सबस्ट्रक्चर एनालाइजर: फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी इमेजेज में सेलुलर निकायों के रैपिड एक्सप्लोरेशन और सटीक विश्लेषण के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल वर्कफ्लो
Summary
हम फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों में विशिष्ट सेल डिब्बों में सेलुलर निकायों की तेजी से अन्वेषण और सटीक विश्लेषण के लिए बनाया गया एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं। यह उपयोगकर्ता के अनुकूल वर्कफ़्लो ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर बर्फीले पर डिज़ाइन किया गया है और इमेजजे कार्यक्षमताओं का भी उपयोग करता है। पाइपलाइन छवि विश्लेषण में ज्ञान के बिना सस्ती है।
Abstract
पिछले दशक में स्थानिक संकल्प सुधार द्वारा सचित्र फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी तकनीकों में सफलताओं की विशेषता है, लेकिन यह भी लाइव सेल इमेजिंग और उच्च थ्रूपुट माइक्रोस्कोपी तकनीकों में । इसके कारण एक ही प्रयोग के लिए माइक्रोस्कोपी डेटा की मात्रा और जटिलता में लगातार वृद्धि हुई। क्योंकि माइक्रोस्कोपी डेटा का मैनुअल विश्लेषण बहुत समय लगता है, व्यक्तिपरक है, और मात्रात्मक विश्लेषण को प्रतिबंधित करता है, बायोइमेज विश्लेषण का स्वचालन लगभग अपरिहार्य होता जा रहा है। हमने फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी से बायोइमेज में सिग्नल विश्लेषण को पूरी तरह से स्वचालित करने के लिए उपसंरचना विश्लेषक नामक एक सूचना का कार्यप्रवाह बनाया। यह वर्कफ़्लो उपयोगकर्ता के अनुकूल ओपन-सोर्स प्लेटफॉर्म बर्फीले पर विकसित किया गया है और इमेजजे से कार्यक्षमताओं द्वारा पूरा किया जाता है। इसमें सिग्नल टू शोर अनुपात में सुधार करने के लिए छवियों का पूर्व-प्रसंस्करण, कोशिकाओं का व्यक्तिगत विभाजन (कोशिका सीमाओं का पता लगाना) और विशिष्ट कोशिका डिब्बों में समृद्ध कोशिका निकायों का पता लगाना/परिमाणीकरण शामिल है । इस वर्कफ़्लो का मुख्य लाभ उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफ़ेस के माध्यम से छवि विश्लेषण विशेषज्ञता के बिना उपयोगकर्ताओं के लिए जटिल बायो-इमेजिंग कार्यक्षमताओं का प्रस्ताव करना है। इसके अलावा, यह अत्यधिक मॉड्यूलर है और विभिन्न सेलुलर उप-संरचनाओं में विभिन्न सेल निकायों के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए परमाणु/साइटोप्लाज्मिक स्थानांतरण के लक्षण वर्णन से कई मुद्दों के अनुकूल है । इस वर्कफ़्लो की कार्यक्षमता ऑक्सीडेटिव तनाव (ओएस) स्थितियों के तहत कैजल (कुंडलित) निकायों के अध्ययन के माध्यम से सचित्र है। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के आंकड़े बताते हैं कि ओएस के शामिल होने के कुछ घंटे बाद मानव कोशिकाओं में उनकी अखंडता प्रभावित होती है । इस प्रभाव को छोटे फोसी की बढ़ी हुई संख्या में कॉइलिन के न्यूक्लियेशन को विशेषता कैजल निकायों में कम करने की विशेषता है। सीबी घटकों और आसपास के न्यूक्लियोप्लाज्म के बीच आदान-प्रदान में कॉइलिन की केंद्रीय भूमिका से पता चलता है कि ओएस प्रेरित कॉइलिन का पुनर्वितरण संरचना और कैजल निकायों की कार्यक्षमता को प्रभावित कर सकता है।
Introduction
