التوليد القابل للتحجيم من العضيات الدماغية الناضجة من الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات والتوصيف عن طريق المناعة
Summary
يصف هذا البروتوكول نظامًا ديناميكيًا لثقافة إنتاج مجاميع حجم متحكم فيها للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات وزيادة تحفيز التمايز في الأعضاء الدماغية في ظل ظروف محددة كيميائيًا وخالية من التغذية باستخدام مفاعل حيوي أحادي الاستخدام.
Abstract
المخيخ يلعب دورا حاسما في الحفاظ على التوازن والتنسيق الحركي, وخلل وظيفي في الخلايا العصبية المخية المختلفة يمكن أن تؤدي إلى خلل cerebellar. معظم المعرفة الحالية حول الأنماط الظاهرية العصبية المرتبطة بالأمراض تستند إلى أنسجة ما بعد الوفاة ، مما يجعل فهم تطور المرض وتطوره صعبًا. كما استخدمت النماذج الحيوانية وخطوط الخلايا الخالدة كنماذج للاضطرابات العصبية. ومع ذلك ، فإنها لا تُكَلِم تماماً بمرض الإنسان. لدى الخلايا الجذعية المتعددة القدرات التي يسببها الإنسان إمكانات كبيرة في نمذجة الأمراض وتوفر مصدراً قيماً للنُهج التجديدية. في السنوات الأخيرة، جيل organoids الدماغي من iPSCs المستمدة من المريض تحسين آفاق النمذجة الأمراض العصبية. ومع ذلك، لا توجد بروتوكولات تنتج أعداداً كبيرة من الأعضاء وغلة عالية من الخلايا العصبية الناضجة في أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد. البروتوكول المقدم هو نهج جديد لتوليد قابلة للتكرار وقابلة للتطوير من الأجهزة العضوية المشتقة من iPSC البشرية في ظل ظروف محددة كيميائيا باستخدام المفاعلات الحيوية القابلة للتطوير للاستخدام الواحد ، والتي تكتسب فيها الأجهزة هوية cerebellar. وتتميز organoids ولدت من خلال التعبير عن علامات محددة على حد سواء مرنا ومستوى البروتين. تحليل مجموعات محددة من البروتينات يسمح بالكشف عن مختلف مجموعات الخلايا المخية، التي توطين مهم لتقييم بنية organoid. يستخدم البكتات العضية والمزيد من الكبت المناعي لشرائح الأعضاء لتقييم وجود مجموعات محددة من خلايا المخيخ وتنظيمها المكاني.
Introduction
يمثل ظهور الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات (PSCs) أداة ممتازة للطب التجديدي وطراز الأمراض ، لأن هذه الخلايا يمكن أن تختلف في معظم أنساب الخلايا في جسم الإنسان1،2. منذ اكتشافها، PSC التمايز باستخدام نهج متنوعة وقد أفيد عن نموذج الأمراض المختلفة، بما في ذلك الاضطرابات العصبية3،4،5،6.
وفي الآونة الأخيرة، وردت تقارير عن ثقافات ثلاثية الأبعاد مستمدة من الهياكل الدماغية البشرية التي تشبه الهياكل الدماغية البشرية؛ وتسمى هذه organoids الدماغ3،7،8. ويتيح توليد هذه الهياكل من كل من اللجان الصحية الصحية الصحية الصحية والصحية الخاصة بالمريض فرصة قيّمة لوضع نماذج للتنمية البشرية والاضطرابات العصبية النمائية. ومع ذلك، من الصعب تطبيق الأساليب المستخدمة لتوليد هذه الهياكل الدماغية منظمة تنظيما جيدا لإنتاجها على نطاق واسع. لإنتاج الهياكل التي هي كبيرة بما يكفي لتكليل تكوين الأنسجة دون نخر داخل العضوية، بروتوكولات تعتمد على الالتزام العصبي الأولي في ظروف ثابتة، تليها التغليف في الهيدروجيل والثقافة اللاحقة في النظم الديناميكية3. غير أن هذه النهوج قد تحد من إمكانية زيادة الإنتاج العضوي. على الرغم من الجهود التي بذلت لتوجيه التمايز PSC لمناطق محددة من الجهاز العصبي المركزي, بما في ذلك القشرية, سترياتال, منتصف القرنين, والخلايا العصبية الحبل الشوكي9,,10,,11,12, لا يزال يشكل تحدياً توليد مناطق معينة في الدماغ في ظروف ديناميكية. على وجه الخصوص, جيل الخلايا العصبية cerebellar ناضجة في هياكل 3D لم يتم وصفها بعد. موغوروما وآخرون رائدة في توليد الظروف الثقافية التي تُستخيخ تطور المخ القريب المبكر13، وأبلغ مؤخراً عن بروتوكول يسمح للخلايا الجذعية الجنينية البشرية بتوليد بنية مستقطبة تذكرنا بأول يخسم المخيخ7في الثلث الأول من الحمل . ومع ذلك، فإن نضوج الخلايا العصبية cerebellar في الدراسات المبلغ عنها يتطلب تفكك organoids، وفرز السلف cerebellar، وزراعة نقّة مع الخلايا المغذية في نظام ثقافة أحادية الطبقة7،14،15،16. ولذلك، فإن الجيل القابل للتكرار من الأعضاء cerebellar المطلوبة للأمراض النمذجة في ظل ظروف محددة لا يزال تحديا المرتبطة الثقافة وتغذية من مصادر التغير.
