ヒト多能性幹細胞からの成熟小脳オルガノイドのスケーラブルな生成と免疫染色による特徴付け
Summary
このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞の制御されたサイズ凝集体を産生し、単一使用バイオリアクターを使用して化学的に定義されたフィーダーフリー条件下で小脳オルガノイドの分化をさらに刺激する動的培養システムを記述する。
Abstract
小脳はバランスと運動協調の維持において重要な役割を果たし、異なる小脳ニューロンの機能的欠陥は小脳機能障害を引き起こす可能性がある。疾患関連の神経細胞型に関する現在の知識のほとんどは、死後の組織に基づいており、疾患の進行と発症の理解が困難です。動物モデルおよび不死化細胞株は、神経変性疾患のモデルとしても使用されている。しかし、彼らは完全に人間の病気を再現しません。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)は、疾患モデル化の可能性が大きく、再生アプローチの貴重な供給源となります。近年、患者由来のiPSCからの脳オルガノイドの生成は、神経変性疾患モデルの見通しを改善しました。しかし、3D培養系において多数のオルガノイドを産生し、成熟したニューロンの収量が高いプロトコルが欠けている。このプロトコルは、オルガノイドが小脳の同一性を獲得するスケーラブルな単一使用バイオリアクターを使用して、化学的に定義された条件下で、ヒトiPSC由来オルガノイドを再現可能でスケーラブルに生成するための新しいアプローチです。生成されたオルガノイドは、mRNAおよびタンパク質レベルの両方で特異的なマーカーの発現によって特徴付けられる。タンパク質の特定のグループの分析は、その局在化がオルガノイド構造の評価に重要である異なる小脳細胞集団の検出を可能にします。オルガノイド凍結切除およびオルガノイドスライスのさらなる免疫染色は、特定の小脳細胞集団の存在およびそれらの空間組織を評価するために使用される。
Introduction
ヒト多能性幹細胞(PSC)の出現は、再生医療および疾患モデリングのための優れたツールを表しており、これらの細胞は人体11,2のほとんどの細胞系統に分化することができるからである。その発見以来、多様なアプローチを用いたPSC分化は、神経変性疾患33、4、5、64,5を含む異なる疾患を6モデル化することが報告されている。
近年、ヒトの脳構造に似たPSC由来の3D培養が報告されている。これらは脳オルガノイド33、7、87と呼ばれています。健康な、患者固有のPSCの両方からのこれらの構造の生成は、人間の発達および神経発達障害をモデル化する貴重な機会を提供する。しかし、これらのよく組織化された脳構造を生成するために使用される方法は、その大規模な生産に適用することは困難です。オルガノイド内部の壊死を伴わずに組織形態形成を再現するのに十分な大きさの構造を作り出すために、プロトコルは静的条件下での初期神経コミットメントに依存し、続いてヒドロゲル中のカプセル化および動的系におけるその後の培養3。しかし、そのようなアプローチは、オルガノイド産生の潜在的なスケールアップを制限する可能性がある。皮質、線条体、中脳,、脊髄ニューロン9、10、11、12を含む中枢神経系の特定の領域にPSC分化を指示9する努力がなされているにもかかわらず、10,11動的な状態で特定の脳領域の生成は依然として課題である。12特に、3D構造における成熟小脳ニューロンの生成については、まだ記載されていない。Mugurumaら.は、初期の小脳の発達13を再現する培養条件の生成を開拓し、最近、ヒト胚性幹細胞が第1三期小脳7を連想させる偏光構造を生成することを可能にするプロトコルを報告した。しかしながら、報告された研究における小脳ニューロンの成熟は、オルガノイドの解離、小脳前駆腫の分類、および単層培養系7、14、15、1614,15におけるフィーダー細胞との共培養を必要7とする16。したがって、規定された条件下での疾患モデリングのための所望の小脳オルガノイドの再現性のある生成は、培養およびフィーダー源変動に関連する課題である。
このプロトコルは、単回使用垂直車輪バイオリアクター(仕様については 材料表 を参照)を用いた小脳ニューロンへのヒトPSCの3D拡張および効率的な分化のための最適な培養条件を提示し、以下バイオリアクターと呼ばれる。バイオリアクターは、U字型の底部と組み合わせた大きな垂直インペラを装備しており、容器内のより均質なせん断分布を提供し、攪拌速度17を低下させた穏やかで均一な混合および粒子懸濁液を可能にする。このシステムにより、形状およびサイズ制御された細胞凝集体が得られ、より均質で効率的な分化のために重要である。さらに、より多くのiPSC由来オルガノイドは、より手間のかかわりのない方法で生成することができます。
通常幹細胞から形成される3D多細胞構造であるオルガノイドの主な特徴は、ヒト形態形成18、19、2019,20に見られるような特定の形状を形成する異なる細胞18型の自己組織化である。したがって、オルガノイド形態は、分化過程で評価される重要な基準である。オルガノイドの細分化と、さらに特定の抗体を用いたオルガノイドスライスの免疫染色により、細胞増殖、分化、細胞集団の同一性、アポトーシスを解析する分子マーカーの空間的可視化が可能になります。このプロトコルを用いて、オルガノイド・クライオセクションを免疫染色することにより、分化の7日目により初期の効率的な神経コミットメントが観察される。分化の間、小脳の同一性を有する複数の細胞集団が観察される。この動的系で35日後、小脳神経エピテリウムは、前駆細胞および基底位置した近味神経系の前駆細胞および基底位置の素端層を有するアピコ基底軸に沿って組織する。成熟過程では、35~90日目の分化から、プルキンエ細胞(カルビンビン+)、顆粒細胞(PAX6+/MAP2+)、ゴルジ細胞(ニューログラニン+、ユニポーラブラシ細胞+(TBR2+)、深小+脳核投影ニューロン(TBR1+)+を含む、異なるタイプの小脳ニューロンが見られる。+また、培養で90日後に発生した小脳オルガノイドでは、有意でない量の細胞死が観察される。
このシステムでは、ヒトiPSC由来オルガノイドは異なる小脳ニューロンに成熟し、解離およびフィーダーの共培養を必要とせずに最大3ヶ月間生存し、疾患モデリングのためのヒト小脳ニューロンの供給源を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
大規模な細胞数と、薬物スクリーニングおよび再生医療用途向けに特定の細胞タイプを生成するための定義された培養条件の必要性が、スケーラブルな培養システムの開発を推進してきました。近年、いくつかのグループは、神経前駆物質および機能的ニューロンのスケーラブルな生成を報告しています32,,33,,34,神経変性?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、フンダソン・パラ・ア・シエンシア・エ・ア・テクノロジア(FCT)、ポルトガル(UIDB/04565/2020)がプログラム・オペラシオナル・リージョナル・デ・リスボア2020、プロジェクトN.007317によって支援されました。 PD/BD/105773/2014からT.P.SとPD/BD/128376/2017からD.E.S.N.へ、FEDER(PORリスボア2020)が共同出資するプロジェクト 2020)とFCTは、PAC精密リスボア-01-0145-FEDER-016394および運動失調研究のための小脳オルガノイドのCEREBEX世代を通じてLISBOA-01-0145-FEDER-029298を付与します。欧州連合(EU)のHorizon 2020研究イノベーションプログラムからも資金が寄せられたのは、助成金協定番号739572(再生精密医療発見センターH2020-WIDESPREAD-01-2016-2017)の下で行われました。
Materials
| 3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 – 500mL | Sigma | cell detachment medium |
| Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
| Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
| Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 – 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
| Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
| Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
References
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