면역 형광에 의한 1 차 적인 섬모의 간단한 검출
Summary
1 차적인 섬모는 센티미터와 관련되었던 세포 외 구조물입니다. 면역 형광 염색에 의한 1 차 적인 섬모 검출은 매우 높은 품질의 심상을 초래하는 비교적 간단한 절차입니다. 이 프로토콜에서, 1 차적인 섬모를 표현하는 섬유아세포는 형광 또는 공초점 현미경으로 고정되고, 면역 염색되고, 심상화되었습니다.
Abstract
1 차 적인 섬모는 세포 주기 진행 도중 동적으로 통제됩니다, 특히 세포 주기의 G0/G1 단계 도중, 미토시스의 앞에 resorbed되고. 1 차 섬모는 전송 전자 현미경 검사법, 3D 이미징, 또는 1 차 섬모의 자동 검출을 위한 소프트웨어를 사용하는 것을 포함하여 고도로 정교한 방법으로 시각화될 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법을 수행하기 위해서는 1차 섬모의 면역형성 염색이 필요하다. 이 간행물은 아세틸화 알파 튜룰린 (axoneme)과 감마 튜룰린 (기저 몸)을 염색하여 체외에서 1 차 섬모를 쉽게 검출하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 면역 형광 염색 프로토콜은 비교적 간단하고 고품질의 이미지를 초래합니다. 본 프로토콜은 1차 섬모를 발현하는 4개의 세포주(C2C12, MEF, NHLF 및 피부 섬유아세포)가 어떻게 고정되고 면역염색되고 형광 또는 공초점 현미경으로 이미지되었는지를 설명합니다.
Introduction
1 차 적인 섬모는 세포의 어머니 중심과 관련 되 었던 감각, 독방, 막 바인딩, 비 momotile 구조. 1 차 섬모는 적혈구, 백혈구1,및 간세포2를제외한 대부분의 척추 동물 세포에서 발견된다. 1차 섬모는 마이크로튜부에 의해 구성된 길쭉한 축소메로 형성되며, 그 주요 성분은 α-tubulin이다. 축 사 메는 기저체에서 성장, 이는 γ-tubulin에서 구조화. 기본 섬모의 길이는 2-10 μm 사이다릅니다. 그러나, 그 치수는 글리시션, 기아, 저산소증, 세포독성 스트레스, 또는 이온화 방사선3,,4,,5,,6,,7에노출 된 후 변경 될 수 있습니다. 일반적으로, 세포는 세포 증식 및 분화8,,9에중요한 형태 발생 및 세포 신호 경로에 관여하는 단 하나의 1 차실을 갖는다.
1차 섬모는 세포 주기 진행 중에, 특히 G0/G1 단계 동안 동적으로 조절되며, HDAC6(히스톤 deacetylase 6)10에의해 매개되는 튜룰린 탈염과 관련된 과정에서 미토시스를 입력하기 전에 재조판된다. 1차 섬모 재흡수의 정확한 순간은 오로라 A, Plk1, TcTex-1 11,1112,13과같은 이 과정에 직접 관여하는 유전자의 세포 유형 및 발현에 따라 달라집니다.,, 세포 유형에 따라, 1 차 적인 섬모는 수용체의 다른 모형을 표현합니다, 이온 채널, 및 액티브 신호 통로. 이들은 증식및 생존에 영향을 미치는 가장 중요한 신호 수용체를 포함, EGFR, PDGFR, 및 FGFR. 또한 고슴도치, 노치 및 Wnt. 이러한 수용체 및 신호 경로 덕분에 하나 이상의 장기의 기능에 영향을 줄 수 있는 신호 경로 중 일부가 포함되어 있으며, 1차 섬모는 또한 화학 감각 기능을 수행합니다. 이 기능을 통해 1 차 적인 섬모 는 노치에 대 한 특정 리간드를 감지 할 수 있습니다., 호르몬, 그리고 세로토닌 또는 somatostatin 같은 생물학적 활성 물질. 다른 길이의 기본 섬모에 의해 전시 된 다른 특정 기능은 온도, 중력 및 진동(14)의변화에 대한 반응을 포함한다.
1차 섬모는 라이브 시각화, 전송 전자 현미경, 3D 이미징, 또는 1차,섬모5,15,,5,16,17의자동 검출을 위한 소프트웨어에 의해 다양한 방법을 통해 시각화될 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 고도로 전문화 하 고 지속적인 연구 연구의 모든 단계에서 기본, 신속 하 고 쉬운 방법을 필요. 기재된 배양된 세포에서 1차 섬모를 검출하기 위한 쉽고 유용한 방법이기 다.
Protocol
Representative Results
Discussion
몇몇 저자는 1 차적인 섬모의 검출을 위한 다양한 방법을 기술했습니다, 때때로6또한 그들의 검출6,20,,21,,22에영향을 미칠 수 있는 각종 고정 방법을 기술합니다. 에 관계없이 탐지를 위한 완전하고 간단한 프로토콜을 찾기가 어렵습니다. 이러한 방법의 준비 가용성은 의심 할 여지없이 1 차 섬모 조사?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 체코 국방부에 의해 지원되었다 – 장기 조직 개발 계획 군사 보건 과학 학부의 대량 살상 무기의 의료 측면, 국방부; 교육부, 청소년 및 스포츠, 체코 (특정 연구 프로젝트 번호: SV / FVZ201703) 및 PROGRES Q40/06. 또한 다니엘 디아즈에게 영어 개정에 대한 그의 친절한 도움에 감사드립니다.
Materials
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
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