اكتشاف بسيط من سيليا الأولية من قبل المناعةfluorescence
Summary
الإهداب الأولية هي هياكل خارج الخلية المرتبطة بالهيكل المركزي. الكشف عن الإهداب الأولية عن طريق تلطيخ الفلوروس المناعة هو إجراء بسيط نسبيا أن النتائج في صور عالية الجودة للغاية. في هذا البروتوكول، كانت الخلايا الليفية التي تعبر عن أهداب أولية ثابتة، ومثبطة للمناعة، ومصوّبة في مجهر فلوري أو مجهري.
Abstract
يتم تنظيم الإهداب الأولية ديناميكيًا أثناء تطور دورة الخلية ، وتحديدًا خلال مراحل G0/G1 من دورة الخلية ، ويتم إعادة ترسبها قبل الانقسام. يمكن تصور الإهداب الأولية بطرق متطورة للغاية ، بما في ذلك المجهر الإلكتروني للإرسال ، والتصوير ثلاثي الأبعاد ، أو استخدام برامج للكشف التلقائي عن الأهداب الأولية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى تلطيخ من الإهداب الأولية لإجراء هذه الطرق. يصف هذا المنشور بروتوكولًا للكشف السهل عن أهداب الأولية في المختبر عن طريق تلطيخ أسيتيلات ألفا توبولين (axoneme) وa توبولين غاما (الجسم القاعدي). هذا البروتوكول الملطّف بالفلورات الملطّف بسيط نسبيًّا وينتج صورًا عالية الجودة. يصف هذا البروتوكول كيف أن أربعة خطوط خلايا (C2C12، MEF، NHLF، والخلايا الليفية الجلدية) التي تعبر عن الأهداب الأولية كانت ثابتة ومثبطة للمناعة وصورة مع مجهر فلوري أو مجهري.
Introduction
الإهداب الأولية هي الحسية، الانفرادي، الغشاء ملزمة، الهياكل غير المبتدئ المرتبطة بالهيكل المركزي الأم للخلية. تم العثور على أهداب الأولية في معظم الخلايا الفقارية باستثناء خلايا الدم الحمراء، adipocytes1، وخلايا2. تتشكل الأهداب الأولية كمحور ممدود يتكون من ميكروتومات، المكون الرئيسي لها هو α-tubulin. ينمو الفأس من الجسم القاعدي، الذي يتم تنظيمه من γ-tubulin. ويتراوح طول الأهداب الأولية بين 2-10 ميكرومتر؛ ومع ذلك، يمكن أن تتغير أبعاده أثناء الجليسيليشن، والتجويع، ونقص الأكسجة، والإجهاد السام للخلايا، أو بعد التعرض للإشعاع المؤين3،4،5،6،7. عادة, الخلايا لديها واحد فقط cilium الابتدائي, التي تشارك في morphogenesis والخلايا إشارات مسارات هامة لانتشار الخلايا والتمايز8,,9.
يتم تنظيم أهداب الابتدائية بشكل ديناميكي خلال تطور دورة الخلية ، وتحديدا خلال مراحل G0/G1 ، وإعادة ترسب قبل دخول الانقسام في عملية مرتبطة بفك الacetylation tubulin بوساطة HDAC6 (histone deacetylase 6)10. الدقيقة لحظة سيليا resorption الأساسي يعتمد على نوع الخلية والتعبير عن الجينات المشاركة مباشرة في هذه العملية، مثل أورورا A، Plk1، TcTex-11،11,12،,13. اعتمادا على نوع الخلية، والإهداب الأولية التعبير عن أنواع مختلفة من المستقبلات، والقنوات الأيونية، ومسارات الإشارات النشطة. وتشمل هذه أهم مستقبلات الإشارات التي تؤثر على الانتشار والبقاء على قيد الحياة، EGFR، PDGFR، وFGFR. وشملت أيضا بعض المسارات الإشارات التي قد تؤثر على وظيفة واحد أو أكثر من الأجهزة، بما في ذلك القنفذ، نوتش، وWNT. وبفضل هذه المستقبلات ومسارات الإشارات، والأهداب الأولية أيضا أداء وظيفة العلاج الكيميائي. هذه الوظيفة تسمح أهداب الأولية للكشف عن يغاند محددة لرقم, الهرمونات, والمواد النشطة بيولوجيا مثل السيروتونين أو سوماتوستاتين. وتشمل الوظائف المحددة الأخرى التي تظهر من قبل أهداب الابتدائية من أطوال مختلفة رد فعل للتغيرات في درجة الحرارة, الجاذبية, وosmolality14.
يمكن تصور الإهداب الأولية من خلال طرق مختلفة ، مثل التصور الحي ، والمجهر الإلكتروني انتقال ، التصوير ثلاثي الأبعاد ، أو عن طريق برنامج للكشف التلقائي عن الإهدابالابتدائية 5،15،16،17. ومع ذلك، هذه الأساليب هي متخصصة للغاية والبحث المستمر يحتاج إلى أساليب أساسية وسريعة وسهلة لتلوين أهداب الأولية في كل مرحلة من مراحل البحث. وصفها هو وسيلة سهلة ومفيدة للكشف عن أهداب الأولية في الخلايا المستزرعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وصف العديد من المؤلفين أساليب متنوعة للكشف عن أهداب الأولية، وأحيانا أيضا وصف مختلف طرق التثبيت التي يمكن أن تؤثر على الكشف6،20،21،22. بغض النظر عن ذلك، من الصعب العثور على بروتوكول كامل ومباشر للكشف. ومما لا شك فيه أن …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل وزارة الدفاع في الجمهورية التشيكية – خطة تطوير المنظمة الطويلة الأجل الجوانب الطبية لأسلحة الدمار الشامل التابعة لكلية العلوم الصحية العسكرية، جامعة الدفاع؛ وزارة التعليم والشباب والرياضة، الجمهورية التشيكية (مشروع البحث المحدد رقم SV/FVZ201703) و PROGRES Q40/06. شكرا أيضا لدانييل دياز على مساعدته الرقيقة في مراجعة اللغة الإنجليزية.
Materials
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
References
- Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a “sleeping beauty” in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
- Sloboda, R. . Primary cilia. , (2009).
- Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
- Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
- Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
- Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
- Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).
- Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
- Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
- Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
- Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
- Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
- Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
- Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905 (2019).
- Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , (2012).
- Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
- Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1 (2019).
- Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
- Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1307-1318 (2016).
- Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
- Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
- Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).
- Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5 (2017).
- Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11 (2015).
- DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).
