Aşağıdaki adımların her biri için ayrıntılı bilgi içeren optimize edilmiş bir tandem kütle etiketi (TMT) etiketleme protokolü salıyoruz: protein ekstraksiyonu, nicelikselleştirme, yağış, sindirim, etiketleme, proteomik bir tesise teslim ve veri analizleri.
Proteomik teknolojiler, bir hastalığın, tedavinin veya diğer durumun bir bütün olarak proteom üzerindeki etkisinin küresel bir görünümünü sağlayarak biyolojik sistemlerdeki etki mekanizmalarını anlamamıza yardımcı olabilecek güçlü metodolojilerdir. Bu rapor, protein örneklerinin ayıklanması, niceleme, yağış, sindirim, etiketleme ve sonraki veri analizi için ayrıntılı bir protokol sağlar. Optimize edilmiş TMT etiketleme protokolümüz daha düşük etiket konsantrasyonu gerektirir ve sürekli olarak güvenilir veriler elde eder. Bu protokolü, çeşitli fare dokularında (kalp, iskelet kası ve beyin) ve in vitro olarak kültürlenmiş hücrelerdeki protein ekspresyonu profillerini değerlendirmek için kullandık. Buna ek olarak, ortaya çıkan veri kümesinden binlerce proteinin nasıl değerlendirileceklerini gösteriyoruz.
“Proteomik” terimi ilk olarak bir hücrenin, dokunun veyaorganizmanın 1.tümprotein komplemanının büyük ölçekli karakterizasyonu olarak tanımlanmıştır. Proteomik analizler, hastalık gelişimi, terapötik yollar ve sağlıklı sistemlerin protein ekspresyonu düzeylerinin göreceli niceliğini gerçekleştirmek için teknikler kullanarak mekanizmaların ve hücresel süreçlerin araştırılmasını sağlar2. Bu tür çalışmaların ilk açıklamaları 1975 yılında yayınlanmış ve bu amaçla iki boyutlu poliakrilamid jel elektroforez (2D-PAGE) kullanımını gösterdi1,3. 2D yöntemi, proteinleri yüke (izoelektrik odaklama, IEF) ve moleküler kütleye (sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforezi veya SDS-PAGE) göre ayırır4. Yıllar boyunca, her jel bileşeni üzerinde yapılan 2D-PAGE ve sonraki tandem kütle spektrometresi kombinasyonu yapılan en yaygın hedefsiz protein ekspresyonu analiz tekniği yapıldı ve çok sayıda daha önce bilinmeyen protein ekspresyonu profilleri tespit5,6. 2D-PAGE yaklaşımının genel dezavantajları, zaman alıcı olması, hidrofobik proteinler için iyi çalışmaması ve düşük duyarlılık nedeniyle değerlendirilen toplam protein sayısında sınırlamalar olmasıdır7,8.
Hücre kültüründe amino asitler tarafından kararlı izotop etiketleme (SILAC) yöntemi örneklerinde protein bolluğunu belirlemek ve ölçmek için bir sonraki popüler yaklaşım oldu9. Bu standart bir esansiyel amino asit yoksun orta kuluçka ve bu özel amino asit bir izotop etiketli versiyonu ile desteklenen hücrelerin metabolik etiketleme oluşur10. Bu tekniğin avantajı verimliliği ve hassas etiketleme9. SILAC yaklaşımının ana sınırlaması öncelikle izotop etiket incorporation neden azaltılmış hücre büyüme oranı, özellikle nispeten hassas hücre hatları insan hastalıkları modelleme zor olabilir11.
2003 yılında, tandem kitle etiketi (TMT) isobarik etiketleriçeren yeni ve sağlam proteomik tekniği12. TMT etiketleme, bağıl protein ekspresyonu düzeylerini ve çeviri sonrası modifikasyonları saptamak için artan duyarlılığı nedeniyle güçlü bir yöntemdir13. Bu yayın tarihi itibariyle, aynı anda 6, 10, 11 veya 16 örneği etiketleyebilen TMT kitleri geliştirilmiştir. Sonuç olarak, aynı anda biyolojik çoğaltmalar ile birden fazla koşullarda peptit bolluğunu ölçmek mümkündür14,15,16. Biz son zamanlarda Barth Sendromu (BTHS)17bir fare modelinin kardiyak proteomik profili karakterize TMT kullanılır. Bunu yaparken, gen tedavisi ile tedavi edilen BTHS farelerinin kardiyak profillerinde yaygın bir iyileşme gösterdik ve kardiyomiyopatilerde yeni tedavi yollarını ortaya koyan BTHS’den etkilenen yeni proteinleri tespit edebildik.
Burada doku örnekleri veya hücre peletleri kullanılarak çok katlı TMT kantitatif proteomik analizleri yapmak için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. Etiketli triptik peptidler ham dondurulmuş numunelerden daha kararlı olduğundan, tüm çekirdeklerin tüm numune türlerini işleme deneyimine sahip olmaması ve numunelerin laboratuvarda hazırlanması genellikle uzun biriktirme listesi olan çekirdekler için zamandan tasarruf edebileceğinden, numune hazırlama ve bir çekirdeğe gönderilmeden önce numune hazırlama ve etiketlemenin bir çekirdeğe gönderilmesi yararlı olabilir. Bu sürecin kütle spektroskopisi bölümünün ayrıntılı açıklamaları için lütfen Kirshenbaum ve Perumal ve ark.18,19.