प्रकाश माइक्रोस्कोपी और, विशेष रूप से, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी मजबूत और बहुमुखी तकनीक आमतौर पर जैविक विज्ञान में उपयोग किया जाता है। वे अपने विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबलिंग के माध्यम से प्रोटीन या आरएनए जैसे विभिन्न जैव अणुओं के सटीक स्थानीयकरण तक पहुंच देते हैं। पिछले दशक में माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में तेजी से प्रगति की विशेषता है, जैसा कि रसायन विज्ञान में २०१४ नोबेल पुरस्कार से सबूत है एरिक Betzig, स्टीफन डब्ल्यू नरक और विलियम ई. Moerner सुपर हल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (SRFM)1के विकास के लिए । एसएफआरएम इसे नैनोडामेंसेशन में लाने के लिए पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी की विवर्तन सीमा को बाईपास करता है। लाइव इमेजिंग या उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग दृष्टिकोण जैसी तकनीकों में सुधार भी प्रत्येक प्रयोग के लिए इलाज के लिए डेटा की मात्रा और जटिलता को बढ़ाता है। अधिकांश समय, शोधकर्ताओं को कोशिकाओं की उच्च विषम आबादी का सामना करना पड़ता है और एकल कोशिका स्तर पर फेनोटाइप का विश्लेषण करना चाहते हैं।
शुरू में, फोसी काउंटिंग जैसे विश्लेषण आंख द्वारा किए गए थे, जिसे कुछ शोधकर्ताओं द्वारा पसंद किया जाता है क्योंकि यह मतगणना प्रक्रिया पर पूर्ण दृश्य नियंत्रण प्रदान करता है। हालांकि, इस तरह के डेटा का मैनुअल विश्लेषण बहुत समय लगता है, पर्यवेक्षकों के बीच परिवर्तनशीलता की ओर जाता है, और अधिक जटिल सुविधाओं तक पहुंच नहीं देता है ताकि कंप्यूटर-सहायता प्राप्त दृष्टिकोण व्यापक रूप से उपयोग किए जा रहे हैं और लगभग अपरिहार्य2। बायोइमेज सूचना के तरीके डेटा विश्लेषण की दक्षता में काफी वृद्धि करते हैं और अपरिहार्य ऑपरेटर व्यक्तिपरकता और मैनुअल गिनती विश्लेषण के संभावित पूर्वाग्रह से मुक्त हैं। इस क्षेत्र में बढ़ी हुई मांग और कंप्यूटर पावर के सुधार के कारण बड़ी संख्या में छवि विश्लेषण प्लेटफार्मों का विकास हुआ। उनमें से कुछ स्वतंत्र रूप से उपलब्ध हैं और व्यक्तिगत कंप्यूटर के साथ विश्लेषण करने के लिए विभिन्न उपकरणों तक पहुंच देते हैं। खुले पहुंच उपकरणों का वर्गीकरण हाल ही में3 स्थापित किया गया है और एक शक्तिशाली प्रयोज्य और कार्यक्षमता के संयोजन सॉफ्टवेयर के रूप में बर्फीले4 प्रस्तुत करता है । इसके अलावा, बर्फीले ImageJ के साथ संवाद स्थापित करने का लाभ है।
छवि विश्लेषण विशेषज्ञता के बिना उपयोगकर्ताओं के लिए, मुख्य बाधाएं समस्याग्रस्त के अनुसार उपयुक्त उपकरण का चयन करना और सही ढंग से उन मापदंडों को ट्यून करना है जिन्हें अक्सर अच्छी तरह से समझा नहीं जाता है। इसके अलावा, सेटअप समय अक्सर लंबा होता है। बर्फीले एक व्यापक संग्रह4के भीतर पाया कुछ प्लगइन्स के संयोजन से कार्यप्रवाह विकसित करने के लिए “प्रोटोकॉल” नाम एक उपयोगकर्ता के अनुकूल बिंदु और क्लिक इंटरफेस का प्रस्ताव है । लचीला मॉड्यूलर डिजाइन और पॉइंट-एंड-क्लिक इंटरफेस गैर-प्रोग्रामर के लिए एक विश्लेषण व्यवहार्य स्थापित करते हैं। यहां हम बर्फीले इंटरफ़ेस में विकसित सबस्ट्रक्चर एनालाइजरनामक एक कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं, जिसका कार्य विशिष्ट सेलुलर डिब्बों में फ्लोरोसेंट