Il saggio di immunoprecipitazione dell’RNA metilato è un metodo a base di anticorpi utilizzato per arricchire i frammenti di RNA metilati. Accoppiato con il sequenziamento profondo, porta all’identificazione di trascrizioni che trasportano la modifica m5C.
Le modifiche di base secondarie sull’RNA, come m5C, influenzano la struttura e la funzione delle molecole di RNA modificate. L’immunoprecipitazione e sequenziamento dell’RNA metilato (MeRIP-seq) è un metodo che mira ad arricchire l’RNA metilato e infine identificare trascrizioni modificate. In breve, l’RNA sonicato viene incubato con un anticorpo per citosina 5 metilate e precipitato con l’aiuto di perline proteiche G. I frammenti arricchiti vengono quindi sequenziati e i potenziali siti di metilazione vengono mappati in base alla distribuzione delle letture e al rilevamento dei picchi. MeRIP può essere applicato a qualsiasi organismo, in quanto non richiede alcuna sequenza precedente o modifica della conoscenza enzimatica. Inoltre, oltre alla frammentazione, l’RNA non è sottoposto ad alcun altro trattamento chimico o di temperatura. Tuttavia, MeRIP-seq non fornisce una previsione mono nucleotidica del sito di metilazione come fanno altri metodi, anche se l’area metilata può essere ristretta ad alcuni nucleotidi. L’uso di diversi anticorpi specifici della modifica consente di regolare merip per le diverse modifiche di base presenti sull’RNA, espandendo le possibili applicazioni di questo metodo.
In tutti e tre i regni della vita, le specie di RNA subiscono modifiche post-trascrizionali e la ricerca su queste modifiche biochimiche funzionalmente rilevanti è chiamata “epitranscriptomica”. L’epitranscriptomica è un campo in crescita e sono in fase di sviluppo vari metodi per studiare e mappare le modifiche sulle molecole di RNA (esaminate in1,2). Sono state trovate più di un centinaio di modifiche all’RNA, rilevate in rRNA, tRNA, altri ncRNA, nonché mRNA3,4. Sebbene la presenza e la funzione di modifiche post-trascrittivi chimicamente diverse in tRNA e rRNA siano ampiamentestudiate 5,6,7,8, solo di recente sono state caratterizzate modifiche all’mRNA. Nelle piante, molte modifiche dell’mRNA sono state identificate fino ad oggi, tra cui m7G alla struttura delcappuccio 9,m1A10, hm5C11,12e uridylation13. Tuttavia, solo m6A10,14,15, m5C11,16,17e pseudouridina18 sono stati mappati a livello di trascrizione in Arabidopsis. Le modifiche alla base dell’mRNA post-trascrizionale sono coinvolte in diversi processidi sviluppo 19,20.
Uno degli approcci più comunemente usati nell’epitranscriptomica è l’immunoprecipitazione dell’RNA metilata accoppiata al sequenziamento profondo (MeRIP-seq). MeRIP-seq è stato sviluppato nel 2012 per studiare m6A nelle cellule dimammifero 21,22. Richiede l’uso di un anticorpo per la modifica desiderata e mira ad arricchire per i frammenti di RNA che trasportano i nucleotidi modificati. Di solito è seguito da un sequenziamento profondo per identificare e mappare i frammenti arricchiti o la PCR quantitativa per verificare specifici obiettivi di RNA. L’accuratezza del MeRIP si basa sulla specificità dell’anticorpo per riconoscere il nucleotide modificato rispetto a modifiche simili (ad esempio, m5C e hm5C11,23). Oltre a m6A, MeRIP-seq è stato applicato anche allo studio m1A e m5C metilazione RNA in diversiorganismi 11,17,23,24,25.
La metilazione della citosina alla quinta posizione di carbonio (m5C) è la modificazione del DNA più diffusa26,27 e una delle modifiche più comuni dell’RNAtroppo 3,4. Mentre m5C è stato rilevato in mRNA eucarioti nel 197528, solo di recente hanno studi focalizzati sulla mappatura della modifica a livello di trascrizione, in RNA di codifica e non codifica11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.
