메틸화 RNA 면역 침전 분석법은 메틸화 RNA 단편을 농축하는 데 사용되는 항체 기반 방법입니다. 깊은 시퀀싱과 결합하여 m5C수정을 운반하는 성적 증명서를 식별합니다.
m5C와 같은 RNA에 대한 이차 염기 수정은 변형된 RNA 분자의 구조및 기능에 영향을 미칩니다. 메틸화 RNA 면역 침전 및 시퀀싱 (MeRIP-seq)은 메틸화 된 RNA를 풍부하게하고 궁극적으로 수정 된 성적 증명서를 식별하는 것을 목표로하는 방법입니다. 간략하게, 초음파 처리된 RNA는 5-메틸화 된 사이토신을 위한 항체로 배양되고 단백질 G 비드의 도움으로 침전됩니다. 농축된 조각은 시퀀스되고 잠재적인 메틸화 사이트는 읽기 및 피크 검출의 분포를 기반으로 매핑됩니다. MeRIP는 어떤 이전 서열 또는 효소 지식을 수정할 필요가 없기 때문에 어떤 유기체든지에 적용될 수 있습니다. 또한, 단편화 외에 RNA는 다른 화학적 또는 온도 처리를 거치지 않는다. 그러나, MeRIP-seq는 메틸화 부위를 다른 방법으로메틸화 부위의 단일 뉴클레오티드 예측을 제공하지 않지만, 메틸화 부위는 몇 가지 뉴클레오티드로 좁힐 수 있다. 상이한 변형 특이적 항체의 사용은 MeRIP가 RNA에 존재하는 상이한 기저 변형을 위해 조정될 수 있게 하여, 이 방법의 가능한 적용을 확대한다.
생명의 모든 세 왕국에서, RNA 종은 전사 후 수정을 겪고 이러한 기능적으로 관련된 생화학 적 변형에 대한 연구는 “epitranscriptomics”라고합니다. 상피학은 성장하는 분야이며 RNA 분자에 대한 수정을 연구하고 매핑하기 위해 다양한 방법이 개발되고있다(1,2에서검토됨). 100개 이상의 RNA 수정이 발견되었으며, rRNA, tRNA, 기타 ncRNAs뿐만 아니라 mRNA3,4에서검출되었다. tRNA 및 rRNA에서 화학적으로 다양한 전사 후 변형의 존재와 기능은광범위하게연구되어 있지만5,6,7,8,최근에만 mRNA 변형이 특징지어지고 있다. 식물에서, 많은 mRNA 수정은 캡 구조9,m 1 A10,hm5C11,12및 소변13에서m7G를 포함하여 현재까지 확인되었다. 그러나, 만 m6A10,14,15,m5C11,16,17, 및 슈도우리딘(18)은 아라비도시스에서 전사를 매핑했다. 전사 후 mRNA 기본 수정은 여러 발달 과정에관여한다(19,20).
상피학에서 가장 일반적으로 사용되는 접근법 중 하나는 깊은 시퀀싱 (MeRIP-seq)과 결합 된 메틸화 RNA 면역 침전입니다. MeRIP-seq는 2012년에 포유류 세포21,22에서m6A를 연구하기 위해 개발되었다. 원하는 변형을 위해 항체의 사용을 요구하고 변형된 뉴클레오티드(들)를 운반하는 RNA 단편을 농축하는 것을 목표로 한다. 그것은 일반적으로 특정 RNA 표적을 확인하기 위하여 농축된 단편 또는 정량PCR을 확인하고 지도하기 위하여 깊은 순서에 선행됩니다. MeRIP의 정확도는 유사한 수정(예를 들어, m5C 및 hm5C11,23)을통해 수정된 뉴클레오티드를 인식하기 위해 항체의 특이성에 기초한다. m6A 외에, MeRIP-seq는 또한 여러유기체에서m 1 A 및 m5C RNA 메틸화를 연구하도록 적용되었습니다11,17,23,24,25.
제5 탄소 위치(m5C)에서 사이토신의 메틸화는 가장 널리 퍼진 DNA변형(26,27) 및 가장 일반적인 RNA 수정 중 하나도3,4이다. m5C는 1975년28년진핵mRNA에서 검출되었지만, 최근에는 코딩 및 비코딩 RNA11,16,17,23, 29,30,31,32,33, 34로수정 전사를 매핑하는 데 초점을 맞춘 연구가 최근에있다.
