pre-kolonne chip og desalt peptidene ved å vaske med mobil fase A på 2 μL / min i 10 min. Deretter overfører du peptidene til en analytisk kolonne og elute med en strømningshastighet på 300 nL/min med en 2-3 h gradient ved hjelp av mobile faser A og B. Spesielt, bruk en lineær gradient fra 5% mobil fase B til 35% mobil fase B over 80 min.
- Deretter ramper den mobile fasen B til 80% over 5 min, og deretter holde på 80% B i 8 min før du returnerer til 5% B for en 25 min re-quilibration.
- Bygg en MS-instrumentmetode for DDA og definer følgende instrumentskanningseksperimenter
- Eksperiment 1: MS1 forløper ion skanning fra m / z 400-1500 (akkumulering tid på 250 ms). Angi intensitetsterskelen for å utløse MS/MS-søk etter ioner av ladetilstander 2-5 til 200 tellinger. Angi dynamisk utelukkelse av forløperioner til 60 s.
- Eksperiment 2: MS/MS-produktionskanning med et MS2-skanneområde fra m/z 100-1500 (akkumuleringstid på 100 ms per hver 30-produktionskanning per syklus). Sett kollisjonsenergien til CES = 5, og velg deretter"høy følsomhet produkt ion skannemodus".
MERK: DDA-metoden vil skaffe MS/MS-spektra for de 30 mest tallrike forløperionene etter hver undersøkelse MS1-skanning per syklus, og den totale syklustiden vil være ~ 3,3 s. DDA-oppkjøp vil bli brukt til å bygge spektrale biblioteker som beskrevet i avsnitt 7.
- Bygge en MS-instrumentmetode for DIA og definere følgende instrumentskanningseksperimenter.
- Eksperiment 1: Utfør MS1-forløperskanning fra m/z 400-1250 (akkumuleringstid på 250 ms).
- Eksperiment 2: Utfør MS/MS-produktionskanninger for 64 variable SWATH-segmenter med et MS2-skanneområde fra m/z 100-1500 (akkumuleringstid på 45 ms per hver 64-produktionskanning per syklus). Sett kollisjonsenergien til CES = 10, og velg deretter"høy følsomhet produkt ion skannemodus".
- Bruk 64 variabelvindu DIA/SWATH-anskaffelsesstrategien som beskrevet av Schilling et al.22 for å oppnå etikettfri kvantifisering med en total syklustid på ~3,2 s. Kort, i dette oppkjøpet, i stedet for Q1 quadrupole overføre en smal masse rekkevidde gjennom til kollisjonscellen, et bredere vindu av variabel vindu bredde (5 -90 m / z) er passert i trinnvise trinn over hele masseområdet (m / z 400 -1250 med 64 SWATH segmenter, hver med en 45 ms akkumulering tid, noe som gir en syklus tid på 3,2 s, som inkluderer en MS1 scan med en 250 ms akkumuleringstid).
MERK: Variabel vindusbredden justeres i henhold til kompleksiteten til den typiske MS1-ionstrømmen som observeres innenfor et bestemt m/z-område ved hjelp av en variabel vinduskalkulatoralgoritme22 (smalere vinduer er valgt i "opptatt" m /z-områder, brede vinduer i m / z-områder med få eluting forløperioner). På andre MS-instrumentplattformer kan andre DIA-vindusstrategier implementeres.
7. Dataanalyse
MERK: Noen innstillinger for dataanalyse bør endres og tilpasses det spesifikke eksperimentet. For eksempel avhenger proteindatabasen (FASTA-filen) som ble valgt fra, arten som prøven ble utarbeidet fra (her, Mus muskuøse). Nedenfor er dataanalysen for museprøver beriket for acetylated og konsiserte peptider beskrevet.
- Bruk en MS-database søkemotor til å analysere DDA-anskaffelser. Opprett en database søkemotormetode som følger:
- For eksempel beskrivelse parametere: velg "Identifikasjon" under Prøvetype, velg "Iodoeddiksyre" under "Cysteine Alkylation", velg "Trypsin" under "Fordøyelse" (forutsatt C-terminal cleavage ved lysin og arginin), velg "TripleTOF 6600" under Instrument, under spesielle faktorer, sjekk acetylation vekt og succinylation berikelse, og Mus velge musculus under Arter.
