İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Olgun Serebellar Organoidlerin Ölçeklenebilir Üretimi ve İmmünboyama ile Karakterizasyonu
Summary
Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinin kontrollü boyut agregaları üretmek ve daha da kimyasal olarak tanımlanmış ve besleyici içermeyen koşullar altında serebellar organoidlerde farklılaşma uyarmak için dinamik bir kültür sistemi açıklar tek kullanımlık biyoreaktör kullanarak.
Abstract
Beyincik denge ve motor koordinasyonun korunmasında kritik bir rol oynar ve farklı serebellar nöronlarda fonksiyonel bir defekt serebellar disfonksiyonu tetikleyebilir. Hastalığa bağlı nöronal fenotipler hakkındaki mevcut bilginin çoğu postmortem dokular dayanmaktadır, bu da hastalığın ilerlemesini ve gelişimini zorlaştırır. Hayvan modelleri ve ölümsüzleştirilmiş hücre hatları da nörodejeneratif bozukluklar için model olarak kullanılmıştır. Ancak, onlar tam olarak insan hastalığı özetlemek yok. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSCs) hastalık modelleme için büyük bir potansiyele sahip ve rejeneratif yaklaşımlar için değerli bir kaynak sağlar. Son yıllarda, hasta kaynaklı iPSCs gelen serebral organoidlerin nesil nörodejeneratif hastalık modelleme için umutları geliştirdi. Ancak, organoidler çok sayıda ve 3D kültür sistemlerinde olgun nöronların yüksek verim üreten protokoller eksiktir. Sunulan protokol, organoidlerin serebeller kimlik elde ettiği ölçeklenebilir tek kullanımlık biyoreaktörler kullanılarak kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında insan iPSC kaynaklı organoidlerin tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir üretimi için yeni bir yaklaşımdır. Oluşturulan organoidler hem mRNA hem de protein düzeyinde spesifik belirteçlerin ekspresyonu ile karakterizedir. Belirli protein gruplarının analizi, lokalizasyonu organoid yapının değerlendirilmesi nde önemli olan farklı serebellar hücre popülasyonlarının saptanmasına olanak sağlar. Organoid kriyoselve organoid dilimlerin daha fazla immünboyama belirli serebellar hücre popülasyonlarının varlığını ve mekansal organizasyonlarını değerlendirmek için kullanılır.
Introduction
İnsan pluripotent kök hücrelerinin ortaya çıkması (PSCs) rejeneratif tıp ve hastalık modelleme için mükemmel bir araç temsil eder, Bu hücrelerin insan vücudunun en hücre soyları içine ayırt edilebilir çünkü1,2. Onların keşfinden bu yana, PSC farklılaşma farklı yaklaşımlar kullanarak farklı hastalıkların model bildirilmiştir, nörodejeneratif bozukluklar da dahil olmak üzere3,4,5,6.
Son zamanlarda, insan serebral yapıları andıran PSCs türetilen 3D kültürlerin raporlar olmuştur; bu beyin organoidlerdenir 3,7,8. Bu yapıların hem sağlıklı hem de hastaya özel SPK’lardan üretimi, insan gelişimi ve nörogelişimsel bozuklukları modellemek için değerli bir fırsat sağlamaktadır. Ancak, bu iyi organize serebral yapılar oluşturmak için kullanılan yöntemler onların büyük ölçekli üretim için uygulamak zordur. Organoidler içinde nekroz olmadan doku morfogenezini özetleyecek kadar büyük yapılar üretmek için protokoller statik koşullarda ilk nöral bağlılığa dayanır, ardından hidrojellerde kapsülleme ve dinamik sistemlerde sonraki kültür3. Ancak, bu tür yaklaşımlar organoid üretimin potansiyel ölçek-up sınırlayabilir. Kortikal, striatal, orta beyin ve omurilik nöronlar9,10,,11,,1012dahil olmak üzere merkezi sinir sisteminin belirli bölgelerine PSC farklılaşma doğrudan psc farklılaşma için yapılmış olsa da, dinamik koşullarda belirli beyin bölgelerinin üretimi hala bir sorundur. Özellikle, 3D yapılarda olgun serebellar nöronların nesil henüz tarif edilmemiştir. Muguruma ve ark. erken serebellar gelişim13 recapitulate kültür koşullarının nesil öncülük ve son zamanlarda insan embriyonik kök hücrelerin in ilk trimester serebellum anımsatan polarize bir yapı oluşturmak için izin veren bir protokol bildirdi7. Ancak, bildirilen çalışmalarda serebellar nöronların olgunlaşmaorganoidlerin ayrışması gerektirir, serebellar atalarının sıralama, ve tek katmanlı kültür sisteminde besleyici hücreleri ile coculture7,14,15,16. Bu nedenle, tanımlanmış koşullar altında hastalık modelleme için istenilen serebellar organoidlerin tekrarlanabilir nesil hala kültür ve besleyici kaynak değişkenliği ile ilişkili bir sorundur.
