Analizador de Subestructuras: Un flujo de trabajo amigable para el usuario para la exploración rápida y el análisis preciso de los cuerpos celulares en imágenes de microscopía de fluorescencia
Summary
Presentamos un flujo de trabajo de libre disposición construido para la exploración rápida y el análisis preciso de cuerpos celulares en compartimentos celulares específicos en imágenes de microscopía de fluorescencia. Este flujo de trabajo fácil de usar está diseñado en el software de código abierto Icy y también utiliza funcionalidades ImageJ. La canalización es asequible sin conocimientos en el análisis de imágenes.
Abstract
La última década se ha caracterizado por avances en las técnicas de microscopía de fluorescencia ilustradas por la mejora de la resolución espacial, pero también en las técnicas de imagen de células vivas y microscopía de alto rendimiento. Esto condujo a un aumento constante en la cantidad y complejidad de los datos de la microscopía para un solo experimento. Debido a que el análisis manual de los datos de la microscopía consume mucho tiempo, es subjetivo y prohíbe los análisis cuantitativos, la automatización del análisis de bioimagen se está volviendo casi inevitable. Construimos un flujo de trabajo informático llamado Substructure Analyzer para automatizar completamente el análisis de señales en bioimagens a partir de microscopía fluorescente. Este flujo de trabajo se desarrolla en la plataforma de código abierto fácil de usar Icy y se completa con las funcionalidades de ImageJ. Incluye el preprocesamiento de imágenes para mejorar la relación señal-ruido, la segmentación individual de celdas (detección de límites celulares) y la detección/cuantificación de cuerpos celulares enriquecidos en compartimentos celulares específicos. La principal ventaja de este flujo de trabajo es proponer complejas funcionalidades de bioimagen a los usuarios sin experiencia en análisis de imágenes a través de una interfaz fácil de usar. Además, es altamente modular y se adapta a varias cuestiones desde la caracterización de la translocación nuclear/citoplasmático hasta el análisis comparativo de diferentes cuerpos celulares en diferentes subefilas celulares. La funcionalidad de este flujo de trabajo se ilustra a través del estudio de los cuerpos Deles (bobinados) en condiciones de estrés oxidativo (OS). Los datos de la microscopía de fluorescencia muestran que su integridad en las células humanas se ve afectada unas horas después de la inducción del sistema operativo. Este efecto se caracteriza por una disminución de la nucleación de bobina en cuerpos típicos de Cajal, asociado con una redistribución nucleoplasmica de bobina en un mayor número de focos más pequeños. El papel central de la bobina en el intercambio entre los componentes CB y el nucleoplasmo circundante sugiere que la redistribución inducida por el sistema operativo de bobinado podría afectar la composición y la funcionalidad de Los cuerpos de Cajal.
Introduction
La microscopía ligera y, más particularmente, la microscopía de fluorescencia son técnicas robustas y versátiles comúnmente utilizadas en las ciencias biológicas. Dan acceso a la localización precisa de varias biomoléculas como proteínas o ARN a través de su etiquetado fluorescente específico. La última década se ha caracterizado por rápidos avances en las tecnologías de microscopía e imagen, como lo demuestra el Premio Nobel de Química 2014 que otorga a Eric Betzig, Stefan W. Hell y William E. Moerner por el desarrollo de la microscopía de fluorescencia superconsuelta (SRFM)1. SFRM evita el límite de difracción de la microscopía óptica tradicional para incorporarlo a la nanodimensión. La mejora de técnicas como la imagen en vivo o los enfoques de detección de alto rendimiento también aumenta la cantidad y la complejidad de los datos que se deben tratar para cada experimento. La mayoría de las veces, los investigadores se enfrentan a altas poblaciones heterogéneas de células y quieren analizar fenotipos a nivel de una sola célula.
Inicialmente, análisis como el conteo de focos fueron realizados a simple vista, lo que es preferido por algunos investigadores ya que proporciona un control visual completo sobre el proceso de conteo. Sin embargo, el análisis manual de estos datos consume demasiado tiempo, conduce a la variabilidad entre los observadores y no da acceso a características más complejas para que los enfoques asistidos por ordenador se estén volviendo ampliamente utilizados y casi inevitables2. Los métodos informáticos bioimagen aumentan sustancialmente la eficiencia del análisis de datos y están libres de la subjetividad inevitable del operador y el sesgo potencial del análisis de recuento manual. El aumento de la demanda en este campo y la mejora de la potencia informática llevaron al desarrollo de un gran número de plataformas de análisis de imágenes. Algunos de ellos están disponibles de forma gratuita y dan acceso a varias herramientas para realizar análisis con ordenadores personales. Recientemente se ha establecido una clasificación de herramientas de acceso abierto3 y presenta Icy4 como un potente software que combina facilidad de uso y funcionalidad. Además, Icy tiene la ventaja de comunicarse con ImageJ.
