Substructure Analyzer: un flusso di lavoro facile da usare per l'esplorazione rapida e l'analisi accurata dei corpi cellulari nelle immagini di microscopia a fluorescenza
Summary
Vi presentiamo un flusso di lavoro liberamente disponibile costruito per una rapida esplorazione e analisi accurata dei corpi cellulari in specifici compartimenti cellulari in immagini di microscopia a fluorescenza. Questo flusso di lavoro user-friendly è progettato sul software open-source E utilizza anche funzionalità ImageJ. La pipeline è conveniente senza conoscere l’analisi delle immagini.
Abstract
L’ultimo decennio è stato caratterizzato da scoperte nelle tecniche di microscopia a fluorescenza illustrate dal miglioramento della risoluzione spaziale, ma anche nell’imaging a cellule vive e nelle tecniche di microscopia ad alto consumo. Ciò ha portato ad un costante aumento della quantità e della complessità dei dati di microscopia per un singolo esperimento. Poiché l’analisi manuale dei dati di microscopia richiede molto tempo, soggettiva e proibisce l’analisi quantitativa, l’automazione dell’analisi delle immagini biologiche sta diventando quasi inevitabile. Abbiamo costruito un flusso di lavoro informatico chiamato Substructure Analyzer per automatizzare completamente l’analisi del segnale in bioimmagini dalla microscopia fluorescente. Questo flusso di lavoro è sviluppato sulla piattaforma open source user-friendly Icy ed è completato da funzionalità da ImageJ. Esso comprende la pre-elaborazione delle immagini per migliorare il rapporto segnale-rumore, la segmentazione individuale delle cellule (rilevamento dei confini cellulari) e la rilevazione/quantificazione dei corpi cellulari arricchiti in specifici compartimenti cellulari. Il vantaggio principale di questo flusso di lavoro è quello di proporre complesse funzionalità di bio-imaging agli utenti senza esperienza di analisi delle immagini attraverso un’interfaccia user-friendly. Inoltre, è altamente modulare e adattato a diverse questioni, dalla caratterizzazione della traslocazione nucleare/citoplasmatica all’analisi comparativa di diversi corpi cellulari in diverse sottostrutture cellulari. La funzionalità di questo flusso di lavoro è illustrata attraverso lo studio dei corpi Cajal (coiled) in condizioni di sollecitazione ossidativa (OS). I dati della microscopia a fluorescenza mostrano che la loro integrità nelle cellule umane è influenzata poche ore dopo l’induzione del sistema operativo. Questo effetto è caratterizzato da una diminuzione della nucleazione della bobina nei corpi cajal caratteristici, associata a una ridistribuzione nucleoplasmica della bobina in un numero maggiore di focolai più piccoli. Il ruolo centrale della bobina nello scambio tra i componenti CB e il nucleoplasmo circostante suggerisce che la ridistribuzione della bobina indotta dall’OS potrebbe influenzare la composizione e la funzionalità dei corpi cajal.
Introduction
La microscopia leggera e, più in particolare, la microscopia a fluorescenza sono tecniche robuste e versatili comunemente utilizzate nelle scienze biologiche. Danno accesso alla localizzazione precisa di varie biomolecole come proteine o RNA attraverso la loro specifica etichettatura fluorescente. L’ultimo decennio è stato caratterizzato da rapidi progressi nelle tecnologie di microscopia e imaging, come dimostra il Premio Nobel 2014 per la chimica che ha assegnato Eric Betzig, Stefan W. Hell e William E. Moerner per lo sviluppo della microscopia a fluorescenza super risolta (SRFM)1. SFRM bypassa il limite di diffrazione della microscopia ottica tradizionale per portarla nella nanodimensione. Il miglioramento di tecniche come l’imaging live o gli approcci di screening ad alta velocità effettiva aumenta anche la quantità e la complessità dei dati da trattare per ogni esperimento. La maggior parte del tempo, i ricercatori si trovano di fronte ad alte popolazioni eterogenee di cellule e vogliono analizzare i fenotipi a livello di singola cellula.
Inizialmente, analisi come il conteggio dei foci sono state eseguite a occhio, che è preferito da alcuni ricercatori in quanto fornisce il pieno controllo visivo sul processo di conteggio. Tuttavia, l’analisi manuale di tali dati richiede troppo tempo, porta a variabilità tra gli osservatori e non consente l’accesso a funzionalità più complesse in modo che gli approcci assistiti da computer stiano diventando ampiamente utilizzati e quasi inevitabili2. I metodi di bioimmagine informatica aumentano notevolmente l’efficienza dell’analisi dei dati e sono liberi dall’inevitabile soggettività dell’operatore e dalla potenziale distorsione dell’analisi di conteggio manuale. L’aumento della domanda in questo campo e il miglioramento della potenza informatica hanno portato allo sviluppo di un gran numero di piattaforme di analisi delle immagini. Alcuni di loro sono liberamente disponibili e danno accesso a vari strumenti per eseguire analisi con personal computer. Una classificazione degli strumenti ad accesso aperto è stata recentemente stabilita3 e presenta Icy4 come un potente software che combina usabilità e funzionalità. Inoltre, Icy ha il vantaggio di comunicare con ImageJ.