I metodi alternativi utilizzati nellaricerca sull’RNAm 5 C includono la conversione chimica delle citosina non metilate in uracili (sequenziamento della bisolfito) e test di immunoprecipitazione basati su un legame irreversibile di una citosina RNA nota metiltransferasi ai suoi bersagli di RNA (miCLIP, aza-IP). In breve, il sequenziamento della bisulfite sfrutta la caratteristica della citosina 5 metilata per essere resistente al trattamento con bisolfito di sodio che deamina citosina non modificata all’uracile. Il metodo è stato sviluppato per la prima volta per il DNA ma adattato anche per l’RNA e molti studi hanno scelto questo approccio per rilevare siti m5C in RNA16,23,29,32,34,35. Sia miCLIP che aza-IP richiedono una precedente conoscenza dell’RNA citosina metiltransferasi e l’uso del rispettivo anticorpo. Nel caso di miCLIP (metilazione crosslinking a risoluzione individuale nucleotidica e immunoprecipitazione), la metiltransferasi porta una singola mutazione amminoacidica in modo che si lega al substrato di RNA ma non può essererilasciata 30. Nell’immunoprecipitazione dell’RNA mediata da aza-IP (immunoprecipitazione dell’RNA mediata da 5-azacidina), il legame irreversibile si forma tra il nucleoside 5-azaC e l’RNA citosina metiltransferasi quando esogenamente fornito 5-azaC è incorporato da RNA polimerasi in una molecola di RNA bersaglio31.
Il vantaggio principale di questi tre metodi è che consentono la mappatura della risoluzione del singolo nucleotide di m5C. Inoltre, miCLIP e aza-IP forniscono informazioni sugli obiettivi specifici di un RNA citosina metiltransferasi selezionato, decifrando più in profondità il meccanismo e il ruolo delle modifiche dell’RNA post-trascrizionale. Tuttavia, l’approccio MeRIP-seq può identificare le regioni m5C a livello di trascrittome senza alcuna conoscenza precedente richiesta ed evita condizioni chimiche e di temperatura difficili, come il trattamento con bisolfito o l’incubazione con 5-azaC. Sia il sequenziamento del MeRIP che quello della bisolfito possono essere inibiti dalle strutture secondariedell’RNA 36. La fase di frammentazione inclusa nel saggio MeRIP prima dell’immunoprecipitazione mira a facilitare il legame anticorpale e ad aumentare la risoluzione dell’identificazione m5C.
Un altro metodo degno di nota è la spettrometria di massa (MS) dei nucleosidi dell’RNA. La SM può rilevare e distinguere qualsiasi tipo di modifica sia sul DNA che sull’RNA. In breve, l’RNA viene estratto e la DNasi digerita, quindi dissaledata e digerita in singoli nucleosidi. I nucleosidi dell’RNA sono analizzati da uno spettrometro di massa. Questo metodo può essere utilizzato per quantificare i livelli di ogni modifica e non si basa su un anticorpo o una conversione chimica. Tuttavia, uno dei principali svantaggi è che fornisce informazioni in blocco sulla presenza di modifiche all’RNA. Per mappare le modifiche, la SM deve essere combinata con la digestione della RNasi e le informazioni di sequenziamento su molecole di RNA specifiche, come nel caso del tRNAumano Leu(CAA)37.
Qui descriviamo e discutiamo il saggio MeRIP utilizzato per studiare lametilazione dell’RNAm 5 C in Arabidopsis17.
L’RNA trasporta più di cento distinte modifiche di base4 che formano l’epitranscriptome44. Queste modifiche aggiungono un ulteriore livello di regolazione della traduzione e della segnalazione (rivisto in5,6,8,20,45,46). I primi studi sono stati in grado di rilevare la presenza di modifiche post-trascrizionale sull’RNA28,47, ma gli RNA modificati specifici devono essere identificati per comprendere il ruolo dell’epitranscriptomica. MeRIP è stato progettato come metodo per mappare i siti di metilazione dell’RNA a livello di trascrizione21,22. Può essere adattato a qualsiasi modifica, se è disponibile un anticorpo specifico.
