Apresentamos um protocolo de rotulagem de etiquetagem tandem (TMT) otimizado que inclui informações detalhadas para cada uma das seguintes etapas: extração de proteínas, quantificação, precipitação, digestão, rotulagem, submissão a uma instalação de proteômica e análises de dados.
As tecnologias proteômicas são metodologias poderosas que podem ajudar a entender nossos mecanismos de ação em sistemas biológicos, fornecendo uma visão global do impacto de uma doença, tratamento ou outra condição no proteome como um todo. Este relatório fornece um protocolo detalhado para a extração, quantificação, precipitação, digestão, rotulagem e análise subsequente de dados de amostras de proteínas. Nosso protocolo de rotulagem TMT otimizado requer uma menor concentração de etiquetas e consegue dados consistentemente confiáveis. Usamos este protocolo para avaliar perfis de expressão proteica em uma variedade de tecidos de camundongos (ou seja, coração, músculo esquelético e cérebro) bem como células cultivadas in vitro. Além disso, demonstramos como avaliar milhares de proteínas a partir do conjunto de dados resultante.
O termo “proteômica” foi definido pela primeira vez como a caracterização em larga escala de todo o complemento proteico de uma célula, tecido ou organismo1. As análises proteômicas permitem a investigação de mecanismos e processos celulares envolvidos no desenvolvimento de doenças, vias terapêuticas e sistemas saudáveis utilizando técnicas para realizar a quantificação relativa dos níveis de expressão proteica2. As descrições iniciais de tais estudos foram publicadas em 1975 e demonstraram o uso de eletroforese de gel poliacrilamida bidimensional (2D-PAGE) para este fim1,,3. O método 2D separa proteínas baseadas na carga (focalização isoelétrica, IEF) e massa molecular (eletroforese de gel de poliacrilamida de sulfato de sódio, ou SDS-PAGE)4. Durante anos, a combinação de espectrometria de massa 2D-PAGE e subsequente em tandem realizada em cada componente gel foi a técnica de análise de expressão proteica não alvo mais comum realizada e identificou numerosos perfis de expressão proteica até então desconhecidos5,,6. Desvantagens gerais para a abordagem 2D-PAGE são que é demorado, não funciona bem para proteínas hidrofóbicas, e há limitações no número total de proteínas avaliadas devido à baixa sensibilidade7,,8.
A rotulagem estável de isótopos por aminoácidos no método de cultura celular (SILAC) tornou-se a próxima abordagem popular para identificar e quantificar a abundância de proteínas nas amostras9. Consiste na rotulagem metabólica de células incubadas em meio sem aminoácido essencial padrão e suplementadas com uma versão rotulada por isótopo desse aminoácido específico10. A vantagem dessa técnica é sua eficiência e rotulagem precisa9. A principal limitação à abordagem do SILAC é principalmente a redução da taxa de crescimento celular causada pela incorporação de rótulos de isótopos, o que pode ser particularmente desafiador em linhas celulares relativamente sensíveis modelando doenças humanas11.
Em 2003, uma nova e robusta técnica de proteômica envolvendo etiquetas isobáricas tandem mass tag (TMT) foi introduzida no campo12. A rotulagem TMT é um método poderoso devido à sua sensibilidade aumentada para detectar níveis relativos de expressão proteica e modificações pós-transacionais13. A partir desta data de publicação, foram desenvolvidos kits TMT que podem rotular simultaneamente 6, 10, 11 ou 16 amostras. Como resultado, é possível medir a abundância de peptídeos em múltiplas condições com réplicas biológicas ao mesmo tempo14,15,16. Recentemente, utilizamos TMT para caracterizar o perfil proteômico cardíaco de um modelo de camundongo da Síndrome de Barth (BTHS)17. Ao fazê-lo, pudemos demonstrar melhora generalizada nos perfis cardíacos de camundongos BTHS tratados com terapia genética e identificar novas proteínas impactadas pelo BTHS que revelaram novas vias terapêuticas envolvidas em cardiomiopatias.
Aqui, descrevemos um método detalhado para realizar análises de proteômica quantitativa multiplex TMT usando amostras de tecido ou pelotas de células. Pode ser benéfico realizar a preparação e rotulagem da amostra antes da submissão a um núcleo porque os peptídeos tripptic rotulados são mais estáveis do que amostras congeladas cruas, nem todos os núcleos têm experiência em manusear todos os tipos de amostras, e preparar amostras em laboratório pode economizar tempo para núcleos, que muitas vezes têm longas pendências. Para obter descrições detalhadas da porção de espectroscopia de massa deste processo, consulte Kirshenbaum et al. e Perumal et al.18,19.