m5 CRNA 연구에서 사용되는 대체 방법은 비메틸화 사이토신을 우라실로 화학적 변환(bisulfite 시퀀싱) 및 면역침전 분석법은 알려진 RNA 사이토신 메틸 전달제의 돌이킬 수 없는 결합을 기반으로 RNA 표적(miCLIP, aza-IP)을 포함한다. 간단히 말해서, 비황피테 시퀀싱은 5메틸화 된 시토신의 특징을 우라실에 수정되지 않은 사이토신을 분해하는 비설피트 나트륨 치료에 내성이 있습니다. 이 방법은 DNA를 위해 처음 개발되었지만 RNA에 맞게 조정되었으며 많은연구가 RNA16,23,29,32,34,35에서m5C 부위를 검출하는 이접근법을선택했습니다. miCLIP과 aza-IP 모두 RNA 시토신 메틸 트랜스퍼라제및 각각의 항체의 사용에 대한 이전의 지식을 필요로 한다. miCLIP의 경우(메틸화 개인-뉴클레오티드-해상도 교차 연결 및 면역 침전), 메틸 트랜스퍼라제는 RNA 기판에 결합하지만30을방출할 수 없도록 단일 아미노산 돌연변이를 전달한다. 아자-IP(5-아자시티딘-중재 RNA 면역침전)에서 돌이킬 수 없는 결합은 5-azaC 뉴클레오시드와 RNA 사이균성 메틸전달효소 사이에 형성되며 외인성 제공시 5-아자C는 RNA 폴리머라제에 의해 표적 RNA분자(31)로통합된다.
이 세 가지 방법의 주요 장점은 m5C의 단일 뉴클레오티드 분해능 매핑을 허용한다는 것입니다. 또한, miCLIP 및 aza-IP는 선택된 RNA 사이토신 메틸 트랜스퍼라제의 특정 표적에 대한 정보를 제공하여 전사 후 RNA 수정의 메커니즘과 역할을 더 깊게 해독한다. 그러나, MeRIP-seq 접근법은 사전 지식이 필요 없이 전사 폭 m5C 영역을 식별할 수 있으며, 5-azaC를 가진 bisulfite 처리 또는 잠복과 같은 가혹한 화학 및 온도 조건을 피할 수 있습니다. MeRIP 및 bisulfite 염열은 이차 RNA구조(36)에의해 억제될 수 있다. 면역 침전 전에 MeRIP 분석체에 포함된 단편화 단계는 항체 결합을 용이하게 하고 m5C 식별의 해상도를 높이는 것을 목표로 한다.
언급 할 가치가있는 또 다른 방법은 RNA 뉴클레오시드의 질량 분석법 (MS)입니다. MS는 DNA와 RNA모두에서 모든 유형의 수정을 감지하고 구별할 수 있습니다. 간략하게, RNA는 추출되고 DNase소화되고, 그 때 탈염되고 단 하나 뉴클레오시드로 소화됩니다. RNA 뉴클레오시드는 질량 분광계에 의해 분석된다. 이 방법은 각 수정의 수준을 정량화하는 데 사용할 수 있으며 항체 또는 화학 적 변환에 의존하지 않습니다. 그러나, 주요 단점은 RNA 수정의 존재에 대 한 대량 정보를 제공 하는 것입니다. 수정을 매핑하기 위해 MS는 인간 tRNALeu(CAA)37의경우와 같이 특정 RNA 분자에 대한 RNase 소화 및 시퀀싱 정보와 결합되어야합니다.
여기서, 우리는 설명하고 아라비도시스에서 m5C RNA 메틸화를 연구하는 데 사용되는 MeRIP 분석체를17.
RNA는 에피레미네임(44)을 형성하는 100개 이상의 뚜렷한 염기 변형4를 운반한다. 이러한 수정은 번역 및 신호의 추가조절 계층을 추가합니다(5,6,8,20,45,46에서검토됨). 초기 연구는 RNA28,47에 전사 후 수정의 존재를 검출할 수 있었습니다 그러나 특정 수정한 RNA는 epitranscriptomics의 역할을 이해하기 위하여 확인될 필요가 있습니다. MeRIP는 RNA 메틸화 부위 를 매핑하는 방법으로 설계되었다 전사 적 폭21,22. 특정 항체가 가능한 경우 어떤 수정에 적응할 수 있다.