- For spesifikke behandlingsparametere: velg "Biologiske endringer" under ID Focus, velg "SwissProt" under Database, sjekk "Grundig ID" under Søkeinnsats, velg "0,05 (10%)" under "Detected Protein Threshold", og sjekk "Kjør False Discovery Rate Analysis" under "Resultater Kvalitet". Lagre søkemotormetoden og send massespektrometriske råfiler for behandling av databasesøkemotoren ved hjelp av den genererte metoden.
MERK: I en iterativ prosess blir alle MS- og MS/MS-skanninger automatisk rekalibrert av søkemotoren basert på innledende merknader og resultater.
- Klikk på"Eksporter Peptid Sammendrag" ved ferdigstillelse av søket og filtrer alle peptid identifikasjon resultater med en "tillit terskel" på 99 i et regneark programvare (f.eks Excel; falsk oppdagelsesfrekvens [FDR] på 1%).
- I "Peptid Sammendrag" regnearkfil, filter for alle peptider som inneholder PTM merknad "acetylation" og "succinylation" i modifiseringskolonnen for å generere en resultatrapport for å presentere utelukkende de ljierte peptider og deres tilsvarende proteiner.
- For å bygge MS / MS spektrale biblioteker for videre behandling av DIA raw-filen og ytterligere relativ kvantifisering, åpne DIA Quantitative Analysis Software. Velg kategorien"Bibliotek", deretter (nederst på siden) klikk "Generer Spectral Library" fra "Database Søkemotor" og åpne en Database Search Engine FDR rapport (den * FDR.xlsx fil), som ble automatisk generert som en del av DDA raw fildatabase søkeprosessen. Deretter klikker du "neste" og velger "LibrarySettings Schema" og "neste". Velg "Uniprot_mouse_proteome" som database, og klikk deretter "neste" og "goa_mouse" som genmerknad (ontologi) fil. Til slutt klikker du "finish", og spektralbiblioteket vil bli generert.
MERK: Informasjon om acetylated og konsinasjonspeptider fra DDA rådatafiler, forløper ion skanner fra MS1, og fragment ion skanner fra MS2 vil bli inkludert i spektrale biblioteker (dette inkluderer oppbevaring tid, MS / MS fragmentering mønster, etc.). - Bruk DIA kvantitativ proteomics analyse programvare for å utføre relativ kvantifisering av acetylering og kortfattet ation nivåer og lage regneark av kandidat PTM-inneholdende peptider som kan brukes til videre dataanalyse.
- Hvis du vil analysere og kvantifisere PTM-inneholdende peptider, åpner du DIA Quantitative Analysis Software. Malskjemaet er tilgjengelig i programvaren ved å velge alternativet"Settings Perspective"| "DIA Analyse" | "BGS PTMs" (enten betydelig eller sparsom, avhengig av eksperimentet).
MERK: I stedet for å bruke BGS PTM-analysemalen i DIA Quantitative Analysis Software, kan alle PTM-spesifikke innstillinger også konfigureres manuelt ved å følge disse instruksjonene: 1) under "identifikasjon", velg "PTM lokalisering" (sannsynlighetscutoff = 0,75); 2) i "kvantifisering", velg "mindre peptid gruppering" | "modifisert sekvens"; og 3) under "post-analyse", velg "differensial overflod gruppering" | "mindre gruppe" (kvantifiseringsinnstillinger). Disse innstillingene vil aktivere PTM lokalisering funksjonen slik at modifiserte peptider er oppført som individuelle oppføringer og differensiering analyse utføres på peptid nivå. - For å starte Quantification Analysis, velg kategorien "Pipeline" , og klikk deretter "Sett opp en DIA-analyse fra fil", åpne MS DIA rå filer av interesse for relativ kvantifisering. Velg "Tilordne spektralbibliotek" og velg biblioteket som ble bygget ovenfor, klikk "load" | "neste". Velg "BGS PTMs" analyseskjema og klikk "neste". Velg riktig database FASTA-fil "Uniprot_mouse_proteome" | "neste". Definer betingelsesoppsettet, som tilordner de ulike betingelsene til prøvene, og klikk "neste". Velg "goa_mouse" som genmerknad (ontologi) fil og klikk "neste". Se gjennom oversikten over analyser (sammendrag av eksperimentoppsettet) og velg "utdatakatalog" | "finish". Til slutt klikker du på"Kjør pipeline"for å utføre den etikettfrie kvantitative analysen.