Para los usuarios sin experiencia en análisis de imágenes, los principales obstáculos son elegir la herramienta adecuada de acuerdo con los parámetros problemáticos y de ajuste correcto que a menudo no se entienden bien. Además, los tiempos de configuración suelen ser largos. Icy propone una interfaz fácil de usar de apuntar y hacer clic llamada “Protocolos” para desarrollar el flujo de trabajo mediante la combinación de algunos plugins que se encuentran dentro de una colección exhaustiva4. El diseño modular flexible y la interfaz de apuntar y hacer clic hacen que la configuración de un análisis sea factible para los no programadores. Aquí presentamos un flujo de trabajo llamado Substructure Analyzer,desarrollado en la interfaz de Icy, cuya función es analizar señales fluorescentes en compartimentos celulares específicos y medir diferentes características como brillo, número de focos, tamaño de los focos y distribución espacial. Este flujo de trabajo aborda varios problemas como la cuantificación de la translocación de la señal, el análisis de células trans infectadas que expresan a un reportero fluorescente o el análisis de focos de diferentes subestructuras celulares en células individuales. Permite el procesamiento simultáneo de varias imágenes, y los resultados de salida se exportan a una hoja de trabajo delimitada por tabulaciones que se puede abrir en programas de hoja de cálculo de uso común.
La canalización Analizador de subestructuras se presenta en la Figura 1. En primer lugar, todas las imágenes contenidas en una carpeta especificada se procesan previamente para mejorar su relación señal/ruido. Este paso aumenta la eficiencia de los pasos siguientes y disminuye el tiempo de ejecución. A continuación, se identifican y segmentan las Regiones de Interés (ROI), correspondientes a las áreas de imagen donde se debe detectar la señal fluorescente. Por último, se analiza la señal fluorescente y los resultados se exportan a una hoja de cálculo delimitada por tabulaciones.
La segmentación de objetos (detección de límites) es el paso más difícil en el análisis de imágenes, y su eficiencia determina la precisión de las mediciones de celda resultantes. Los primeros objetos identificados en una imagen (llamados objetos primarios) son a menudo núcleos de imágenes manchadas de ADN (tinción DAPI o Hoechst), aunque los objetos primarios también pueden ser células enteras, cuentas, motas, tumores o cualquier objeto manchado. En la mayoría de las imágenes biológicas, las células o núcleos se tocan entre sí o se superponen haciendo que los algoritmos simples y rápidos fallen. Hasta la fecha, ningún algoritmo universal puede realizar una segmentación perfecta de todos los objetos, principalmente porque sus características (tamaño, forma o textura) modulan la eficiencia de la segmentación5. Las herramientas de segmentación comúnmente distribuidas con software de microscopía (como MetaMorph Imaging Software de Molecular Devices6o el software NIS-Elements Advances Research de Nikon7)se basan generalmente en técnicas estándar como la coincidencia de correlaciones, umbrales u operaciones morfológicas. Aunque son eficientes en los sistemas básicos, estos métodos sobregeneracionalizados presentan rápidamente limitaciones cuando se utilizan en contextos más desafiantes y específicos. De hecho, la segmentación es muy sensible a parámetros experimentales como el tipo de celda, la densidad de celdas o los biomarcadores, y con frecuencia requiere un ajuste repetido para un conjunto de datos grande. El flujo de trabajo de Substructure Analyzer integra algoritmos simples y más sofisticados para proponer diferentes alternativas adaptadas a la complejidad de la imagen y a las necesidades del usuario. En particular, propone el algoritmo de cuenca hidrográfica basada en marcadores8 para objetos altamente agrupados. La eficiencia de este método de segmentación se basa en la selección de marcadores individuales en cada objeto. Estos marcadores se eligen manualmente la mayor parte del tiempo para obtener los parámetros correctos para la segmentación completa, lo que consume mucho tiempo cuando los usuarios se enfrentan a un gran número de objetos. Substructure Analyzer propone una detección automática de estos marcadores, proporcionando un proceso de segmentación altamente eficiente. La segmentación es, la mayor parte del tiempo, el paso limitante del análisis de imágenes y puede modificar considerablemente el tiempo de procesamiento en función de la resolución de la imagen, el número de objetos por imagen y el nivel de agrupación en clústeres de objetos. Las canalizaciones típicas requieren de unos segundos a 5 minutos por imagen en un equipo de escritorio estándar. El análisis de imágenes más complejas puede requerir un ordenador más potente y algunos conocimientos básicos en el análisis de imágenes.