संकेतों का विश्लेषण करना और चमक, फोसी नंबर, फोसी आकार और स्थानिक वितरण के रूप में विभिन्न विशेषताओं को मापना है। यह कार्यप्रवाह सिग्नल स्थानांतरण की मात्राकरण, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर व्यक्त करने वाली संक्रमित कोशिकाओं का विश्लेषण, या व्यक्तिगत कोशिकाओं में विभिन्न सेलुलर उपसंरचनाओं से फोसी का विश्लेषण जैसे कई मुद्दों को संबोधित करता है। यह कई छवियों के एक साथ प्रसंस्करण की अनुमति देता है, और आउटपुट परिणाम एक टैब-डीलिमिटेड वर्कशीट को निर्यात किए जाते हैं जिन्हें आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले स्प्रेडशीट कार्यक्रमों में खोला जा सकता है।
सबस्ट्रक्चर एनालाइजर पाइपलाइन को चित्र 1में प्रस्तुत किया गया है । सबसे पहले, एक निर्दिष्ट फ़ोल्डर में निहित सभी छवियों को शोर अनुपात के लिए उनके संकेत में सुधार करने के लिए पूर्व संसाधित किया जाता है। यह कदम निम्नलिखित चरणों की दक्षता को बढ़ाता है और चलने का समय कम हो जाता है। फिर, छवि क्षेत्रों के अनुरूप ब्याज के क्षेत्र (आरओआई), जहां फ्लोरोसेंट सिग्नल का पता लगाया जाना चाहिए, की पहचान की जाती है और खंडित किया जाता है। अंत में, फ्लोरोसेंट सिग्नल का विश्लेषण किया जाता है, और परिणामों को टैब-डीलिम्ड वर्कशीट में निर्यात किया जाता है।
ऑब्जेक्ट सेगमेंटेशन (सीमाओं का पता लगाना) छवि विश्लेषण में सबसे चुनौतीपूर्ण कदम है, और इसकी दक्षता परिणामस्वरूप सेल माप की सटीकता निर्धारित करती है। एक छवि (जिसे प्राथमिक वस्तुओं कहा जाता है) में पहचानी गई पहली वस्तुएं अक्सर डीएनए-सना हुआ छवियों (DAPI या Hoechst धुंधला) से नाभिक होती हैं, हालांकि प्राथमिक वस्तुएं पूरी कोशिकाएं, मोती, धब्बे, ट्यूमर, या जो भी दाग वाली वस्तुएं हो सकती हैं। अधिकांश जैविक छवियों में, कोशिकाएं या नाभिक एक दूसरे को छूते हैं या सरल और तेज एल्गोरिदम को विफल करने के कारण ओवरलैप करते हैं। आज तक, कोई भी सार्वभौमिक एल्गोरिदम सभी वस्तुओं का सही विभाजन नहीं कर सकता है, ज्यादातर इसलिए कि उनकी विशेषताएं (आकार, आकार या बनावट) विभाजन5की दक्षता को संशोधित करती हैं। आमतौर पर माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर (जैसे आणविक उपकरणोंद्वाराकायापलट इमेजिंग सॉफ्टवेयर, या निकॉन7द्वारा एनआईएस-एलिमेंट्स एडवांस रिसर्च सॉफ्टवेयर) के साथ वितरित खंडीकरण उपकरण आम तौर पर सहसंबंध मिलान, थ्रेसहोल्ड या रूपात्मक संचालन जैसी मानक तकनीकों पर आधारित होते हैं। हालांकि बुनियादी प्रणालियों में कुशल, इन अतिजनरक्षित तरीकों को अधिक चुनौतीपूर्ण और विशिष्ट संदर्भों में उपयोग किए जाने पर सीमाएं तेजी से मौजूद होती हैं। दरअसल, विभाजन सेल प्रकार, सेल घनत्व, या बायोमार्कर जैसे प्रयोगात्मक मापदंडों के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है, और अक्सर एक बड़े डेटा सेट के लिए बार-बार समायोजन की आवश्यकता होती है। सबस्ट्रक्चर एनालाइजर वर्कफ्लो छवि जटिलता और उपयोगकर्ता की जरूरतों के अनुकूल विभिन्न विकल्पों का प्रस्ताव करने के लिए सरल और अधिक परिष्कृत एल्गोरिदम दोनों को एकीकृत करता है। यह विशेष रूप से अत्यधिक संकुल वस्तुओं के लिए मार्कर आधारित वाटरशेड एल्गोरिदम8 का प्रस्ताव करता है। इस विभाजन विधि की दक्षता