MERK: Statistiske moduler i DIA Quantitative Analysis Software utfører automatisk FDR-analyse, genererer varmekart og vulkanplott som sammenligner de ulike forholdene, genererer lister over identifiserte og kvantifiserte peptider og proteiner, og gir Q-verdier sammen med relative fold endringer sammenligne ulike forhold.
- Hvis du vil analysere og kvantifisere PTM-inneholdende peptider, åpner du DIA Quantitative Analysis Software. Malskjemaet er tilgjengelig i programvaren ved å velge alternativet"Settings Perspective"| "DIA Analyse" | "BGS PTMs" (enten betydelig eller sparsom, avhengig av eksperimentet).
- Som et alternativ, bruk programvare for interferens fjerning av DIA datasett for behandling av data og utføre statistisk analyse etter eksport av ekstraherte toppområder for acetylering og kortfattet nettsteder.
8. Datavisualisering av modifiserte peptider og vurdering av PTM-lokalisering av PTM-nettstedet
- For å åpne en generert DIA Kvantitativ analyse velg kategorien"Analyse" etterfulgt av "laste den kvantitative Analyse Programvare Eksperiment" (fra et lagret eksperiment åpning en *. SNE-fil). Naviger til *. SNE resultater fil og velg "åpne".
- I panelet til venstre klikker du på pilen til venstre for den tredje rådata *.wiff-filen fra toppen for å utvide og visualisere alle 64 SWATH-segmenter. Klikk på pilen til venstre for segmentet [428.7-437.3] for å utvide det spesifikke segmentet og vise de modifiserte peptidene som er identifisert for dette masseområdet. Klikk på den triply ladet peptid KQYGEAFEK[Acetyl]R.
MERK: Som standard viser høyre øvre panel vanligvis MS2 XIC, og det nedre panelet viser MS1 Isotope Envelope XIC- Velg "PTM Localization Plot"i det øvre panelet. I det nedre panelet velger du "PTM Localization Plot".
- I PTM Localization Plot velger du den øverste peptidsekvensen "KQYGEAFEK [Acetyl]R", med en total PTM lokaliseringscore på 18,32. Klikk på pilen til venstre for å utvide visningen og visualisere bekreftende og tilbakevise ioner. Klikk på pilen ved siden av"Bekrefter Ions", og velg deretter ion "y3 [+42]" for å markere den aktuelle ion, som bekrefter at acetylation området ligger på K2 av peptid sekvensen.
- I PTM Localization Plot velg den andre peptid sekvensen "K[Acetyl]QYGEAFEKR" med en total (svært lav) PTM lokalisering score på 1. Klikk på pilen til venstre for å utvide visningen og visualisere bekreftende og tilbakevise ioner. Klikk på pilen ved siden av "Bekrefter Ions", deretter på pilen ved siden av "Refuting Ions", velg deretter noen fragmenter ioner for å visualisere og vurdere ekstrahert ion kromatogram og MS / MS spectra (Figur 5).
MERK: Den tilordnede PTM-lokaliseringspoengsummen og visuell inspeksjon indikerer at riktig PTM isomer er KQYGEAFEK[Acetyl]R, mens det ikke finnes noe eller minimalt bevis for den andre mulige PTM isomer K[Acetyl]QYGEAFEKR.
Representative Results
Figur 1 viser et generelt diagram av arbeidsflyten, inkludert høsting av vevet fra muselever, ved hjelp av 1 mg protein for å fordøye proteinlysatet med trypsin, inkubere peptider med antistoffkonjugerte perler, anskaffe prøvene på MS, og til slutt utføre DIA / SWATH analyse av dataene ved hjelp av ulike kvantitative proteomiker programvarepakker (akademisk og kommersiell).
Figur 2A viser hvordan tidslinjen for arbeidsflyten og mengden utvalg og protein som kreves, sammenlignet med alternative metoder som brukes til multi-PTM-berikelsesstudier. En-pot-metoden kan utføres i halvparten så mye tid og med halvparten av antall prøver som disse alternative metodene. Sammenlignet med to single-PTM berikelsesmetode, krever en-pot-protokollen også halvparten av mengden protein.