يقدم هذا البروتوكول ظروف الثقافة المثلى للتوسع ثلاثي الأبعاد والتمايز الفعال للأجهزة الخاصة بشرية في الخلايا العصبية cerebellar باستخدام المفاعلات الحيوية ذات العجلات الرأسية ذات الاستخدام الواحد (انظر جدول المواد للمواصفات)، وتسمى فيما يلي المفاعلات الحيوية. وقد تم تجهيز bioreactors مع المكره الرأسي الكبير، والتي في تركيبة مع أسفل على شكل حرف U، وتوفير توزيع القص أكثر تجانسا داخل السفينة، والسماح لطيف، خلط موحد وتعليق الجسيمات مع انخفاض سرعات الانفعالات17. مع هذا النظام، يمكن الحصول على مجاميع الخلايا التي تسيطر عليها الشكل والحجم، وهو أمر مهم لتمايز أكثر تجانسا وكفاءة. وعلاوة على ذلك، يمكن توليد عدد أكبر من الأعضاء المشتقة من iPSC بطريقة أقل جاهدية.
السمة الرئيسية للعضوية، والتي هي هياكل متعددة الخلايا 3D التي تتشكل عادة من الخلايا الجذعية، هو التنظيم الذاتي لأنواع الخلايا المختلفة التي تشكل أشكال محددة مثل تلك التي ينظر إليها في morphogenesis الإنسان18،19،20. ولذلك، مورفولوجيا الجهاز هو معيار مهم لتقييمها أثناء عملية التفريق. والتبريد من organoids والمزيد من المناعة من شرائح organoid مع مجموعة محددة من الأجسام المضادة تسمح للتصور المكاني للعلامات الجزيئية لتحليل انتشار الخلايا ، والتمايز ، والهوية السكانية الخلية ، و المبرمج. مع هذا البروتوكول ، عن طريق الكبتات العضية التي تحتوي على المناعة ، لوحظ التزام عصبي أولي فعال من قبلاليوم السابع للتمايز. أثناء التمايز، لوحظ عدد من مجموعات الخلايا ذات الهوية الدماغية. بعد 35 يوما في هذا النظام الديناميكي، وsyepithelium cerebellar ينظم على طول محور picobasal، مع طبقة apical من السلفاروس المتكاثرة والخلايا العصبية ما بعد الحركة. خلال عملية النضج، من أيام 35-90 من التمايز، يمكن رؤية أنواع متميزة من الخلايا العصبية cerebellar، بما في ذلك خلايا بوركينجي (كالبيندين+)، الخلايا الحبيبية (PAX6+/ MAP2+) ، خلايا غولجي (Neurogranin+) ، خلايا فرشاة أحادي القطب (TBR2+) ، والخلايا العصبية العميقة الإسقاط النوية cerebellar (TBR1+). أيضا، لوحظت كمية غير مُهَمِّة من موت الخلايا في الأعضاء المُنشأة في المخيخ بعد 90 يوماً في الثقافة.
في هذا النظام، تنضج الأجهزة المشتقة من iPSC البشرية إلى خلايا عصبية مختلفة من المخيخ والبقاء على قيد الحياة لمدة تصل إلى 3 أشهر دون الحاجة إلى الانفصام وتربية الحيوانات المغذية، مما يوفر مصدرًا للخلايا العصبية الدماغية البشرية لنم نمستر المرض.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أدت الحاجة إلى أعداد كبيرة من الخلايا وكذلك الظروف الثقافية المحددة لتوليد أنواع محددة من الخلايا لفحص الأدوية وتطبيقات الطب التجديدي إلى تطوير نظم ثقافة قابلة للتطوير. في السنوات الأخيرة, وقد أبلغت عدة مجموعات جيل قابلة للتطوير من السلف العصبية والخلايا العصبية الوظيفية32<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)، البرتغال (UIDB/04565/2020 من خلال Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 إلى T.P.S و PD/BD/128376/2017 إلى D.E.S.N.)، وهي مشاريع يشارك في تمويلها فيدر (POR Lisboa 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) وFCT من خلال منحة PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 وCEREBEX جيل من Organoids Cerebellar للأبحاث Ataxia منحة لشبونة-01-0145-فيدر-029298. كما تم تلقي التمويل من برنامج الاتحاد الأوروبي للبحوث والابتكار في أفق 2020، تحت رقم اتفاقية المنح 739572 – مركز الاكتشافات للطب التجديدي والدقة H2020-واسع الانتشار-01-2016-2017.
Materials
| 3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 – 500mL | Sigma | cell detachment medium |
| Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
| Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
| Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 – 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
| Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
| Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Ishida, Y., et al. Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs. Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).
- Liu, Y., Zhang, S. C. Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).
- Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162 (2), 375-390 (2015).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Aubry, L., et al. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).
- Gunhanlar, N., et al. A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).
- Hu, B. Y., Zhang, S. C. Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells. Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Muguruma, K., et al. Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells. Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).
- Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).
- Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Science Reports. 5, 9232 (2015).
- Tao, O., et al. Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).
- Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies. Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
- Lou, Y. R., Leung, A. W. Next generation organoids for biomedical research and applications. Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).
- Silva, T. P., et al. Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering. Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).
- Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. 발생학. 313 (1), 107-117 (2008).
- Yaguchi, Y., et al. Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development. Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).
- Fischer, T., et al. Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis. 발생학. 350 (2), 496-510 (2011).
- Bagri, A., et al. The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells. Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).
- Bardy, C., et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).
- Bauwens, C. L., et al. Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
- Miranda, C. C., et al. Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment. Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells. Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).
- Bardy, J., et al. Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells. Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).
- Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
- Arora, N., et al. A process engineering approach to increase organoid yield. Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).
- Gimeno, L., Martinez, S. Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh. Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).