La flexibilidad y la funcionalidad de este flujo de trabajo se ilustran con varios ejemplos en los resultados representativos. Las ventajas de este flujo de trabajo se muestran notablemente a través del estudio de subestructuras nucleares en condiciones de estrés oxidativo (OS). El sistema operativo corresponde a un desequilibrio de la homeostasis redox en favor de los oxidantes y se asocia con altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS). Dado que ROS actúa como moléculas de señalización, los cambios en su concentración y localización subcelular afectan positiva o negativamente a una miríada de vías y redes que regulan las funciones fisiológicas, incluyendo la transducción de señales, los mecanismos de reparación, la expresión génica, la muerte celular y la proliferación9,,10. Por lo tanto, el sistema operativo participa directamente en diversas patologías (enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares, cánceres, diabetes, etc.), pero también en el envejecimiento celular. Por lo tanto, descifrar las consecuencias del sistema operativo en la organización y función de la célula humana constituye un paso crucial en la comprensión de las funciones del sistema operativo en la aparición y desarrollo de patologías humanas. Se ha establecido que el sistema operativo regula la expresión génica mediante la modulación de la transcripción a través de varios factores de transcripción (p53, Nrf2, FOXO3A)11,pero también afectando a la regulación de varios procesos co- y post-transcripción como el empalme alternativo (AS) de pre-RNAs12,,13,14. El empalme alternativo de transcripciones de codificación primaria y no codificación es un mecanismo esencial que aumenta la capacidad de codificación de los genomas mediante la producción de isoformas de transcripción. As es realizado por un enorme complejo de ribonucleoproteína llamado spliceosoma, que contiene casi 300 proteínas y 5 PEQUEÑOS ARN nucleares (UsnRNAs) ricos en U15. El ensamblaje de empalmes y AS están estrechamente controlados en las células y algunos pasos de la maduración del empalme ocurren dentro de compartimentos nucleares sin membrana llamados Cuerpos Cajales. Estas subestructuras nucleares se caracterizan por la naturaleza dinámica de su estructura y su composición, que se llevan a cabo principalmente por interacciones multivalentes de sus componentes de ARN y proteína con la proteína coilin. El análisis de miles de celdas con el flujo de trabajo de Substructure Analyzer permitió caracterizar los efectos nunca descritos del sistema operativo en Los cuerpos de Cajal. De hecho, los datos obtenidos sugieren que el sistema operativo modifica la nucleación de los cuerpos de Cajal, induciendo una redistribución nucleoplasmica de la proteína de bobina en numerosos focos nucleares más pequeños. Tal cambio de la estructura de los Cuerpos de Cajales podría afectar a la maduración del empalme y participar en la modulación AS por el sistema operativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un número cada vez mayor de herramientas de software libre están disponibles para el análisis de imágenes de celdas de fluorescencia. Los usuarios deben elegir correctamente el software adecuado de acuerdo con la complejidad de su problema, a su conocimiento en el procesamiento de imágenes, y al tiempo que quieren pasar en su análisis. Icy, CellProfiler o ImageJ/Fiji son potentes herramientas que combinan facilidad de uso y funcionalidad3. Icy es una herramienta independiente que presenta un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
G.H. fue apoyado por una beca de posgrado de la Ministére Délégué a la Recherche et aux Technologies. L.H. fue apoyado por una beca de posgrado del Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL), mientras que Q.T. fue apoyado por una subvención pública supervisada por la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR) como parte del segundo programa “Investissements d’Avenir” FIGHT-HF (referencia: ANR-15-RHU4570004). Esta obra fue financiada por el CNRS y la Universidad de Lorena (UMR 7365).
Materials
| 16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | to fix the cells |
| Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21425 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A34055 | fluorescent secondary antibody |
| Bovine serum albumin standard (BSA) | euromedex | 04-100-812-E | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796-500ml | cell culture medium |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040-5ML | mounting medium |
| Human: HeLa S3 cells | IGBMC, Strasbourg, France | cell line used to perform the experiments | |
| Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2) | Sigma-Aldrich | H1009-100ml | used as a stressing agent |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | transfection reagent |
| Mouse monoclonal anti-coilin | abcam | ab11822 | Coilin-specific antibody |
| Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope | Nikon | epifluoresecence microscope | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | transfection medium |
| PBS pH 7.4 (10x) | gibco | 70011-036 | to wash the cells |
| Rabbit polyclonal anti-53BP1 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16565 | 53BP1-specific antibody |
| Rabbit polyclonal anti-EDC4 | Sigma-Aldrich | SAB4200114 | EDC4-specific antibody |
| Triton X-100 | Roth | 6683 | to permeabilize the cells |
References
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