प्रत्येक वस्तु पर व्यक्तिगत मार्कर के चयन पर निर्भर करती है। इन मार्कर को पूर्ण विभाजन के लिए सही मापदंडों को प्राप्त करने के लिए मैन्युअल रूप से चुना जाता है, जो उपयोगकर्ताओं को उच्च संख्या में वस्तुओं का सामना करने पर अत्यधिक समय लगता है। सबस्ट्रक्चर एनालाइजर इन मार्कर का स्वत: पता लगाने का प्रस्ताव करता है, जो एक अत्यधिक कुशल विभाजन प्रक्रिया प्रदान करता है। विभाजन, अधिकांश समय, छवि विश्लेषण का सीमित कदम है और छवि के संकल्प, प्रति छवि वस्तुओं की संख्या और वस्तुओं के क्लस्टरिंग के स्तर के आधार पर प्रसंस्करण समय को काफी संशोधित कर सकता है। विशिष्ट पाइपलाइनों को मानक डेस्कटॉप कंप्यूटर पर प्रति छवि कुछ सेकंड से 5 मिनट की आवश्यकता होती है। अधिक जटिल छवियों के विश्लेषण के लिए छवि विश्लेषण में अधिक शक्तिशाली कंप्यूटर और कुछ बुनियादी ज्ञान की आवश्यकता हो सकती है।
इस कार्यप्रवाह के लचीलेपन और कार्यक्षमता को प्रतिनिधि परिणामों में विभिन्न उदाहरणों के साथ चित्रित किया गया है। इस कार्यप्रवाह के फायदे विशेष रूप से ऑक्सीडेटिव तनाव (ओएस) स्थितियों के तहत परमाणु उपसंरचनाओं के अध्ययन के माध्यम से प्रदर्शित किए जाते हैं। ओएस ऑक्सीडेंट के पक्ष में रेडॉक्स होमोसेस्टेसिस के असंतुलन से मेल खाता है और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के उच्च स्तर से जुड़ा हुआ है। चूंकि आरओएस अणुओं को संकेत देने के रूप में कार्य करते हैं, इसलिए उनकी एकाग्रता और उपकोशिकीय स्थानीयकरण में परिवर्तन सकारात्मक या नकारात्मक रूप से असंख्य रास्तों और नेटवर्कों को प्रभावित करते हैं जो शारीरिक कार्यों को विनियमित करते हैं, जिनमें सिग्नल ट्रांसडक्शन, मरम्मत तंत्र, जीन अभिव्यक्ति, सेल मृत्यु और प्रसार9,,10शामिल हैं। ओएस इस प्रकार सीधे विभिन्न विकृतियों (न्यूरोडीजेनेरेटिव और हृदय रोगों, कैंसर, मधुमेह, आदि) में शामिल है, लेकिन यह भी सेलुलर उम्र बढ़ने। इसलिए, मानव सेल के संगठन और समारोह पर ओएस के परिणामों को समझने से मानव विकृतियों की शुरुआत और विकास में ओएस की भूमिकाओं की समझ में एक महत्वपूर्ण कदम बनता है। यह स्थापित किया गया है कि ओएस कई ट्रांसक्रिप्शन कारकों (पी 53, एनआरएफ 2, फॉक्सओ 3 ए)11के माध्यम से प्रतिलेखन को मॉडुलकर करके जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, लेकिन पूर्व-आरएनए12, 13, 14,13,14जैसे वैकल्पिक स्प्लिसिंग (एएस) जैसी कई सह-और बाद की ट्रांसक्रिप्शनल प्रक्रियाओं के नियमन को प्रभावित करके भी। प्राथमिक कोडिंग और गैर-कोडिंग ट्रांसक्रिप्ट का वैकल्पिक स्प्लिसिंग एक आवश्यक तंत्र है जो ट्रांसक्रिप्ट आइसोफॉर्म का उत्पादन करके जीनोम की एन्कोडिंग क्षमता को बढ़ाता है। जैसा कि एक विशाल राइबोन्यूक्लिकोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स द्वारा किया जाता है जिसे स्प्लिकोसोम कहा जाता है, जिसमें लगभग 300 प्रोटीन और 5 यू-रिच छोटे परमाणु आरएनए (UsnRNAs)15होते हैं। स्प्लियोसोम असेंबली और एएस को कोशिकाओं में कसकर नियंत्रित किया जाता है और स्प्लियोसोम परिपक्वता के कुछ कदम झिल्ली-कम परमाणु डिब्बों के भीतर होते हैं जिसकाजल निकाय नाम है। इन परमाणु उपसंरचनाओं को उनकी संरचना और उनकी संरचना की गतिशील प्रकृति की विशेषता है, जो मुख्य रूप से कॉइन