ヒトの神経ノチカルスライスの二重電圧およびカルシウム光学マッピングによる前臨床心臓電気生理学的評価
Summary
本プロトコルは、前臨床薬物検査のためのヒト心臓スライスの切り離しおよび培養の手順を説明し、これらのスライスから膜貫通電圧および細胞内カルシウム信号を同時に記録するための光学マッピングの使用について詳述する。
Abstract
ヒト心臓スライス製剤は、動物と臨床試験の間のギャップを埋めるために、ヒト生理学研究と治療試験のプラットフォームとして最近開発されました。薬物の効果を調べるために多くの動物および細胞モデルが使用されてきたが、これらの反応はヒトにおいてしばしば異なる。ヒトの心臓スライスは、実行可能な人間の心臓から直接派生するという点で、薬物検査の利点を提供します。保存された多細胞構造、細胞と細胞の結合、および細胞外マトリックス環境に加えて、ヒト心臓組織スライスは、成人ヒト心臓生理学に対する無数の薬物の効果を直接テストするために使用することができる。このモデルを心臓全体やくさびなどの他の心臓製剤と区別しているのは、スライスが長期的な培養を受けることができてしまうということです。したがって、心臓スライスは、薬物の急性および慢性の影響を研究することを可能にする。さらに、単一の心臓から数百から千のスライスを収集する能力は、同時に様々な濃度と他の薬物との組み合わせでいくつかの薬物をテストするハイスループットモデルになります。スライスは、心臓の任意の領域から調製することができます。このプロトコルでは、左心室自由壁から組織キューブを単離し、高精度振動ミクロトームを用いてスライスに切り離すことによって、左心室スライスの調製について説明する。これらのスライスは、その後、急性実験を行ってベースライン心臓電気生理学的機能を測定するか、慢性薬物研究のために培養することができる。このプロトコルはまた、膜貫通電位と細胞内カルシウムダイナミクスの同時記録のための心臓スライスの二重光学マッピングを記述し、調査中の薬物の効果を決定する。
Introduction
動物モデルは、ヒト生理学および病態生理学の基礎的なメカニズムを理解するために使用される貴重なツールであり、また様々な疾患を治療するための治療法の予備試験のためのプラットフォームである1。これらの動物研究2に基づく生物医学研究の分野で大きな進歩がとられています。しかし、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、およびイヌ,3、4を含む、ヒトと動物の生理学の3間に有意な種間の違いが存在する。その結果、動物実験の段階で約束を示したが、臨床試験5で結果に応えられなかった多くの薬物、遺伝子、および細胞療法があった。このギャップを埋めるために、孤立した心筋細胞およびヒト人工多能性幹細胞(iPSC)は、様々な薬物および疾患に対するヒト生理学の応答を試験するモデルとして開発された6。幹細胞由来心筋細胞は、心臓,6,7,87の代理として臓器オンチップ系で広く使用されている。68しかし、iPSC由来の心筋細胞(iPSC-CM)の有用性は、比較的未熟な表現型と心筋細胞亜集団の表現の欠如によって妨げられる。成熟した心筋は、線維芽細胞、ニューロン、マクロファージ、内皮細胞などのいくつかの共存する細胞タイプから構成される複雑な構造である。一方、孤立したヒト心筋細胞は電気的に成熟しており、培養パラメータ9を改変することにより異なる心筋細胞亜集団を得ることができる。それでも、これらの筋細胞は一般的に、細胞間結合の欠如、急速な分化、およびvitro10,11,11における不整脈行動の発生による変化作用電位形態を示す。いくつかの制限は、iPSC-CMおよび心臓筋細胞の3D細胞培養モデルによって対処された。これらのモデルは、スフェロイド、3D培養物をカプセル化したヒドロゲル足場、設計された心臓組織(EHT)、および心臓オンチップシステムを含み、心筋細胞、線維芽細胞、および内皮細胞などの複数の心臓細胞集団を使用する。彼らは自己集合するか、足場に沿って組み立てて3D構造を形成し、心筋の複雑な異方性の性質を再現するものもあります。これらのモデルは、成熟した型の細胞、収縮特性、および心臓組織に類似した分子プロファイルを有することが報告されている。心臓オンチップシステムはまた、薬物検査および疾患モデルにおける全身効果の研究を可能にする。しかし、インビトロ細胞ベースモデルは、天然の細胞外マトリックスを欠いているため、臓器レベルの電気生理学を正確に模倣することはできません。対照的に、ヒト心臓スライスは、無傷の細胞外マトリックスおよびネイティブ細胞間接触を有し、ヒト心筋の不整脈特性をより正確に調べるのに有用である。
研究者は、急性および慢性薬物検査のための生理学的前臨床プラットフォームとしてヒト心臓組織学的スライスを開発し、心臓電気生理学および心臓病進行を研究するために12、13、14、15、16、17、18、19。12,13,14,15,16,17,18,19iPSC由来の心筋細胞と比較すると、ヒト心臓スライスは成熟した心筋細胞表現型を有する成人ヒト心臓電気生理学をより忠実に複製する。単離されたヒト心筋細胞と比較すると、心臓スライスは、良好に保存された細胞と細胞の結合と、その本来の細胞内および細胞外環境の本質的な存在のために、生理作用の可能性のある持続時間を示す。
このプロトコルは、ドナー心臓全体からヒト心臓スライスを生成するプロセスを記述し、急性(すなわち、時間の長さ)および慢性(すなわち、日-長い)研究を行い、光学マッピングを介して心臓電気生理学パラメータをテストする。このプロトコルは左心室(LV)組織の使用のみを説明するが、それは正常にマウス、ラット、モルモット、および豚14、20、21、22,20,21などの他の種だけでなく、心臓の他の領域に適用されています。,22私たちの研究室では、過去5年間移植を拒否されたヒトドナー心臓全体を使用していますが、組織がキューブに切り離される能力を持っている限り、代替手段(例えば、左心室補助装置[LVAD]移植、生検、子宮摘出)によって得られたドナー心臓サンプル組織に対してこれらの同じ手順を行うことは可能です。光学マッピングは、高空間(100 x 100ピクセル)と時間(>1,000フレーム/s)解像度で光学的作用電位とカルシウム過渡を同時にマッピングする能力があるため、この研究では分析に使用されています。多電極アレイ(MEA)や微小電極などの代替方法も使用できますが、これらの手法は比較的低い空間解像度によって制限されます。さらに、MEAは細胞培養用に設計されており、鋭利な微小電極は、心臓全体または大きな組織ウェッジで使用するためにより簡単に管理できます。
この記事の目的は、より多くの研究者が心臓電気生理学研究のためにヒト心臓組織を使用できるようにすることです。この記事に記載されている技術は、比較的単純で、短期間の研究(数時間から数日の順序で)に有益であることを留意すべきです。より多くの生理学的な生物模倣文化は、より長期にわたる研究(週の順)に関して議論され、他の多くの研究によって説明されてきた1212、18、23。,18,23電気刺激,、機械的負荷、および組織ストレッチは、12、18、23,18のインビトロ組織再モデリングの発症を制限するのに役立つ有利な調整機構である。23