La forza principale di questo protocollo è che è relativamente semplice, sicuro per l’RNA e l’utente (ad esempio, 5-azaC è altamente tossico per le piante e l’uomo) e non richiede informazioni enzimatiche di sequenza o modifica. Inoltre, l’arricchimento delle RNA metilate da parte del PI aumenta le possibilità di rilevati mRNA a bassa abbondanza, a differenza del sequenziamento della bisolfito che non contiene una fase di arricchimento. Quando vengono eseguiti due cicli seriali di MeRIP, l’arricchimento in frammenti di RNA contenenti siti di metilazione aumenta ulteriormentedi 22. Una delle limitazioni del MeRIP, specialmente se applicata agli studi di metilazione dell’mRNA, è l’alta quantità di RNA richiesta come input per il saggio. Il passo di ribodeplezione – o arricchimento poli(A) – ridurrà lo sfondo causato dall’RNA ribosomiale pesantemente modificato, ma rimuove oltre il 90% dell’RNA totale. Anche il DNA deve essere completamente rimosso in quanto ricco di citosi metilate a 5 metilati. Un altro inconveniente è la minore risoluzione della posizione esatta della metilazione. La sonicazione dell’RNA prima dell’incubazione con l’anticorpo aiuta in questa direzione restringendo la regione contenente la modifica a 100-200 nucleotidi. Quando il MeRIP è combinato con il sequenziamento profondo, la risoluzione della previsione del sito m5C aumenta man mano che le letture di sequenziamento formano una distribuzione gaussiana attorno al potenziale sito di metilazione. Inoltre, la specificità dell’anticorpo deve essere confermata prima del test (ad esempio, con test di macchie di RNA dot, eseguite con oligidi sintetizzati con nucleotidi modificati), tuttavia, in che misura un anticorpo può effettivamente distinguere tra modifiche strettamente correlate (ad esempio, m6A e m6Am) è un punto di discussione nelcampo 48,49. Inoltre, gli RNA altamente strutturati potrebbero interferire con l’interazione anticorpo-antigene, un’altra restrizione che viene principalmente affrontata con la frammentazione e la denaturazione dell’RNA prima della PI. Al contrario, il sequenziamento della bisulfite che è anche influenzato da strutture secondarie, non include una fase di frammentazione e questo potrebbe essere uno dei motivi che causa discrepanza tra i siti m5C e gli mRNA previsti dal sequenziamento bisolfito16 e MeRIP-seq11,17. Anche altre modifiche della citosina (ad esempio, hm5C) sono resistenti alla deaminazione mediata dalla bisolfito35.
Le modifiche di MeRIP-seq includono un passaggio di reticolo, sia con l’introduzione di un ribonucleoside fotoattivibile (foto-crosslinking-assisted m6A-seq, PA-m6A-seq 50) o utilizzando la luce UV per creare collegamenti incrociati anticorpo-RNA dopo l’IP (miCLIP49, metodo diverso rispetto al miCLIP descritto nell’introduzione30, ma anche con risoluzione del nucleotide individuale). In futuro, e poiché le conoscenze sulla metilazione dell’RNA si stanno accumulando, potrebbero essere preferibili approcci più mirati, basati sugli enzimi di modifica e/o sulle sequenze di consenso in cui appare la metilazione. L’identificazione delle proteine del lettore è essenziale per la comprensione della funzione molecolare e di segnalazione delle modifiche post-trascrizionale. La tecnologia di sequenziamento dei nanopore consente già l’identificazione diretta di nucleotidi modificati senza trattamento preventivo dell’RNA17, ma c’è ancora spazio per miglioramenti in questo campo per quanto riguarda la profondità della sequenza e l’analisi bioinformatica. Nel complesso, MeRIP-seq è attualmente un approccio consolidato, affidabile e imparziale per identificare le trascrizioni di RNA metilato.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da uno stipendio di dottorato IMPRS a E.S, una borsa di studio a lungo termine EMBO per V.P., e fondi interni MPI-MPP a F.K. Parte di questo lavoro è stato finanziato anche attraverso PLAMORF, un progetto che ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell’ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell’Unione Europea (accordo di sovvenzione n. 810131). Gli autori ringraziano Federico Apelt per l’analisi bioinformatica e i commenti sul manoscritto, e Mathieu Bahin e Amira Kramdi per l’analisi bioinformatica.
α‐m5C antibody | ZymoResearch | A3001 (discontinued), A3002 available | Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available |
Chip and reagents for capillary electrophoresis | Agilent | 5067-1511 | RNA 6000 Nano kit |
Dnase | Ambion | AM1907 | TURBO DNA-free kit |
Co-precipitant of nucleic acids | Ambion | AM9515 | Glycoblue, 15 mg/mL |
In vitro transcription kit | Promega | P1300 | T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System |
Low-binding reaction tubes | Kisker Biotech | G017 | 1.7 ml microcentrifuge tubes |
Protein G magnetic beads | Invitrogen | 10003D | Dynabeads Protein G |
Proteinase K | Ambion | AM2546 | 20mg/mL stock solution, RNA grade |
RNase inhibitor | Promega | N2615 | RNasin Plus 40 U/μl |
rRNA removal kit | Epicentre | RZPL11016 | Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf) |
Sonication tubes | Covaris | 520045 | microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm |
RNA extraction reagent | Ambion | 15596018 | TRIzol reagent |
Equipment | |||
Capillary electrophoresis machine | Agilent | G2939BA | 2100 Bioanalyzer System |
Magnetic rack | Invitrogen | 12321D | DynaMag-2 |
Microentrifuge | Eppendorf | discontinued | 5417R model |
Rotator | Benchmark | R4040 | RotoBot Mini |
Sonicator | Covaris | 500217 | S220 Focused-ultrasonicator |
Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONEC-W | NanoDrop OneC |
Waterbath | GFL | 1012 | 1012 Incubation bath |