인간 조직형 심장 슬라이스의 이중 전압 및 칼슘 광학 매핑에 의한 전임상 심장 전극생리학 평가
Summary
이 프로토콜은 전임상 약물 검사를 위해 인간의 심장 조각을 단면화 및 배양하는 절차를 설명하고 이러한 조각에서 동시에 세포간 전압 및 세포내 칼슘 신호를 기록하기 위한 광학 매핑의 사용을 자세히 설명합니다.
Abstract
인간 심장 슬라이스 제제는 최근 인간 생리학 연구 및 치료 테스트를 위한 플랫폼으로 개발되어 동물 실험과 임상 시험 사이의 격차를 해소하고 있습니다. 수많은 동물 및 세포 모델은 약물의 효과 검사 하는 데 사용 되었습니다., 하지만 이러한 응답은 종종 인간에서 다릅니다. 인간의 심장 조각은 실행 가능한 인간의 마음에서 직접 파생된다는 점에서 약물 검사에 대한 이점을 제공합니다. 다세포 구조, 세포 세포 커플링 및 세포 외 매트릭스 환경을 보존하는 것 외에도 인간 심장 조직 조각은 성인 인간 심장 생리학에 무수한 약물의 효과를 직접 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이 모델을 전체 하트 나 웨지와 같은 다른 심장 준비와 구별하는 것은 슬라이스가 장기적인 문화를 받을 수 있다는 것입니다. 따라서 심장 조각은 급성뿐만 아니라 약물의 만성 효과를 연구 할 수 있습니다. 더욱이, 단일 심장에서 수백에서 천 조각을 수집하는 능력은 동시에 다른 약물과 다양한 농도와 조합에서 여러 약물을 테스트하는 높은 처리량 모델을 만든다. 슬라이스는 심장의 주어진 부위에서 제조 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 왼쪽 심실 프리 월에서 조직 큐브를 분리하고 고정밀 진동 미세 토메를 사용하여 조각으로 분할하여 왼쪽 심실 슬라이스의 준비를 설명합니다. 이 조각은 그 때 기준선 심장 전기 생리학적 기능을 측정하기 위하여 심각한 실험을 복종하거나 만성 약 연구 결과를 위해 배양될 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 조사되는 약의 효력을 결정하기 위하여 세포내 전위 및 세포내 칼슘 역학의 동시 기록을 위한 심장 조각의 이중 광학 매핑을 기술합니다.
Introduction
동물 모델은 인간 생리학 및 병리학의 기본 메커니즘을 이해하는 데 사용되는 귀중한 도구뿐만 아니라 다양한 질병을 치료하는 치료의 예비 테스트를위한플랫폼이었습니다 1. 이 동물 연구 2에 근거를 둔 생물 의학 연구의 분야에서 큰 보폭을 취했습니다2. 그러나, 마우스, 쥐, 기니피그, 토끼, 양, 돼지 및 개3,,4를포함하여 인간과 동물 생리학 사이에 중요한 종 간 차이가 존재한다. 그 결과, 동물 실험 단계에서 약속을 보였지만 임상 시험5의결과에 부응하지 못하는 수많은 약물, 유전자 및 세포 치료법이 있었습니다. 이러한 격차를 해소하기 위해, 고립된 심장 심근세포와 인간 유도만능 줄기세포(iPSC)는 다양한 약물 및 질병에 대한 인간 생리학의 반응을 시험하는 모델로 개발되었다6. 줄기 세포 유래 심근세포는,심장6,7,78의대리로서 장기-온-칩 시스템에서 널리 사용되고 있다. 그러나, iPSC 유래 심근세포(iPSC-CM)의 유용성은 상대적으로 미성숙표현형과 심근세포 하위집단의 표현부족에 의해 방해된다. 성숙한 심근은 섬유아세포, 뉴런, 대식세포 및 내피 세포와 같은 여러 공존세포 유형으로 구성된 복합구조이다. 한편, 고립된 인간 심근세포는 전기적으로 성숙하며, 상이한 심근세포 하위집단은 배양 파라미터9를변경하여 얻을 수 있다. 여전히, 이러한 근세포는 일반적으로 세포 세포 커플링의 부족, 신속한 분화 및 시험관 내의 비리듬 거동의 발생으로 인해 변경된 작용 잠재적형태론을나타낸다10,11. 일부 제한 사항은 iPSC-CM 및 심장 심근세포의 3D 세포 배양 모델에 의해 해결되었습니다. 스페로이드, 하이드로겔 스캐폴드 캡슐화 된 3D 배양, 엔지니어링 심장 조직 (EHTs), 및 심장 온 칩 시스템을 포함하는 이 모델은 심근세포, 섬유아세포 및 내피 세포와 같은 다중 심장 세포 집단을 사용합니다. 그들은 3D 구조를 형성하기 위해 비계를 따라 자체 조립하거나 조립하고 일부는 심근의 복잡한 이색성 특성을 재현합니다. 이 모형은 성숙한 표현형의 세포가 있기 위하여 보고되었습니다, 수축 속성, 및 심장 조직과 유사한 분자 단면도. 심장 에 칩 시스템은 또한 약물 테스트 및 질병 모델에서 전신 효과의 연구를 할 수 있습니다. 그러나, 체외 세포 기반 모델은 네이티브 세포 외 매트릭스가 부족하므로 기관 수준 전기 생리학을 정확하게 모방 할 수 없습니다. 반면 인간의 심장 조각은 그대로 세포 외 매트릭스와 네이티브 세포 대 세포 접촉을 가지고 있어 인간 심근의 부정맥 특성을 보다 정확하게 검사하는 데 유용합니다.
