Evaluación de electrofisiología cardíaca preclínica por doble voltaje y mapeo óptico de calcio de cortes cardíacos organotípicos humanos
Summary
Este protocolo describe el procedimiento para secimiento y cultivo de rebanadas cardíacas humanas para pruebas de fármacos preclínicos y detalla el uso de mapeo óptico para registrar el voltaje transmembrano y las señales de calcio intracelular simultáneamente a partir de estas rebanadas.
Abstract
Recientemente se han desarrollado preparaciones de rebanadas cardíacas humanas como una plataforma para estudios de fisiología humana y pruebas terapéuticas para cerrar la brecha entre los ensayos en animales y clínicos. Numerosos modelos animales y celulares se han utilizado para examinar los efectos de los fármacos, sin embargo, estas respuestas a menudo difieren en los seres humanos. Las rebanadas cardíacas humanas ofrecen una ventaja para las pruebas de drogas, ya que se derivan directamente de corazones humanos viables. Además de haber preservado estructuras multicelulares, acoplamiento de células celulares y entornos de matriz extracelular, las rebanadas de tejido cardíaco humano se pueden utilizar para probar directamente el efecto de innumerables fármacos en la fisiología cardíaca humana adulta. Lo que distingue a este modelo de otras preparaciones del corazón, como corazones enteros o cuñas, es que las rebanadas pueden ser sometidas a cultura a largo plazo. Como tal, las rebanadas cardíacas permiten estudiar los efectos agudos y crónicos de los medicamentos. Además, la capacidad de recoger varios cientos a mil rebanadas de un solo corazón hace de este un modelo de alto rendimiento para probar varios fármacos en diferentes concentraciones y combinaciones con otros medicamentos al mismo tiempo. Las rebanadas se pueden preparar desde cualquier región del corazón. En este protocolo, describimos la preparación de las rodajas ventriculares izquierdas aislando cubos de tejido de la pared libre ventricular izquierda y segándolas en rodajas usando un microtoma vibratorio de alta precisión. Estas rebanadas pueden ser sometidas a experimentos agudos para medir la función electrofisiológica cardíaca basal o cultivadas para estudios de drogas crónicas. Este protocolo también describe el mapeo óptico dual de las rebanadas cardíacas para grabaciones simultáneas de potenciales transmembranas y dinámicas de calcio intracelulares para determinar los efectos de los fármacos que se están investigando.
Introduction
Los modelos animales han sido una herramienta valiosa utilizada para comprender los mecanismos subyacentes de la fisiología humana y la fisiopatología, así como una plataforma para las pruebas preliminares de terapias para tratar diversas enfermedades1. Se han realizado grandes avances en el campo de la investigación biomédica basada en estos estudios en animales2. Sin embargo, existen diferencias interespecíficos significativas entre las fisiologías humanas y animales, incluidos ratones, ratas, conejillos de indias, conejos, ovejas, cerdos y perros3,4. Como resultado, ha habido numerosas terapias farmacológicas, genéticas y celulares que mostraron promesa durante la etapa de pruebas con animales, pero no pudieron estar a la altura de los resultados en los ensayos clínicos5. Para colmar esta brecha, se desarrollaron miocitos cardíacos aislados y células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) como modelos para probar la respuesta de la fisiología humana a diversos fármacos y enfermedades6. Los cardiomiocitos derivados de células madre han sido ampliamente utilizados en sistemas de órgano en un chip como sustituto del corazón6,,7,,8. Sin embargo, la utilidad de los cardiomiocitos derivados del iPSC (iPSC-CM) se ve obstaculizada por su fenotipo relativamente inmaduro y la falta de representación de la subpoblación de cardiomiocitos; el miocardio maduro es una estructura compleja compuesta por varios tipos celulares coexistibles como fibroblastos, neuronas, macrófagos y células endoteliales. Por otro lado, los cardiomiocitos humanos aislados son eléctricamente maduros, y diferentes subpoblaciones de cardiomiocitos se pueden obtener mediante la alteración de los parámetros de cultivo9. Aún así, estos miocitos generalmente exhiben morfologías potenciales de acción alteradas debido a la falta de acoplamiento de células celulares, des-diferenciación rápida, y la ocurrencia de comportamiento proarrítmico in vitro10,11. Algunas de las limitaciones fueron abordadas por modelos de cultivo celular 3D de iPSC-CM y miocitos cardíacos. Estos modelos, que incluyen esferoides, scaffolds de hidrogel encapsulados cultivos 3D, tejidos cardíacos diseñados (EHT) y sistemas de corazón en una ardilla, utilizan múltiples poblaciones de células cardíacas como cardiomiocitos, fibroblastos y células endoteliales. Se automontan o ensamblan a lo largo de un andamio para formar estructuras 3D, y algunos incluso reproducen la compleja naturaleza anisotrópica del miocardio. Se ha notificado que estos modelos tienen células de fenotipos maduros, propiedades contráctiles y perfiles moleculares similares al tejido cardíaco. El sistema de corazón en un chip también permite el estudio de los efectos sistémicos en las pruebas de drogas y los modelos de enfermedades. Sin embargo, los modelos basados en células in vitro carecen de la matriz extracelular nativa y, por lo tanto, no pueden imitar con precisión la electrofisiología a nivel de órgano. Las rebanadas cardíacas humanas, en cambio, tienen una matriz extracelular intacta y contactos nativos de célula a célula, lo que los hace útiles para examinar con mayor precisión las propiedades arritmogénicas del miocardio humano.