Denne protokollen har vist seg å være et mulig og kostnadseffektivt alternativ. Figur 2B viser at mediankoeffisienten for variasjon (CV) for modifiserte peptidområder var lavere i én-pot-metoden enn i single-PTM- og seriell-PTM-berikelsene. Figur 2C,D viser at mens du sammenligner en-pot PTM og single-PTM berikelse metoder, ingen bemerkelsesverdige forskjeller var tydelig mellom korrelasjonene til nivå kvantifiseringer for de to modifikasjoner. Dette gjaldt også for korrelasjoner på peptidnivå og fragmenteringsnivå. Den samme observasjonen holdt for alle tre korrelasjoner når du sammenligner en-pot og seriell-PTM berikelser. Alle underliggende MS-rådata og behandlede Excel-resultatark knyttet til en nylig rapport fra Basisty et al.14 er tilgjengelige og kan lastes ned fra MassIVE (MSV00081906) og ProteomeXchange (PXD008640).
Generelt, mens antistoffberikelsesstrategier kan vise visse begrensninger, for eksempel potensiell epitopokklusjon eller begrenset spesifisitet, er antistoffene som brukes i denne studien blandinger av uavhengig genererte kloner og dermed gir bredere områder av Særegenheter.
Eksperimentelle resultater dokumenterer muligheten for å oppdage og vurdere PTM crosstalk. Figur 3 viser data fra en vellykket berikelse og illustrerer et eksempel for et peptid som inneholder flere og forskjellige acyl-modifikasjoner som visualiserer PTM-krysssnakk. Figur 3A viser et peptid som er acetylated på en lysin rester og succinylated på den andre, og figur 3B viser samme peptid succinylated på begge lysiner. Dette viser at de samme lysinrester kan endres med begge akyleringsgruppene, og det er mulighet for kryssforsken som skjer på dette stedet. Figur 4 viser antall lysinrester som ble identifisert som beskrevet i avsnitt7.1-7.3 for å bære begge modifikasjoner, og peker også mot mulig PTM crosstalk.
Som figur 5 demonstrerer, kan behandling av DIA PTM-datasett med kvantitativ proteomikkprogramvare gjøre det mulig for oss å finne ut hvilke spesifikke lysinrester som endres. Dette er et konsept kjent som lokalisering av nettstedet, som er et viktig skritt for enhver analyse for bestemmelse av mulig PTM crosstalk. Figur 5 viser to potensielle isoformer sammen med bekreftende og tilbakevise ioner for hver som kan visualiseres og vurderes som beskrevet i avsnitt8.1-8.3 (spesielt trinn 8.3.2 og 8.3.3). Basert på denne informasjonen kunne vi trygt identifisere hvilke av de to isoformene som var tilstede i det opprinnelige utvalget. MS/ MS-spekteret av den bekreftede isoform KQYGEAFEKacR viser tydelig at y ions (y2-y5) som inneholder acetylated lysin rester, som forskjøvet med 42 m / z (increment massen av en acetyl gruppe), bekreftet den spesifikke lysin rester i peptid som ble endret.
Figur 1: Typisk arbeidsflyt for en-pot berikelse av PTMer. Vev (her, lever) høstes fra SIRT5 KO og villtype (WT) mus, og proteiner er lysed, trypsin-fordøyd til peptider, og desaltet. Peptider berikes deretter av immunaffinitet med kombinasjoner av succinyl- og acetyl-antistoffperler. Parallelle MS-arbeidsflyter måler både 1) små aliquots av hele lysate proteinuttrykksendringer (for proteinnormalisering) og 2) beriket acylholdige peptider for acylation site identifikasjon (DDA-MS) og lokalisering på stedet, etterfulgt av kvantifisering (DIA-MS). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Sammenligning av arbeidsflyt med én pot med alternative metoder. (A) Sammenligning av tid, kostnader og materialer som kreves for en-pot arbeidsflyt, seriell-PTM berikelse, og to single-PTM berikelser. (B)Sammenligning av CV-er mellom en-pot arbeidsflyt, enkelt acetyl-lysin PTM berikelse, og enkelt succinyl-lysin PTM berikelse. Spearman korrelasjonsanalyse som sammenligner acyl peptid toppområder hentet fra en-pot arbeidsflyt, og single-PTM berikelser: tilsvarende tomter av log2 peak area resultater for (C) acetylation nettsteder og (D) succinylation nettsteder. Regresjonsbakker og korrelasjonsfaktorer er angitt i de enkelte panelene14. To uavhengige biologiske replikaer ble behandlet for hver av betingelsene. Dette tallet er endret fra Basisty et al.14. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Krysssnakk mellom acetylering og konsistasjonsmodifikasjoner av lysinrester. MS/MS spectra av tryptiske peptider fra mitokondrie 3-ketoacyl-CoA tiolase som viser samme aminosyresekvens, men har blitt modifisert ved to lysinrester med forskjellige PTMs. (A) MS/ MS av peptid AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKacK og (B) MS / MS av peptid AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccKsuK. Ksu Kc. Kc. Kc. Kc. Dette tallet er endret fra Basisty et al.14. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Overlapping og kryssforsken mellom acetylated og succinylated lysine rester-spesifikke eksempler i proteinkomplekser. (A) Venn diagram som viser overlapping mellom 2235 acetylation og 2173 kortfattede nettsteder. Av disse var 943 steder både acetylated og konsisert. Lever en SIRT5 (de-succinylase) knockout mus ble analysert, og mange konsisinyasjon nettsteder ble identifisert. Faktisk var de rikere enn normalt observert i muselever (modifiserte peptider ble filtrert med en Q-verdi på <0,05). (B) Proteinkomplekser som viser prosentandelen av deres underenheter som inneholder både acetylated og konsiserte steder (fet rød linje representerer betydningen som bestemmes av Fishers eksakte test). (C) Diagram over ATP synthase kompleks: protein underenheter i rødt skildrer underenhetene som inneholder både acetylated og konsiserte steder. Dette tallet er endret fra Basisty et al.14. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Kvantitativ proteomikkprogramvare dechiffrerer peptidnettstedetlokalisering av PTMs. Basert på MS/ MS fragmentering av peptidet, er det mulig å gi informasjon om de spesifikke lysinrester acetylgruppen endrer. Dette viser programvarens evne til å tilby verdifull informasjon om lokalisering av PTMs. (A) To muligheter for lysinrester modifikasjon og PTM nettstedet lokalisering: KQYGEAFEKacR (venstre) og KacQYGEAFEKR (høyre). "Bekreftelse" og "tilbakevise" fragmentioner vises for hver av de potensielle lokaliseringsisoformene for peptidet. Basert på denne informasjonen tilordnes bekreftende poengsummer og tilbakevisning av poengsummer, noe som bekrefter tilstedeværelsen av isoform KQYGEAFEKacR i eksemplet. (B) MS/MS-spektrum som tilsvarer bekreftet isoform KQYGEAFEKacR som indikerer at alle y ioner inkludert acetylated lysinrester (y2 og høyere) har en økningsmasse på +42 m/z, noe som tilsvarer essetmodifikasjonstylen. Observerte b ioner inneholder ikke modifikasjonen. (C)Ekstrahert ionkromatogram (XIC) med rikelig toppområder som følge av y2 og y3 ions, som begge utgjør acetylation området i bekreftet isoform KQYGEAFEKacR. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne protokollen beskriver en ny teknikk for samtidig flere PTM berikelse for å mer effektivt forstå PTM crosstalk. Alternative metoder for å nå dette målet har en tendens til å være uoverkommelig tidkrevende og dyrt, og de krever store mengder protein for å være vellykket11,13. Denne protokollen presenterer en arbeidsflyt for multi-PTM berikelse som innebærer inkubasjon i antistoffkonjugerte perler for to PTMer samtidig for å forbedre eksperimentets generelle effektivitet. Denne metoden innebærer også bruk av DDA for spektral bibliotekgenerasjon og DIA MS-oppkjøp for å oppdage og kvantifisere peptidene som er tilstede med redusert interferens fra fragmenter22,23. Programmer, for eksempel MS database søkemotorer brukes til å analysere og kvantifisere data fra DDA oppkjøp, mens Kvantitativ Proteomics Software24 og spesifikke DIA Quantitative Analysis Software25 er nødvendig for å tolke den komplekse spectra produsert av DIA oppkjøp.
Det er flere kritiske trinn i denne protokollen som bør følges nøye. Siden hovedmålet med protokollen er å berike for flere PTMer samtidig, er antibody-affinity berikelsestrinnet (avsnitt 2) avgjørende for eksperimentets suksess. Når du utfører vasker på perlene, er det nødvendig å sikre at ingen av perlene blir aspirert ved et uhell. Å sikre at ureakonsentrasjonen er fortynnet til 1 M før fordøyelsen med trypsin (trinn 1,8) er også nødvendig. Selv om 8 M urea er nødvendig tidligere i protokollen for proteinløselighet, vil ureakonsentrasjoner over 1 M hemme trypsins enzymatiske aktivitet. I tillegg er det viktig å konsekvent sjekke pH av prøven gjennom protokollen. Dette er spesielt viktig før fordøyelsen. Hvis pH av prøven og trypsinløsningen ikke nøytraliseres riktig før inkubasjonen, kan det resultere i en ineffektiv fordøyelse hvor mange spaltingssteder kan gå glipp av, noe som resulterer i færre peptididentifikasjoner.