연구진은 급성 및 만성 약물 검사를 위한 생리학적 전임상 플랫폼으로서 인간 심장 조직화 슬라이스를 개발하여 심장 전기생리학과 심장질환 진행,12,13,,,14,,15,,16,17,,18,19를연구하고 있다., iPSC 유래 심근세포와 비교했을 때, 인간 심장 조각은 성숙한 심근세포 표현형으로 성인 심장 전기 생리학을 보다 충실하게 복제합니다. 고립 된 인간 심근 세포와 비교할 때, 심장 조각은 잘 보존 된 세포 세포 커플링과 그들의 토착 세포 내 및 세포 외 환경의 본질적인 존재 때문에 생리적 작용 잠재적 인 기간을 나타낸다.
이 프로토콜은 전체 기증자 심혼에서 인간 적인 심장 조각을 생성하는 과정을 설명합니다, 광학 매핑을 통해 심장 전기 생리학 파라미터를 테스트하기 위하여 급성 (즉, 시간 긴) 및 만성 (즉, 일- 긴) 연구 결과를 능력을 발휘합니다. 이 프로토콜은 좌심실(LV) 조직의 사용만을 설명하지만, 마우스, 쥐, 기니피그 및돼지(14,,20,,21,,22)와같은 다른 종뿐만 아니라 심장의 다른 부위에도 성공적으로 적용되었다. 우리의 실험실은 지난 5 년 동안 이식을 위해 거부 된 전체 인간 기증자 심장을 사용하지만, 조직이 큐브로 절제 될 수있는 능력을 가지고 있는 한 대안적 수단 (예를 들어, 좌심실 보조 장치 [LVAD] 이식, 생검, myectomies)에 의해 얻은 모든 기증자 심장 샘플 조직에서 이러한 동일한 절차를 수행 할 수 있습니다. 광학 매핑은 광학 작용 잠재력과 칼슘 과도를 높은 공간(100 x 100 픽셀) 및 측두구(>1,000 프레임/s) 해상도로 동시에 매핑할 수 있는 능력으로 인해 이 연구에서 분석을 위해 사용됩니다. 다중 전극 어레이(MEA) 또는 마이크로 전극과 같은 대체 방법도 사용할 수 있지만 이러한 기술은 상대적으로 낮은 공간 해상도에 의해 제한됩니다. 또한, MEA는 세포 배양과 함께 사용하도록 설계되었으며, 날카로운 미세 전극은 전체 하트 또는 큰 조직 웨지와 함께 사용하기 위해 보다 쉽게 관리됩니다.
이 기사의 목표는 더 많은 연구원이 심장 전기 생리학 연구를 위해 인간 심장 조직을 사용할 수 있도록 하는 것입니다. 이 문서에 설명 된 기술은 상대적으로 간단 하 고 단기 연구에 대 한 도움이 (몇 시간의 순서에 일). 장기 연구를 위한 더 많은 생리적 생체 mimetic 배양 (주 순서에) 다른 연구의 숫자에 의해 논의 및 설명 되었다12,,18,,23. 전기 자극, 기계적 적재 및 조직 스트레칭은 체외,조직 리모델링12,,18,23의발병을 제한하는 데 도움이 되는 유리한 컨디셔닝 메커니즘이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서, 우리는 심장마비로 체포된 인간의 심혼에서 실행 가능한 심장 조각을 얻고 세포간 전위 및 세포내 칼슘의 이중 광학 매핑을 사용하여 조각을 기능적으로 특성화하는 단계별 방법을 제시합니다. 보존된 세포 외 환경과 기본 세포 세포 커플링을 통해 인간의 심장 조각은 근본적인 과학적 발견과 약리학 제제 및 유전자 치료의 효능 및 심독성 검사를 위한 인간의 심장의 정확한 모델로 사?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH (R21 EB023106, R44 HL139248 및 R01 HL126802)에 의한 자금 지원은 Leducq 재단 (프로젝트 리듬)과 미국 심장 협회 후 펠로우십 (19POST34370122)에 의해 감사하게 인정됩니다.
Materials
| 1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
| 2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 6 well culture plates | Corning | 3516 | |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
| Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
| Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
| Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
| Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
| Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
| Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
| Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
| Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
| Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
| RH237 | Biotium | 61018 | |
| Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
| Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
| TissueSeal – Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
| Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
| Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |
References
- Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).
- Choudhary, A., Ibdah, J. A. Animal models in today’s translational medicine world. Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).
- Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Green, A. R. Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).
- Shinnawi, R., Gepstein, L. iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331 (2014).
- Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip. Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1. Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).
- Zhang, Y., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PloS One. 5 (9), 12559 (2010).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, 117 (2019).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts – A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).
- Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).
- Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. Supply of nutrients to cells in engineered tissues. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).
- Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275 (2011).
- Brianna, C., et al. Open-Source Multiparametric Optocardiography. Scientific Reports. 9, 721 (2019).
- George, S. A., et al. Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).
- Kawara, T., et al. Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis. Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).
- Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109 (2018).
- Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies. Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).
- Lou, Q., et al. Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure. Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).
