サブ構造アナライザー:蛍光顕微鏡画像における細胞体の迅速な探査と正確な分析のためのユーザフレンドリーなワークフロー
Summary
蛍光顕微鏡画像で特定の細胞区画内の細胞体を迅速に探査し、正確に分析するために構築された自由に利用可能なワークフローを提示します。このユーザーフレンドリーなワークフローはオープンソースソフトウェアのIcy上で設計され、また、ImageJの機能を使用しています。パイプラインは、画像解析に関する知識なしに手頃な価格です。
Abstract
過去10年間は、空間分解能の向上だけでなく、ライブセルイメージングおよびハイスループット顕微鏡技術においても示された蛍光顕微鏡技術のブレークスルーによって特徴付けられています。これにより、1回の実験での顕微鏡データの量と複雑さが一定に増加しました。顕微鏡データの手動分析は非常に時間がかかり、主観的で、定量的な分析が禁止されているため、バイオイメージ解析の自動化はほとんどやむを得なくなっています。蛍光顕微鏡によるバイオイメージのシグナル解析を完全に自動化するサブストラクチャアナライザと呼ばれる情報学ワークフローを構築しました。このワークフローは、ユーザーフレンドリーなオープンソースプラットフォームIcy上で開発され、ImageJの機能によって完了されます。信号対雑音比を改善するための画像の前処理、細胞の個別のセグメンテーション(細胞境界の検出)、特定の細胞コンパートメントに富んだ細胞体の検出/定量化が含まれます。このワークフローの主な利点は、ユーザーフレンドリーなインターフェースを介して、画像解析の専門知識を持たないユーザーに複雑なバイオイメージング機能を提案することです。さらに、それは非常にモジュール化され、異なる細胞のサブ構造の異なる細胞体の比較分析に核/細胞質転位の特徴付けからいくつかの問題に適応する。このワークフローの機能は酸化ストレス(OS)条件下でのカハル(コイル状)体の研究を通して示される。蛍光顕微鏡のデータは、ヒト細胞におけるその完全性がOSの誘導の数時間後に影響を受けることを示している。この効果は、コイリンの核分裂が特徴カジャール体に減少し、小さな病巣の増加にコイリンの核内再分配に関連することを特徴とする。CB成分と周囲核内核形成との交換におけるコイリンの中心的な役割は、OSによるコイリンの再分配がカハル体の組成および機能に影響を及ぼす可能性があることを示唆している。
Introduction
光顕微鏡、そしてより具体的には、蛍光顕微鏡は、生物科学で一般的に使用される堅牢で汎用性の高い技術です。タンパク質やRNAなどの様々な生体分子の特異的蛍光標識を通じて、正確に局在化できます。過去10年間は、超解決蛍光顕微鏡(SRFM)の開発のためにエリック・ベッツィヒ、ステファン・W・ヘル、ウィリアム・E・モアナーを受賞した2014年のノーベル化学賞によって証明された顕微鏡および画像技術の急速な進歩によって特徴付けられています。SFRMは、従来の光学顕微鏡の回折限界をバイパスしてナノ次元に持ち込みます。ライブイメージングやハイスループットスクリーニングアプローチなどの技術の改善は、各実験で扱うデータの量と複雑度も増加します。ほとんどの場合、研究者は細胞の高い不均一な集団に直面しており、単一細胞レベルでの発現型の分析を望んでいます。
当初、病巣計数などの分析は目で行われ、カウントプロセスを完全に視覚的に制御できるため、一部の研究者が好む。しかし、このようなデータの手動分析は時間がかかりすぎて、観察者間の変動を招き、より複雑な機能にアクセスすることは不可能であり、コンピュータ支援アプローチが広く使用されるようになり、ほとんどやむを得ない2。バイオイメージ情報学的手法は、データ分析の効率を大幅に向上させ、手動計数解析の不可避的なオペレータの主観性と潜在的バイアスを含まない。この分野での需要の増加とコンピュータのパワーの向上は、多数の画像解析プラットフォームの開発につながりました。一部は自由に利用でき、パーソナルコンピュータで分析を行うための様々なツールにアクセスできます。オープンアクセスツールの分類は最近確立されています3そして、使いやすさと機能を組み合わせた強力なソフトウェアとしてIcy4を提示.さらに、アイシーはImageJと通信する利点があります。
サブ構造アナライザーパイプラインは図 1に示されています。まず、指定されたフォルダに含まれるすべての画像が事前処理され、信号とノイズの比率が向上します。この手順により、次の手順の効率が向上し、実行時間が短縮されます。次に、蛍光シグナルが検出されるべき画像領域に対応する対象領域(ROI)を特定し、セグメント化する。最後に蛍光シグナルを分析し、その結果をタブ区切りのワークシートにエクスポートします。