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、心突っ込んで逮捕されたヒト心臓から実行可能な心臓スライスを得るためのステップバイステップの方法を提示し、膜貫通電位と細胞内カルシウムの二重光学マッピングを用いてスライスを機能的に特徴付ける。保存された細胞外環境とネイティブの細胞と細胞の結合により、ヒト心臓スライスは、基本的な科学的発見と薬理学的薬剤および遺伝子治療の有効性および心臓毒性試?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH(助成金R21 EB023106、R44 HL139248、R01 HL126802)、Leducq財団(プロジェクトRHYTHM)、米国心臓協会博士研究員(19POST34370122)による資金提供は感謝しています。
Materials
| 1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
| 2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 6 well culture plates | Corning | 3516 | |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
| Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
| Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
| Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
| Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
| Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
| Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
| Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
| Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
| Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
| RH237 | Biotium | 61018 | |
| Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
| Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
| TissueSeal – Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
| Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
| Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |
References
- Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).
- Choudhary, A., Ibdah, J. A. Animal models in today’s translational medicine world. Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).
- Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Green, A. R. Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).
- Shinnawi, R., Gepstein, L. iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331 (2014).
- Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip. Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1. Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).
- Zhang, Y., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PloS One. 5 (9), 12559 (2010).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, 117 (2019).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts – A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).
- Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).
- Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. Supply of nutrients to cells in engineered tissues. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).
- Brianna, C., et al. Open-Source Multiparametric Optocardiography. Scientific Reports. 9, 721 (2019).
- George, S. A., et al. Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).
- Kawara, T., et al. Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis. Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).
- Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).
- Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies. Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).
- Lou, Q., et al. Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure. Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).