Per gli utenti senza esperienza nell’analisi delle immagini, gli ostacoli principali sono scegliere lo strumento appropriato in base ai parametri problematici e sintonizzati correttamente che spesso non sono ben compresi. Inoltre, i tempi di installazione sono spesso lunghi. Icy propone un’interfaccia user-and-click denominata “Protocols” per sviluppare il flusso di lavoro combinando alcuni plugin che si trovano all’interno di una raccolta esaustiva4. Il design modulare flessibile e l’interfaccia point-and-click rendono possibile l’impostazione di un’analisi per i non programmatori. Qui presentiamo un flusso di lavoro chiamato Substructure Analyzer, sviluppato nell’interfaccia di Icy, la cui funzione è quella di analizzare i segnali fluorescenti in specifici compartimenti cellulari e misurare diverse caratteristiche come luminosità, numero foci, dimensione del foci e distribuzione spaziale. Questo flusso di lavoro affronta diversi problemi come la quantificazione della traslocazione del segnale, l’analisi delle cellule trasfette che esprimono un reporter fluorescente o l’analisi dei foci da diverse sottostrutture cellulari nelle singole cellule. Consente l’elaborazione simultanea di più immagini e i risultati di output vengono esportati in un foglio di lavoro delimitato da tabulazioni che può essere aperto in programmi di fogli di calcolo di uso comune.
La pipeline dell’analizzatore di sottostruttura è illustrata nella Figura 1. In primo luogo, tutte le immagini contenute in una cartella specificata vengono pre-elaborate per migliorare il loro rapporto segnale-rumore. Questo passaggio aumenta l’efficienza dei passaggi seguenti e riduce il tempo di esecuzione. Quindi, le regioni di interesse (ROI), corrispondenti alle aree dell’immagine in cui il segnale fluorescente deve essere rilevato, vengono identificate e segmentate. Infine, il segnale fluorescente viene analizzato e i risultati vengono esportati in un foglio di lavoro delimitato da tabulazioni.
La segmentazione degli oggetti (rilevamento dei confini) è il passo più impegnativo nell’analisi delle immagini e la sua efficienza determina l’accuratezza delle misurazioni delle celle risultanti. I primi oggetti identificati in un’immagine (chiamati oggetti primari) sono spesso nuclei da immagini macchiate di DNA (colorazione DAPI o Hoechst), anche se gli oggetti primari possono anche essere cellule intere, perline, macchie, tumori o qualsiasi altro oggetto macchiato. Nella maggior parte delle immagini biologiche, cellule o nuclei si toccano o si sovrappongono causando il fallimento degli algoritmi semplici e veloci. Ad oggi, nessun algoritmo universale può eseguire una segmentazione perfetta di tutti gli oggetti, soprattutto perché le loro caratteristiche (dimensioni, forma o trama) modulano l’efficienza della segmentazione5. Gli strumenti di segmentazione comunemente distribuiti con il software di microscopia (come il MetaMorph Imaging Software di Molecular Devices6o il software NIS-Elements Advances Research di Nikon7) sono generalmente basati su tecniche standard come la corrispondenza di correlazione, la soglia o le operazioni morfologiche. Sebbene efficienti nei sistemi di base, questi metodi sovrageneralizzati presentano rapidamente limitazioni se utilizzati in contesti più impegnativi e specifici. In effetti, la segmentazione è altamente sensibile ai parametri sperimentali come il tipo di cellula, la densità delle cellule o i biomarcatori e spesso richiede una regolazione ripetuta per un set di dati di grandi dimensioni. Il flusso di lavoro Substructure Analyzer integra algoritmi semplici e più sofisticati per proporre diverse alternative adattate alla complessità dell’immagine e alle esigenze degli utenti. Propone in particolare l’algoritmo del bacino idrografico basato su marcatori8 per gli oggetti altamente raggruppati. L’efficienza di questo metodo di segmentazione si basa sulla selezione di singoli marcatori su ogni oggetto. Questi marcatori vengono scelti manualmente la maggior parte del tempo per ottenere i parametri corretti per la segmentazione completa, che richiede molto tempo quando gli utenti devono affrontare un numero elevato di oggetti. Substructure Analyzer propone un rilevamento automatico di questi marcatori, fornendo un processo di segmentazione altamente efficiente. La segmentazione è, nella maggior parte dei tempi, la fase limitante dell’analisi dell’immagine e può modificare notevolmente il tempo di elaborazione a seconda della risoluzione dell’immagine, del numero di oggetti per immagine e del livello di clustering degli oggetti. Le pipeline tipiche richiedono da pochi secondi a 5 minuti per immagine in un computer desktop standard. L’analisi di immagini più complesse può richiedere un computer più potente e alcune conoscenze di base nell’analisi delle immagini.