O protocolo de preparação da amostra consiste nas seguintes etapas principais: extração, quantificação, precipitação, digestão e rotulagem. Os principais benefícios deste protocolo otimizado são que ele reduz os custos de rotulagem, melhora a extração de proteínas e gera consistentemente dados de alta qualidade. Além disso, descrevemos como analisar dados TMT para rastrear milhares de proteínas em um curto espaço de tempo. Esperamos que este protocolo incentive outros grupos de pesquisa a considerar a incorporação dessa metodologia poderosa em seus estudos.
Para preparar com sucesso amostras para análise proteômica usando metodologias de rotulagem isótopos isobáricas baseadas em TMT, é crucial realizar extrações proteicas com muito cuidado a 4 °C e usar um tampão de lise que contenha um coquetel inibidor de protease24,25. O coquetel inibidor de protease é um reagente crucial para evitar a degradação inesperada da proteína durante a digestão proteica. Uma diferença fundamental entre nosso protocolo e o atual fornecido pelo fornecedor é que recomendamos fortemente o uso de tampão de lise CHAPS com base em nossa experiência com células e tecidos mamíferos. Também sugerimos o uso de uma abordagem de precipitação de proteína de metanol/clorofórmio para pelotas e tecidos celulares.
Idealmente, extração de proteínas, medição, tratamentos de reagente de redução/alquilação, e precipitações de metanol/clorofórmio são todas realizadas no mesmo dia. Seguindo esta recomendação resultará em concentrações proteicas mais precisas para rotulagem subsequente. O passo de precipitação proteica é importante para a remoção de reagentes que interferirão na espectrometria de massa tandem. A inclusão da etapa de precipitação aumenta significativamente a resolução do TMT26. Em suma, as principais vantagens do nosso protocolo TMT são a alta eficiência de rotulagem para diferentes tipos de amostras, sua reprodutibilidade e os dados confiáveis adquiridos.
À medida que a natureza multiplex desta estratégia de proteômica não alvo TMT continua a se expandir, ela aumentará progressivamente a capacidade dos pesquisadores em uma ampla variedade de campos para fazer novas descobertas. Especificamente no campo biomédico, nós e outros temos encontrado essa tecnologia cada vez mais informativa em estudos explorando novos mecanismos de ação em doenças e impactos relativos de diversas terapêuticas. Por todas essas razões, essa poderosa tecnologia complementa o repertório de outras abordagens de OMICS utilizadas em estudos de pesquisa modernos e fornece informações fundamentais que podem orientar o desenvolvimento terapêutico.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de reconhecer a instalação de proteômica uf-ICBR para o processamento de nossas amostras. Este trabalho foi apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde R01 HL136759-01A1 (CAP).
1 M Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 50 mL | Thermo Fisher | 90114 | Reagent for protein labeling |
50% Hydroxylamine, 5 mL | Thermo Fisher | 90115 | Reagent for protein labeling |
Acetic acid | Sigma | A6283 | Reagent for protein digestion |
Anhydrous acetonitrile, LC-MS Grade | Thermo Fisher | 51101 | Reagent for protein labeling |
Benzonaze nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | DNA shearing |
Bond-Breaker TCEP solution, 5 mL | Thermo Fisher | 77720 | Reagent for protein labeling |
BSA standard | Thermo | 23209 | Reagent for protein measurement |
CHAPS | Thermo Fisher | 28300 | Reagent for protein extraction |
Chloroform | Fisher | BP1145-1 | Reagent for protein precipitation |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 4693132001 | Reagent for protein extraction |
DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | Reagent for protein measurement |
Excel | Microsoft Office | Software for data analyses | |
Heat block | VWR analog | 12621-104 | Equipment for protein digestion incubation |
HEPES | Sigma | RDD002 | Reagent for protein extraction |
Methanol | Fisher | A452-4 | Reagent for protein precipitation |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Fisher | 90058 | Reagent for protein digestion |
Potassium chloride | Sigma | 46436 | Reagent for protein extraction |
Sigma Plot 14.0 | Sigma Plot 14.0 | Software for data analyses | |
Sonicator | Fisher Scientific | FB120 | DNA shearing |
Spectra Max i3x Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | Plate reader for protein measurement | |
Thermo Scientific Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Reagent for protein measurement |
Thermo Scientific Pierce Quantitative Fluorescent Peptide Assay | Thermo Fisher | 23290 | Reagent for protein measurement |
Thermo Scientific Proteome Discoverer Software | Thermo Fisher | OPTON-30945 | Software for data analyses |
TMT 10plex Isobaric Label Reagent Set 0.8 mg, sufficient reagents for one 10plex isobaric experiment | Thermo Fisher | 90110 | Reagent for protein labeling |
TMT11-131C Label Reagent 5 mg | Thermo Fisher | A34807 | Reagent for protein labeling |
Water, LC-MS Grade | Thermo Fisher | 51140 | Reagent for protein extraction |