Bu protokol, tek kullanımlık dikey tekerlek biyoreaktörleri kullanarak 3D genişleme ve insan PsC’lerinin serebellar nöronlara etkin bir şekilde farklılaşması için en uygun kültür koşullarını sunar (spesifikasyonlar için Malzeme Tablosuna bakınız), bundan böyle biyoreaktörler olarak adlandırılır. Biyoreaktörler büyük bir dikey çark ile donatılmıştır, Hangi U-şekilli alt ile birlikte, damar içinde daha homojen bir kesme dağılımı sağlamak, azaltılmış ajitasyon hızları ile nazik sağlayan, düzgün karıştırma ve parçacık süspansiyon17. Bu sistem le daha homojen ve verimli bir farklılaşma için önemli olan şekil ve boyut kontrollü hücre agregaları elde edilebilir. Ayrıca, daha az zahmetli bir şekilde iPSC kaynaklı organoidler daha fazla sayıda oluşturulabilir.
Genellikle kök hücrelerden oluşan 3D çok hücreli yapılar olan organoidlerin ana özelliği, insan morfogenezinde görülenlere benzer şekiller oluşturan farklı hücre tiplerinin kendi kendini organizasyonudur18,19,20. Bu nedenle organoid morfolojisi farklılaşma sürecinde değerlendirilmek üzere önemli bir kriterdir. Organoidlerin kriyoseksiyonu ve organoid dilimlerinin belirli bir antikor seti ile daha fazla immünboyizasyonu, hücre çoğalması, farklılaşma, hücre popülasyon uyruk kimliği ve apoptozu analiz etmek için moleküler belirteçlerin mekansal görselleştirmesine olanak sağlar. Bu protokol ile organoid kriyokesilerin immünboyboya ilefarklılaşmanın 7. Farklılaşma sırasında serebellar kimliğe sahip çeşitli hücre popülasyonları gözlenir. Bu dinamik sistemde 35 gün sonra, serebellar nöroepitel bir apikobazal eksen boyunca organize, çoğalan atalar bir apikal tabaka ve bazal bulunan postmitotik nöronlar. Olgunlaşma sürecinde, gün 35-90 farklılaşma, serebellar nöronların farklı türleri görülebilir, Purkinje hücreleri de dahil olmak üzere (Calbindin+), granül hücreleri (PAX6+/ MAP2+), Golgi hücreleri (Nörogranin+), unipolar fırça hücreleri (TBR2+), ve derin serebellar çekirdekleri projeksiyon nöronlar (TBR1+ ). Ayrıca kültürde 90 gün sonra oluşturulan serebellar organoidlerde önemli miktarda hücre ölümü gözlenmektedir.
Bu sistemde, insan iPSC kaynaklı organoidler farklı serebellar nöronlar içine olgun ve dissociation ve besleyici coculture gerek kalmadan 3 aya kadar hayatta, hastalık modelleme için insan serebellar nöronkaynağı sağlayan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uyuşturucu taraması ve rejeneratif tıp uygulamaları için belirli hücre tipleri oluşturmak için büyük hücre numaralarının yanı sıra tanımlanmış kültür koşullarına duyulan ihtiyaç ölçeklenebilir kültür sistemlerinin gelişmesine yol açmıştır. Son yıllarda, çeşitli gruplar nöral atalar ve fonksiyonel nöronların ölçeklenebilir nesil bildirdin32,33,34, nörodejeneratif bozukluklar için yeni mod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portekiz (UIDB/04565/2020 programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 to T.P.S ve PD/BD/128376/2017 to D.E.S.N., FEDER tarafından ortaklaşa finanse edilen projeler (POR Lisboa 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTEKIZ 2020) ve FCT hibe PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 ve CEREBEX Nesil Serebellar Organoidler AtaksiA Araştırma hibe LISBOA-01-0145-FEDER-029298. 739572 sayılı Hibe Anlaşması kapsamında Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı’ndan da fon alındı- Keşifler Rejeneratif ve Hassas Tıp Keşifler Merkezi H2020-GENİş-01-2016-2017.
Materials
| 3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 – 500mL | Sigma | cell detachment medium |
| Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
| Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
| Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 – 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
| Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
| Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Ishida, Y., et al. Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs. Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).
- Liu, Y., Zhang, S. C. Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).
- Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162 (2), 375-390 (2015).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Aubry, L., et al. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).
- Gunhanlar, N., et al. A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).
- Hu, B. Y., Zhang, S. C. Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells. Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Muguruma, K., et al. Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells. Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).
- Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).
- Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Science Reports. 5, 9232 (2015).
- Tao, O., et al. Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).
- Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies. Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
- Lou, Y. R., Leung, A. W. Next generation organoids for biomedical research and applications. Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).
- Silva, T. P., et al. Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering. Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).
- Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. 발생학. 313 (1), 107-117 (2008).
- Yaguchi, Y., et al. Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development. Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).
- Fischer, T., et al. Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis. 발생학. 350 (2), 496-510 (2011).
- Bagri, A., et al. The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells. Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).
- Bardy, C., et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).
- Bauwens, C. L., et al. Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
- Miranda, C. C., et al. Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment. Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells. Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).
- Bardy, J., et al. Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells. Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).
- Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
- Arora, N., et al. A process engineering approach to increase organoid yield. Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).
- Gimeno, L., Martinez, S. Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh. Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).