Noen endringer i protokollen kan være nyttig når du forbereder prøver. For et proteinlysat anskaffet fra 1 mg startmateriale, kan en fjerdedel av antistoffperlene som leveres i hvert PTM-skannerør brukes som et kostnadseffektivt alternativ. En større mengde startmateriale kan brukes til bedre resultater, så lenge mengden antistoffperler som brukes, økes proporsjonalt. En annen endring som kan forbedre arbeidsflyten er å fordøye eksempler med en annen protease i tillegg til trypsin. Denne endringen ville resultere i mer variasjon i peptider spaltet, noe som gir økt dekning av proteinrester. Selv om det ikke er nødvendig, anbefales det at trypsin være et av enzymene som brukes til PTM-analyse på grunn av sin høye spaltingsspesifitet26.
En begrensning av denne protokollen er at PTM blir studert må ha lignende kjemi for å bli beriket samtidig14. Prosedyrene for de forskjellige antistoffkonjugerte perlene må være like, ved hjelp av lignende løsemidler og løsninger, inkludert lignende elutionforhold, og helst fra samme leverandør. Av denne grunn bruker metoden som er skissert her konsekvent acetylering og kortfattet som et eksempel, som begge bruker antistoffkonjugerte perler (Cell Signaling Technology, Inc). Selv om denne metoden teoretisk kan brukes på en rekke PTMs, vil ytterligere studier være nødvendig for å vurdere den nøyaktige begrensningen av protokollen i denne forbindelse. Videre, da dette er en antistoffbasert berikelsesmetode, kan metoden bare gi en relativ kvantifisering av PTM-områder.
Sammenlignet med eksisterende multi-PTM berikelsesmetoder, er denne arbeidsflyten et mer gjennomførbart og kostnadseffektivt alternativ. Fra dette eksperimentet ble det observert at effekten av denne metoden sammenligner ekstremt godt med alternative metoder, for eksempel individuelle eller serieberikelser. Figur 2B viser at median-CV for modifiserte peptid toppområder faktisk ble redusert i en-pot metoden i forhold til single-PTM berikelser og serie-PTM berikelser13. Vi analyserte videre de eksperimentelle resultatene som vurderte talltall på stedsnivå for acetylering eller konsistasjon. I tillegg viste Spearman korrelasjonsanalyse (figur 2C,D) at en-pot PTM-berikelsen utføres på samme måte som arbeidsflytene for enkeltPTM-berikelse. Dette gjaldt også for korrelasjonene på peptid- og fragmentnivå. Den samme observasjonen holdt for alle tre korrelasjoner når du sammenligner en-pot med seriell-PTM berikelse.
Denne protokollen gjør det mulig for forskere å gjøre fascinerende biologisk innsikt i PTM crosstalk på en rask og kostnadseffektiv måte. DIA-komponenten i arbeidsflyten gjør det mulig for forskere å forstå mer om PTMs, da den gir informasjon om lokalisering på stedet og overvinner utfordringer som lavt område belegg av PTMs. Forløperioner har en tendens til å bli utelukket med DDA, noe som er spesielt viktig når du studerer PTMs, da nettstedets belegg ofte er lavt til det punktet hvor disse peptidene ikke blir valgt for MS / MS, men fortsatt inneholder viktig informasjon. Oppfølgingseksperimenter kan utføres for å vurdere den øvre grensen for hvor mange PTMer som kan berikes samtidig ved hjelp av denne metoden. En fremtidig forbedring av denne arbeidsflyten kan omfatte utvikling av mer avanserte programvareplattformer for ytterligere å automatisere analysen av områdelokalisering og PTM-nettstedbelegg.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi anerkjenner støtten fra NIH delte instrumenteringsstipend for TripleTOF-systemet ved Buck Institute (1S10 OD016281). Dette arbeidet ble også støttet av National Institute of Allergy and Infectious Disease (R01 AI108255 til BS) og National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R24 DK085610 til Eric Verdin; R01 DK090242 til Eric Goetzman). X.X. ble støttet av et stipend fra National Institutes of Health (NIH grant T32GM8806, til Judith Campisi og Lisa Ellerby), N.B. ble støttet av et postdoktorstipend fra Glenn Foundation for Medical Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
| Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
| Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
| C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
| C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
| Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
| Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
| Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
| Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
| mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
| Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
| PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
| mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
| Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
| Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
| Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
| ProteinPilot 5.0 - 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
| PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
| PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
| Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
| Skyline - 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
| Spectronaut - 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
| Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
| TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
| TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
| Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
| Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
| Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
| ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |
References
- Christensen, D. G., et al. Post-translational Protein Acetylation: An Elegant Mechanism for Bacteria to Dynamically Regulate Metabolic Functions. Frontiers in Microbiology. 10, 1604 (2019).