Los investigadores han desarrollado rebanadas organotípicas cardíacas humanas como plataforma fisiológica preclínica para pruebas de fármacos agudos y crónicos y para estudiar la electrofisiología cardíaca y la progresión de enfermedades cardíacas12,,13,,14,,15,,16,,17,,18,,19. En comparación con los cardiomiocitos derivados de iPSC, las rebanadas cardíacas humanas replican más fielmente la electrofisiología cardíaca humana adulta con un fenotipo maduro de cardiomiocitos. En comparación con los cardiomiocitos humanos aislados, las rebanadas cardíacas exhiben duraciones potenciales de acción fisiológica debido al acoplamiento de células celulares bien conservado y la existencia intrínseca de sus ambientes intra y extracelulares nativos.
Este protocolo describe el proceso de generación de rebanadas cardíacas humanas a partir de corazones de donantes enteros, realizando estudios agudos (es decir, de horas de duración) y crónicos (es decir, de días de duración) para probar parámetros de electrofisiología cardíaca a través de mapeo óptico. Si bien este protocolo describe sólo el uso del tejido ventricular izquierdo (LV), se ha aplicado con éxito a otras regiones del corazón, así como a otras especies como ratones, ratas, conejillos de indias y cerdos14,,20,,21,,22. Nuestro laboratorio utiliza corazones de donantes humanos enteros que han sido rechazados para el trasplante durante los últimos 5 años, pero es factible que estos mismos procedimientos se lleven a cabo en cualquier tejido de muestra de corazón del donante obtenido por medios alternativos (por ejemplo, implantes de dispositivo de asistencia ventricular izquierda [LVAD], biopsias, mitomigenes) siempre y cuando los tejidos tengan la capacidad de ser seccionados en cubos. El mapeo óptico se emplea para el análisis en este estudio debido a su capacidad para mapear simultáneamente potenciales de acción óptica y transitorios de calcio con alta resolución espacial (100 x 100 píxeles) y temporal (>1.000 fotogramas/s). También se pueden utilizar métodos alternativos, como matrices multielectrodas (AMA) o microelectrodos, pero estas técnicas están limitadas por sus resoluciones espaciales relativamente bajas. Además, los MEA se diseñaron para su uso con cultivos celulares, y los microelectrodos afilados se gestionan más fácilmente para su uso con corazones enteros o cuñas de tejido grandes.
El objetivo del artículo es permitir que más investigadores utilicen tejidos cardíacos humanos para estudios de electrofisiología cardíaca. Cabe señalar que la tecnología descrita en este artículo es relativamente simple y beneficioso para estudios a corto plazo (en el orden de varias horas a días). Más cultivo biomimético fisiológico para estudios a largo plazo (sobre el orden de las semanas) ha sido discutido y descrito por un número de otros estudios12,18,23. La estimulación eléctrica, la carga mecánica y el estiramiento de tejidos son mecanismos de acondicionamiento ventajosos que pueden ayudar a limitar la aparición de la remodelación in vitro del tejido12,,18,,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, presentamos métodos paso a paso para obtener rebanadas cardíacas viables de corazones humanos cardioplególo y para caracterizar funcionalmente las rebanadas utilizando el mapeo óptico dual del potencial transmembrano y el calcio intracelular. Con un ambiente extracelular preservado y acoplamiento de células celulares nativas, las rebanadas cardíacas humanas se pueden utilizar como un modelo preciso del corazón humano para el descubrimiento científico fundamental y para pruebas de eficacia y cardiotoxicidad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Se agradece con gratitud la financiación de NIH (becas R21 EB023106, R44 HL139248 y R01 HL126802), por la fundación Leducq (proyecto RHYTHM) y una beca postdoctoral de la Asociación Americana del Corazón (19POST34370122).
Materials
| 1mL BD Syringe | Thomas Scientific | 309597 | |
| 2,3-butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 6 well culture plates | Corning | 3516 | |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1377 | |
| Blebbistatin | Cayman | 13186 | |
| Bubble Trap | Radnoti | 130149 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Corning Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
| Di-4-ANEPPS | Biotium | stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Emission dichroic mirror | Chroma | T630LPXR-UF1 | |
| Emission filter (RH237) | Chroma | ET690/50m | |
| Emission Filter (Rhod2AM) | Chroma | ET590/33m | |
| Excitation dichroic mirror | Chroma | T550LPXR-UF1 | |
| Excitation Filter | Chroma | ET500/40x | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Heat exchanger | Radnoti | 158821 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Incubator | ThermoFisher Scientific | 50145502 | |
| Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| LED excitation light source | Prizmatix | UHP-Mic-LED-520 | |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Medium 199 | ThermoFisher Scientific | 11150059 | |
| Micam Ultima L type CMOS camera | Scimedia | N/A | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pennicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07522-20 | |
| Platinum pacing wire | Alfa Aesar | 43275 | |
| Pluronic F127 | ThermoFisher Scientific | P6867 | nonionic, surfactant polyol |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powerlab data acquisition and stimulator | AD Instruments | Powerlab 4/26 | |
| RH237 | Biotium | 61018 | |
| Rhod2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Sterilizer, dry bead | Sigma-Aldrich | Z378550 | |
| Stone Oxygen Diffuser | Waterwood | B00O0NUVM0 | |
| TissueSeal – Histoacryl Topical Skin Adhesive | gobiomed | AESCULAP | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520100 | |
| Ultrasound sonicator | Branson 1800 | ||
| Vibratome | Campden Instruments | 7000 smz |
References
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