प्रोटीन के साथ उनके आरएनए और प्रोटीन घटकों की बहुसंभासीय बातचीत द्वारा आयोजित की जाती हैं। सबस्ट्रक्चर एनालाइजर वर्कफ्लो के साथ हजारों कोशिकाओं के विश्लेषण ने कैजल निकायों पर ओएस के कभी वर्णित प्रभावों के लक्षण वर्णन की अनुमति दी। दरअसल, प्राप्त आंकड़ों से पता चलता है कि ओएस कैजल निकायों के नाभिक को संशोधित करता है, जो कॉइलिन प्रोटीन के न्यूक्लियोप्लाज्मिक पुनर्वितरण को कई छोटे परमाणु फोसी में प्रेरित करता है। कैजल निकायों की संरचना में इस तरह के परिवर्तन से स्प्लिकोसोम की परिपक्वता प्रभावित हो सकती है और ओएस द्वारा एएस मॉड्यूलेशन में भाग ले सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
फ्लोरेसेंस सेल छवियों के विश्लेषण के लिए मुफ्त सॉफ्टवेयर उपकरणों की बढ़ती संख्या उपलब्ध है। उपयोगकर्ताओं को सही ढंग से अपने समस्याग्रस्त की जटिलता के अनुसार पर्याप्त सॉफ्टवेयर का चयन करना चाहिए, छव?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
जीएच को मिनेस्टेरे डेलेगुए ए ला रेचेचे एट ऑक्स टेक्नोलॉजीज से स्नातक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। एलएच को इंस्टीटयूट डी कैन्सेरोलोजी डी लोरेन (आईसीएल) से स्नातक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था, जबकि क्यूटी को फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (एएनआर) द्वारा दूसरे “इन्वेस्टिसमेंट्स डी एवेनियर” कार्यक्रम फाइट-एचएफ (संदर्भ: ANR-15-RHU4570004) के हिस्से के रूप में एक सार्वजनिक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम को सीएनआरएस और यूनीवर्सिट डी लोरेन (UMR 7365) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | to fix the cells |
| Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21425 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A34055 | fluorescent secondary antibody |
| Bovine serum albumin standard (BSA) | euromedex | 04-100-812-E | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796-500ml | cell culture medium |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040-5ML | mounting medium |
| Human: HeLa S3 cells | IGBMC, Strasbourg, France | cell line used to perform the experiments | |
| Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2) | Sigma-Aldrich | H1009-100ml | used as a stressing agent |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | transfection reagent |
| Mouse monoclonal anti-coilin | abcam | ab11822 | Coilin-specific antibody |
| Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope | Nikon | epifluoresecence microscope | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | transfection medium |
| PBS pH 7.4 (10x) | gibco | 70011-036 | to wash the cells |
| Rabbit polyclonal anti-53BP1 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16565 | 53BP1-specific antibody |
| Rabbit polyclonal anti-EDC4 | Sigma-Aldrich | SAB4200114 | EDC4-specific antibody |
| Triton X-100 | Roth | 6683 | to permeabilize the cells |
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