- Deribe, Y. L., Pawson, T., Dikic, I.
- Sadoul, K., Boyault, C., Pabion, M., Khochbin, S. Regulation of protein turnover by acetyltransferases and deacetylases. Biochimie. 90 (2), 306-312 (2008).
- Swaney, D. L., et al. Global analysis of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk in protein degradation. Nature Methods. 10 (7), 676-682 (2013).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 596-601 (2000).
- Grunstein, M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature. 389 (6649), 349-352 (1997).
- Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms. Genes and Development. 12 (5), 599-606 (1998).
- Mocciaro, A., Rape, M. Emerging regulatory mechanisms in ubiquitin-dependent cell cycle control. Journal of Cell Sciences. 125 (Pt 2), 255-263 (2012).
- Lopez-Otin, C., Hunter, T. The regulatory crosstalk between kinases and proteases in cancer. Nature Reviews in Cancer. 10 (4), 278-292 (2010).
- Du, Z., et al. DNMT1 stability is regulated by proteins coordinating deubiquitination and acetylation-driven ubiquitination. Science Signalling. 3 (146), (2010).
- McManus, F. P., Lamoliatte, F., Thibault, P. Identification of cross talk between SUMOylation and ubiquitylation using a sequential peptide immunopurification approach. Nature Protocols. 12 (11), 2342-2358 (2017).
- Venne, A. S., Kollipara, L., Zahedi, R. P. The next level of complexity: crosstalk of posttranslational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 513-524 (2014).
- Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of post-translational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2013).
- Basisty, N., Meyer, J. G., Wei, L., Gibson, B. W., Schilling, B. Simultaneous Quantification of the Acetylome and Succinylome by 'One-Pot' Affinity Enrichment. Proteomics. 18 (17), e1800123 (2018).
- Wang, G., et al. Regulation of UCP1 and Mitochondrial Metabolism in Brown Adipose Tissue by Reversible Succinylation. Molecular Cell. 74 (4), 844-857 (2019).
- Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).
- Rardin, M. J., et al. Label-free quantitative proteomics of the lysine acetylome in mitochondria identifies substrates of SIRT3 in metabolic pathways. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 110 (16), 6601-6606 (2013).
- Rardin, M. J., et al. SIRT5 regulates the mitochondrial lysine succinylome and metabolic networks. Cell Metabolism. 18 (6), 920-933 (2013).
- Carrico, C., Meyer, J. G., He, W., Gibson, B. W., Verdin, E. The Mitochondrial Acylome Emerges: Proteomics, Regulation by Sirtuins, and Metabolic and Disease Implications. Cell Metabolism. 27 (3), 497-512 (2018).
- Sadhukhan, S., et al. Metabolomics-assisted proteomics identifies succinylation and SIRT5 as important regulators of cardiac function. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 113 (16), 4320-4325 (2016).
- Collins, B. C., et al. Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry. Nature Communications. 8 (1), 291 (2017).
- Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. Generation of High-Quality SWATH((R)) Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF((R)) Mass Spectrometers. Methods in Molecular Biology. 1550, 223-233 (2017).
- Meyer, J. G., Schilling, B. Clinical applications of quantitative proteomics using targeted and untargeted data-independent acquisition techniques. Expert Reviews in Proteomics. 14 (5), 419-429 (2017).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Sticker, A., Martens, L., Clement, L. Mass spectrometrists should search for all peptides, but assess only the ones they care about. Nature Methods. 14 (7), 643-644 (2017).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular Cell Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