Numune hazırlama protokolü aşağıdaki önemli adımlardan oluşur: ekstraksiyon, niceleme, yağış, sindirim ve etiketleme. Bu optimize edilmiş protokolün en önemli yararları, etiketleme maliyetlerini azaltmasıdır, protein ekstraksiyonu artırır ve sürekli olarak yüksek kaliteli veriler üretir. Buna ek olarak, tmt verilerinin kısa sürede binlerce proteini taramak için nasıl analiz edilebildiğini anlatıyoruz. Bu protokolün diğer araştırma gruplarını bu güçlü metodolojiyi çalışmalarına dahil etmeyi düşünmeye teşvik etmesini umuyoruz.
TMT tabanlı izobarik izotop etiketleme metodolojileri kullanılarak proteomik analiz için numuneleri başarılı bir şekilde hazırlamak için, protein ekstraksiyonlarını 4 °C’de çok dikkatli bir şekilde gerçekleştirmek ve proteaz inhibitörükokteyli 24,25içeren bir lisis tamponu kullanmak çok önemlidir. Proteaz inhibitörü kokteyl protein sindirimi sırasında beklenmedik protein bozulmasını önlemek için önemli bir reaktif olduğunu. Protokolümüz ile satıcı tarafından sağlanan mevcut fark arasındaki en önemli fark, memeli hücreleri ve dokuları ile ilgili deneyimimize dayanarak CHAPS lysis tamponunun kullanılmasını şiddetle tavsiye etmektir. Ayrıca hem hücre peletleri hem de dokular için metanol/kloroform protein yağış yaklaşımı kullanmanızı öneririz.
İdeal olarak, protein ekstraksiyonu, ölçümü, azaltıcı/alkilleyici reaktif tedavileri ve metanol/kloroform yağışları aynı gün yapılır. Bu önerinin ardından sonraki etiketleme için daha doğru protein konsantrasyonları neden olacaktır. Protein çökeltme adımı, tandem kütle spektrometresi ile müdahale edecek reaktiflerin uzaklaştırılması için önemlidir. Yağış adımı da dahil olmak üzere önemli ölçüde TMT26çözünürlüğünü artırır. Özetle, TMT protokolümüzün en büyük avantajları, farklı numune türleri için yüksek etiketleme verimliliği, bunun tekrarlanabilirliği ve elde edilen güvenilir verilerdir.
Bu TMT hedeflenmemiş proteomik stratejisinin çok katlı doğası genişlemeye devam ettikçe, araştırmacıların çok çeşitli alanlarda yeni keşifler yapma yeteneğini aşamalı olarak geliştirecektir. Özellikle biyomedikal alanında, biz ve diğerleri bu teknolojiyi, hastalıkta yeni eylem mekanizmalarını ve çeşitli terapötiklerin göreceli etkilerini araştıran çalışmalarda giderek daha bilgilendirici bulduk. Tüm bu nedenlerden dolayı, bu güçlü teknoloji modern araştırma çalışmalarında kullanılan diğer OMICS yaklaşımlarının repertuarını tamamlar ve daha fazla terapötik gelişime rehberlik edecek önemli bilgiler sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Uf-ICBR proteomics tesisini numunelerimizin işlenmesi için kabul etmek istiyoruz. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 HL136759-01A1 (CAP) tarafından desteklenmiştir.
1 M Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 50 mL | Thermo Fisher | 90114 | Reagent for protein labeling |
50% Hydroxylamine, 5 mL | Thermo Fisher | 90115 | Reagent for protein labeling |
Acetic acid | Sigma | A6283 | Reagent for protein digestion |
Anhydrous acetonitrile, LC-MS Grade | Thermo Fisher | 51101 | Reagent for protein labeling |
Benzonaze nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | DNA shearing |
Bond-Breaker TCEP solution, 5 mL | Thermo Fisher | 77720 | Reagent for protein labeling |
BSA standard | Thermo | 23209 | Reagent for protein measurement |
CHAPS | Thermo Fisher | 28300 | Reagent for protein extraction |
Chloroform | Fisher | BP1145-1 | Reagent for protein precipitation |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 4693132001 | Reagent for protein extraction |
DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | Reagent for protein measurement |
Excel | Microsoft Office | Software for data analyses | |
Heat block | VWR analog | 12621-104 | Equipment for protein digestion incubation |
HEPES | Sigma | RDD002 | Reagent for protein extraction |
Methanol | Fisher | A452-4 | Reagent for protein precipitation |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Fisher | 90058 | Reagent for protein digestion |
Potassium chloride | Sigma | 46436 | Reagent for protein extraction |
Sigma Plot 14.0 | Sigma Plot 14.0 | Software for data analyses | |
Sonicator | Fisher Scientific | FB120 | DNA shearing |
Spectra Max i3x Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | Plate reader for protein measurement | |
Thermo Scientific Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Reagent for protein measurement |
Thermo Scientific Pierce Quantitative Fluorescent Peptide Assay | Thermo Fisher | 23290 | Reagent for protein measurement |
Thermo Scientific Proteome Discoverer Software | Thermo Fisher | OPTON-30945 | Software for data analyses |
TMT 10plex Isobaric Label Reagent Set 0.8 mg, sufficient reagents for one 10plex isobaric experiment | Thermo Fisher | 90110 | Reagent for protein labeling |
TMT11-131C Label Reagent 5 mg | Thermo Fisher | A34807 | Reagent for protein labeling |
Water, LC-MS Grade | Thermo Fisher | 51140 | Reagent for protein extraction |