オブジェクトのセグメンテーション(境界の検出)は、画像解析の中で最も困難なステップであり、その効率によって得られる細胞測定の精度が決まります。画像内で最初に同定された物体(主体物体と呼ばれる)は、しばしばDNA染色画像(DAPIまたはHoechst染色)からの核であるが、主な物体は細胞全体、ビーズ、斑点、腫瘍、または染色された物体である可能性もある。ほとんどの生物学的画像では、細胞または核が互いに接触したり、重なり合ったりして、単純で速いアルゴリズムが失敗します。現在までに、ユニバーサルアルゴリズムは、すべてのオブジェクトの完全なセグメンテーションを実行することはできません。5一般的に顕微鏡ソフトウェア(分子デバイス6によるMetaMorphイメージングソフトウェア、ニコン7によるNIS-Elements Advances Researchソフトウェアなど)で配布されるセグメンテーションツールは、一般的に相関マッチング、閾値、形態演算などの標準的な手法に基づいています。基本的なシステムでは効率的ですが、これらの一般化された方法は、より困難で特定のコンテキストで使用すると、急速に限界を提示します。実際、セグメンテーションは、細胞タイプ、細胞密度、バイオマーカーなどの実験パラメータに対して高感度であり、大きなデータセットに対して繰り返し調整を必要とする場合が多い。Substructure Analyzerワークフローは、シンプルで洗練されたアルゴリズムの両方を統合し、画像の複雑さとユーザーのニーズに合わせたさまざまな選択肢を提案します。特に、高度にクラスター化されたオブジェクトに対するマーカーベースの流域アルゴリズム8を提案しています。このセグメンテーション方法の効率は、各オブジェクトの個々のマーカーの選択に依存します。これらのマーカーは、ほとんどの場合、ユーザーが多数のオブジェクトに直面する場合に非常に時間がかかる、完全なセグメンテーションのための正しいパラメータを取得するために手動で選択されます。サブストラクチャアナライザは、これらのマーカーの自動検出を提案し、高効率のセグメンテーションプロセスを提供します。セグメンテーションは、ほとんどの場合、画像解析の制限ステップであり、画像の解像度、画像あたりのオブジェクト数、およびオブジェクトのクラスタリングのレベルに応じて処理時間を大幅に変更できます。標準的なパイプラインでは、標準のデスクトップ コンピューターでイメージあたり数秒から 5 分を必要とします。より複雑な画像の解析には、より強力なコンピュータと画像解析の基本的な知識が必要になる場合があります。
このワークフローの柔軟性と機能性は、代表的な結果にさまざまな例を示しています。このワークフローの利点は、酸化ストレス(OS)条件下での核下構造の研究を通じて顕著に表示されます。OSは酸化剤を支持する酸化還元恒常性の不均衡に対応し、高レベルの活性酸素種(ROS)に関連付けられている。ROSはシグナル伝達分子として作用するので、それらの濃度および細胞内局在の変化は、シグナル伝達、修復機構、遺伝子発現、細胞死、増殖を含む生理機能を調節する無数の経路およびネットワークにプラスまたは負の影響を及9,ぼす。OSは、様々な病理(神経変性、心血管疾患、癌、糖尿病など)に直接関与するが、細胞老化にも関与している。したがって、ヒト細胞の組織と機能に及ぼすOSの結果を解読することは、ヒト病理の発症および発達におけるOSの役割を理解する上で重要なステップとなる。OSは、いくつかの転写因子(p53、Nrf2、FOXO3A)11を介して転写を調節することによって遺伝子発現を調節することが確立されている11が、また、RNA12、13、14,13,14の代替スプライシング(AS)などのいくつかの共転写および転写後プロセスの調節に影響を与えることによっても確立されている。一次符号化および非コード転写物の代替スプライシングは、トランスクリプトアイソフォームを産生することによってゲノムのコード容量を増加させる不可欠なメカニズムである。ASは、スプライセオソームと呼ばれる巨大なリボヌクレオタンパク質複合体によって行われ、ほぼ300個のタンパク質および5つのUリッチ15な小型核RNA(UsnRNA)15を含む。スプライセオソームアセンブリとASは細胞内で厳しく制御されており、スプライセサム成熟のいくつかのステップは、カハルボディと名付けられた膜のない核コンパートメント内で起こる。これらの核下構造は、その構造の動的性質とそれらの組成によって特徴付けられるもので、主にそれらのRNAとタンパク質成分とコイリンタンパク質との多価相互作用によって行われる。Substructure Analyzerワークフローを使用して何千ものセルを分析すると、CAJALボディに対するOSの影響を説明したことがないという特徴付けが可能になりました。実際、得られたデータは、OSがカハル体の核形成を変え、コイリンタンパク質の核内再分配を多数の小さな核病巣に誘導することを示唆している。カハルボディの構造のこのような変化は、スプライセソームの成熟に影響を与え、OSによるAS変調に参加する可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