La flessibilità e la funzionalità di questo flusso di lavoro sono illustrate con vari esempi nei risultati rappresentativi. I vantaggi di questo flusso di lavoro sono mostrati in particolare attraverso lo studio di sottostrutture nucleari in condizioni di stress ossidativo (OS). OS corrisponde a uno squilibrio dell’omeostasi redox a favore di ossidanti ed è associato ad alti livelli di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Poiché il ROS agisce come molecole di segnalazione, i cambiamenti nella loro concentrazione e localizzazione subcellulare influenzano positivamente o negativamente una miriade di percorsi e reti che regolano le funzioni fisiologiche, tra cui la trasduzione del segnale, i meccanismi di riparazione, l’espressione genica, la morte cellulare e la proliferazione9,10. OS è quindi direttamente coinvolto in varie patologie (malattie neurodegenerative e cardiovascolari, tumori, diabete, ecc),), ma anche l’invecchiamento cellulare. Pertanto, decifrare le conseguenze del sistema operativo sull’organizzazione e la funzione della cellula umana costituisce un passo cruciale nella comprensione dei ruoli del sistema operativo nell’insorgenza e nello sviluppo delle patologie umane. È stato stabilito che l’OS regola l’espressione genica modulando la trascrizione attraverso diversi fattori di trascrizione (p53, Nrf2, FOXO3A)11, ma anche influenzando la regolazione di diversi processi co- e post-trascrizione come lo splicing alternativo (AS) dei pre-RNA12,13,14. Lo splicing alternativo delle trascrizioni primarie e non codificanti è un meccanismo essenziale che aumenta la capacità di codifica dei genomi producendo isoforme di trascrizione. AS è eseguita da un enorme complesso di ribonucleoproteina chiamato spliceosome, contenente quasi 300 proteine e 5 RNA nucleari piccoli ricchi di U (UsnRNA)15. L’assemblaggio spliceo e l’AS sono strettamente controllati nelle cellule e alcuni passi della maturazione sillimitata si verificano all’interno di compartimenti nucleari senza membrana chiamati Cajal Bodies. Queste sottostrutture nucleari sono caratterizzate dalla natura dinamica della loro struttura e dalla loro composizione, che sono principalmente condotte da interazioni multivalenti del loro RNA e componenti proteici con la proteina della coilina. L’analisi di migliaia di celle con il flusso di lavoro Substructure Analyzer ha consentito la caratterizzazione degli effetti mai descritti del sistema operativo sui corpi di Cajal. Infatti, i dati ottenuti suggeriscono che l’OS modifica la nucleazione dei corpi di Cajal, inducendo una ridistribuzione nucleoplasmica della proteina coilina in numerosi focolai nucleari più piccoli. Tale cambiamento della struttura dei corpi cajal potrebbe influenzare la maturazione dello spliceo some e partecipare alla modulazione AS da OS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un numero crescente di strumenti software liberi è disponibile per l’analisi delle immagini delle cellule a fluorescenza. Gli utenti devono scegliere correttamente il software adeguato in base alla complessità del loro problema, alle loro conoscenze nell’elaborazione delle immagini e al tempo che vogliono trascorrere nella loro analisi. Icy, CellProfiler o ImageJ/Fiji sono potenti strumenti che combinano sia l’usabilità che la funzionalità3. Icy è uno strumento autonomo che presenta una chiar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
G.H. è stato sostenuto da una borsa di studio della Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies. L.H. è stata sostenuta da una borsa di studio universitaria dell’Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL), mentre Q.T. è stata sostenuta da una sovvenzione pubblica supervisionata dall’Agenzia nazionale francese di ricerca (ANR) come parte del secondo programma “Investissements d’Avenir” FIGHT-HF (riferimento: ANR-15-RHU4570004). Questo lavoro è stato finanziato dal CNRS e dall’Università di Lorraine (UMR 7365).
Materials
| 16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | to fix the cells |
| Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21425 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A34055 | fluorescent secondary antibody |
| Bovine serum albumin standard (BSA) | euromedex | 04-100-812-E | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796-500ml | cell culture medium |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040-5ML | mounting medium |
| Human: HeLa S3 cells | IGBMC, Strasbourg, France | cell line used to perform the experiments | |
| Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2) | Sigma-Aldrich | H1009-100ml | used as a stressing agent |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | transfection reagent |
| Mouse monoclonal anti-coilin | abcam | ab11822 | Coilin-specific antibody |
| Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope | Nikon | epifluoresecence microscope | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | transfection medium |
| PBS pH 7.4 (10x) | gibco | 70011-036 | to wash the cells |
| Rabbit polyclonal anti-53BP1 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16565 | 53BP1-specific antibody |
| Rabbit polyclonal anti-EDC4 | Sigma-Aldrich | SAB4200114 | EDC4-specific antibody |
| Triton X-100 | Roth | 6683 | to permeabilize the cells |
References
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