Détection simple des cils primaires par immunofluorescence
Summary
Les cils primaires sont des structures extracellulaires associées au centriole. La détection primaire des cils par coloration immunofluorescente est une procédure relativement simple qui se traduit par des images de haute qualité. Dans ce protocole, les fibroblastes exprimant des cils primaires ont été fixés, immunostained, et photographiés dans un microscope fluorescent ou confocal.
Abstract
Les cils primaires sont régulés dynamiquement au cours de la progression du cycle cellulaire, en particulier pendant les phases G0/G1 du cycle cellulaire, étant résorbés avant la mitose. Les cils primaires peuvent être visualisés avec des méthodes très sophistiquées, y compris la microscopie électronique de transmission, l’imagerie 3D, ou en utilisant un logiciel pour la détection automatique des cils primaires. Cependant, la coloration immunofluorescente des cils primaires est nécessaire pour effectuer ces méthodes. Cette publication décrit un protocole pour la détection facile des cils primaires in vitro en tachant la tubuline alpha acétylée (axoneme) et la tubuline gamma (corps basal). Ce protocole de coloration immunofluorescente est relativement simple et donne des images de haute qualité. Le présent protocole décrit comment quatre lignées cellulaires (C2C12, MEF, NHLF et fibroblastes cutanés) exprimant des cils primaires ont été fixées, immunostainées et imageuses à l’aide d’un microscope fluorescent ou confocal.
Introduction
Les cils primaires sont des structures sensorielles, solitaires, liées à la membrane, non-motiles associées au centriole mère de la cellule. Les cils primaires se trouvent sur la plupart des cellules vertébrées, à l’exception des globules rouges, des adipocytes1et des hépatocytes2. Les cils primaires sont formés sous forme d’axoneme allongé composé de microtubules, dont le principal composant est l’α-tubuline. L’axoneme pousse à partir du corps basal, qui est structuré à partir de γ-tubuline. La longueur des cils primaires varie entre 2 et 10 μm; cependant, ses dimensions peuvent changer pendant la glycylation, la famine, l’hypoxie, le stress cytotoxique, ou après exposition au rayonnement ionisant3,4,5,6,7. Habituellement, les cellules n’ont qu’un seul cilium primaire, qui est impliqué dans la morphogenèse et les voies de signalisation cellulaire importantes pour la prolifération cellulaire et la différenciation8,9.
Les cils primaires sont régulés dynamiquement au cours de la progression du cycle cellulaire, en particulier pendant les phases G0/G1, et résorbés avant d’entrer dans la mitose dans un processus associé à la déacétylation de tubuline médiée par HDAC6 (histone deacetylase 6)10. Le moment exact de la résorption primaire des cils dépend du type de cellule et de l’expression des gènes directement impliqués dans ce processus, tels que Aurora A, Plk1, TcTex-111,12,13. Selon le type de cellule, les cils primaires expriment différents types de récepteurs, canaux ions et voies de signalisation actives. Il s’agit notamment des récepteurs de signalisation les plus importants affectant la prolifération et la survie, EGFR, PDGFR, et FGFR. Sont également inclus quelques-unes des voies de signalisation qui peuvent affecter la fonction d’un ou plusieurs organes, y compris hedgehog, Notch, et Wnt. Grâce à ces récepteurs et voies de signalisation, les cils primaires effectuent également une fonction chimiosensorielle. Cette fonction permet aux cils primaires de détecter des ligands spécifiques pour Notch, les hormones et les substances biologiquement actives comme la sérotonine ou la somatostatine. D’autres fonctions spécifiques exposées par des cils primaires de différentes longueurs incluent la réaction aux changements de température, de gravité et d’osmolalité14.
Les cils primaires peuvent être visualisés par diverses méthodes, telles que la visualisation en direct, la microscopie électronique de transmission, l’imagerie 3D, ou par logiciel pour la détection automatique des cils primaires5,15,16,17. Cependant, ces méthodes sont hautement spécialisées et la recherche continue a besoin de méthodes de base, rapides et faciles pour tacher les cils primaires à chaque étape de la recherche. Décrit est une méthode facile et utile pour la détection des cils primaires dans les cellules cultivées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plusieurs auteurs ont décrit diverses méthodes pour la détection des cils primaires, décrivant parfois également diverses méthodes de fixation qui peuvent affecter leur détection6,20,21,22. Quoi qu’il en soit, il est difficile de trouver un protocole complet et simple pour la détection. La disponibilité immédiate d’une telle méthode serait sans aucun doute d’une grande aide à …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Ministère de la défense de la République tchèque – Plan de développement d’organisations à long terme Aspects médicaux des armes de destruction massive de la Faculté des sciences de la santé militaire de l’Université de la Défense; le Ministère de l’éducation, de la jeunesse et des sports, République tchèque (Projet de recherche spécifique no : SV/ FVZ201703) et PROGRES Q40/06. Merci aussi à Daniel Diaz pour son aimable aide à la révision de la langue anglaise.
Materials
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
References
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