蛍光細胞画像の解析には、ますます多くのフリーソフトウェアツールが利用できます。ユーザーは、問題の複雑さ、画像処理の知識、および分析に費やす時間に応じて適切なソフトウェアを正しく選択する必要があります。アイシー、セルプロファイル、または ImageJ/フィジーは、ユーザビリティと機能性の両方を組み合わせた強力なツールです 3.Icy は、明確なグラフィカ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
G.H.は、ミニステール・デレジェ・ア・ラ・レシェルシュ・エ・オ・テクノロジーズの大学院フェローシップによって支えられていました。L.H.はロレーヌ研究所(ICL)の大学院フェローシップによって支えられましたが、Q.T.は第2回「投資ダベニール」プログラムFIGHT-HF(参照:ANR-15-RHU457000)の一環としてフランス国家研究庁(ANR)が監督する公的助成金によって支援されました。この作品は、CNRSとロレーヌ大学(UMR 7365)によって資金提供されました。
Materials
| 16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | to fix the cells |
| Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21425 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A34055 | fluorescent secondary antibody |
| Bovine serum albumin standard (BSA) | euromedex | 04-100-812-E | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796-500ml | cell culture medium |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040-5ML | mounting medium |
| Human: HeLa S3 cells | IGBMC, Strasbourg, France | cell line used to perform the experiments | |
| Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2) | Sigma-Aldrich | H1009-100ml | used as a stressing agent |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | transfection reagent |
| Mouse monoclonal anti-coilin | abcam | ab11822 | Coilin-specific antibody |
| Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope | Nikon | epifluoresecence microscope | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | transfection medium |
| PBS pH 7.4 (10x) | gibco | 70011-036 | to wash the cells |
| Rabbit polyclonal anti-53BP1 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16565 | 53BP1-specific antibody |
| Rabbit polyclonal anti-EDC4 | Sigma-Aldrich | SAB4200114 | EDC4-specific antibody |
| Triton X-100 | Roth | 6683 | to permeabilize the cells |
References
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