이 프로토콜의 주요 강점은 RNA 및 사용자(예를 들어, 5-azaC는 식물과 인간에게 매우 독성이 있음)에 비교적 간단하며 안전하며 서열 또는 효소 정보를 수정할 필요가 없다는 것입니다. 더욱이, IP에 의한 메틸화 된 RNA의 농축은 농축 단계를 포함하지 않는 비설피테 시퀀싱과 달리 검출될 가능성이 낮다. MeRIP의 두 개의 직렬 탄환이 수행되면, 메틸화 부위를 포함하는 RNA 단편의 농축은22더증가한다. MeRIP의 한계 중 하나는 특히 mRNA 메틸화 연구에 적용될 때 분석에 대한 입력으로 요구되는 다량의 RNA이다. 리보데플레이션 – 또는 폴리(A) 농축 – 단계는 심하게 변형된 리보소말 RNA에 기인한 배경을 감소시키지만 총 RNA의 90% 이상을 제거합니다. DNA는 또한 5메틸화 된 사이토신이 풍부하기 때문에 완전히 제거해야합니다. 또 다른 단점은 메틸화의 정확한 위치의 낮은 해상도입니다. 항체를 가진 잠복하기 전에 RNA의 초음파 처리는 100-200 뉴클레오티드로 수정을 포함하는 영역을 좁혀서 이 방향을 향해 돕는다. MeRIP가 심층 시퀀싱과 결합되면 시퀀싱 판독이 잠재적메틸화 부위 를 중심으로 가우시안 분포를 형성함에 따라 m5C 사이트 예측의 해상도가 증가합니다. 추가적으로, 항체의 특이성은 분석(예를 들어, RNA 도트 블롯 분석, 수정된 뉴클레오티드로 합성된 올리고체로 수행됨) 이전에 확인되어야 하지만, 항체가 실제로 밀접하게 관련된 수정(예를 들어, m6A 및 m6Am)을구별할 수 있는 정도까지는48,499의분야에서 논쟁의 포인트이다. 더욱이, 고도로 구조화된 RNA는 항체-항원 상호작용을 방해할 수 있으며, IP 이전에 RNA의 단편화 및 탈약으로 주로 해결되는 또 다른 제한이다. 반대로, 이차 구조물에 의해도 영향을 받는 비설피테 염기서열분석은 단편화 단계를 포함하지 않으며, 이는 비설피테 시퀀싱16 및 MeRIP-seq11,17에의해 예측된m5C 사이트와 mRNA 사이의 불일치를 유발하는 한 가지 이유가 될 수 있다. 다른 사이토신 변형 (예를 들어, hm5C)도 비설피티 중재 탈약(35)에내성이 있습니다.
MeRIP-seq의 변형은 광액활성 리보뉴클레오시드(사진-크로스링크-어시스트 m6A-seq, PA-m6A-seq 50)또는 UV 라이트를 이용하여 IP(miCLIP49,미클립에 설명된 miCLIP-30, 미CLIP-30)의 도입과 다른 방법)을 도입한 교차연결 단계를 포함한다. 미래에, RNA 메틸화에 대한 지식이 축적됨에 따라, 메틸화가 나타나는 효소 및/또는 합의 서열에 기초하여 더 많은 표적 접근법이 바람직할 수 있다. 독자 단백질의 식별은 전사 후 수정의 분자 및 신호 기능에 대한 이해에 필수적입니다. 나노포어 시퀀싱 기술은 이미 RNA17의 사전 치료 없이 수정된 뉴클레오티드의 직접 식별을 허용하지만, 서열 깊이 및 생물정보 분석에 관한 이 분야에 대한 개선의 여지가 여전히 존재한다. 전반적으로, MeRIP-seq는 현재 메틸화 된 RNA 전사체를 식별하기 위해 확립되고 신뢰할 수 있으며 편견없는 접근 방식입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 E.S에 IMPRS 박사 학위 급여에 의해 지원되었다, V.P.에 EMBO 장기 펠로우십, 이 작품의 일부에 MPI-MPP 내부 자금은 PLAMORF를 통해 지원되었다, 유럽 연합 (EU의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램)에 따라 유럽 연구 위원회 (ERC)에서 자금을받은 프로젝트 (그랜트 No.81) 연구 및 혁신 프로그램 (그랜트 No.) 81. 저자는 생물 정보 학에 대한 생물 학적 분석및 의견에 대한 페데리코 아펠트, 생물 정보 학적 분석을위한 마티유 바힌과 아미라 크람디에게 감사드립니다.
α‐m5C antibody | ZymoResearch | A3001 (discontinued), A3002 available | Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available |
Chip and reagents for capillary electrophoresis | Agilent | 5067-1511 | RNA 6000 Nano kit |
Dnase | Ambion | AM1907 | TURBO DNA-free kit |
Co-precipitant of nucleic acids | Ambion | AM9515 | Glycoblue, 15 mg/mL |
In vitro transcription kit | Promega | P1300 | T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System |
Low-binding reaction tubes | Kisker Biotech | G017 | 1.7 ml microcentrifuge tubes |
Protein G magnetic beads | Invitrogen | 10003D | Dynabeads Protein G |
Proteinase K | Ambion | AM2546 | 20mg/mL stock solution, RNA grade |
RNase inhibitor | Promega | N2615 | RNasin Plus 40 U/μl |
rRNA removal kit | Epicentre | RZPL11016 | Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf) |
Sonication tubes | Covaris | 520045 | microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm |
RNA extraction reagent | Ambion | 15596018 | TRIzol reagent |
Equipment | |||
Capillary electrophoresis machine | Agilent | G2939BA | 2100 Bioanalyzer System |
Magnetic rack | Invitrogen | 12321D | DynaMag-2 |
Microentrifuge | Eppendorf | discontinued | 5417R model |
Rotator | Benchmark | R4040 | RotoBot Mini |
Sonicator | Covaris | 500217 | S220 Focused-ultrasonicator |
Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONEC-W | NanoDrop OneC |
Waterbath | GFL | 1012 | 1012 Incubation bath |