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Developmental Biology

कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस से प्रोटीन एक्सट्रैक्ट तैयारी और सह-इम्यूनोप्रिपिटेशन

Published: May 23, 2020 doi: 10.3791/61243
Automatic Translation
1, 1
1Division of Biology, Kansas State University

Summary

यह विधि कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस नमूनों और बाद में सह-इम्यूनोप्रिपिटेशन से उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन निकालने की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करती है।

Abstract

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए अक्सर सह-इम्यूनोप्रिपिपिटेशन विधियों का उपयोग किया जाता है। परिकल्पना प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की पुष्टि या नए लोगों की पहचान ब्याज के प्रोटीन के कार्य के बारे में अमूल्य जानकारी प्रदान कर सकती है। तैयारी निकालने के लिए पारंपरिक तरीकों में से कुछ अक्सर श्रम-गहन और समय लेने वाली तकनीकों की आवश्यकता होती है। यहां, एक संशोधित निकालने की तैयारी प्रोटोकॉल एक मनका मिल होमोजेनाइजर और धातु मोतियों का उपयोग कर पारंपरिक प्रोटीन तैयार करने के तरीकों के लिए एक तेजी से विकल्प के रूप में वर्णित है । यह निकालने की तैयारी विधि डाउनस्ट्रीम सह-इम्यूनोप्रिपिपिटेशन अध्ययनों के साथ संगत है। एक उदाहरण के रूप में, विधि का उपयोग सी एलिगेंस माइक्रोआर्पॉन्स माइक्रोआर्पॉन्ट एएलजी-1 और दो ज्ञात एएलजी-1 इंटरेक्टर्स: AIN-1, और HRPK-1 को सफलतापूर्वक सह-इम्यूनोप्रिपिपेट करने के लिए किया गया था। इस प्रोटोकॉल में पशु नमूना संग्रह, निकालने की तैयारी, स्पष्टीकरण निकालने और प्रोटीन इम्यूनोप्रिपिटेशन का विवरण शामिल है। वर्णित प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार की आनुवंशिक पृष्ठभूमि में किसी भी दो या अधिक अंतर्जात, अंतर्जात टैग, या अतिव्यक्त सी एलिगेंस प्रोटीन के बीच बातचीत के लिए परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

ब्याज के प्रोटीन के मैक्रोमॉलिकुलर इंटरैक्शन की पहचान करना इसके कार्य के बारे में अधिक सीखने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। इम्यूनोप्रिपिपिटेशन और सह-इम्यूनोप्रिपिCIPITेशन प्रयोगों का उपयोग बड़े पैमाने पर प्रोटेओमिक दृष्टिकोण1 के माध्यम से प्रोटीन के पूरे इंटरटक्टोम की पहचान करने या विशेष रूप से एक प्रोटीन की एक परिकल्पना इंटरैक्टेटर के साथ सहप्रेषण करने की क्षमता का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। सी एलिगेंसमें, विभिन्न प्रकार के प्रोटीन की गतिविधि के बारे में अधिक जानने के लिए दोनों तरीकों को सफलतापूर्वक नियोजित किया गयाहै, जिनमें जीन अभिव्यक्ति2,3,4को विनियमित करने के लिए माइक्रोआरएनए के साथ बारीकी से कार्य करने वाले लोग शामिल हैं। सह-इम्यूनोप्रिपिcipitेशन प्रयोगों को अपने मूल सेलुलर वातावरण में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का परीक्षण करने का लाभ होता है, लेकिन निकालने की तैयारी चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाली हो सकती है। नमूने का कुशल लाइसिस आवश्यक है, लेकिन प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के व्यवधान को कम करने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए। सी एलिगेंस टोटल प्रोटीन अर्क को सफलतापूर्वक तैयार करने के लिए5,सोनिकेशन6,बाल्च समरूपता7,और जिरकोनिया मोतियों-समरूपीकरण8,9 जैसे तरीकों का उपयोग किया गया है। इन तरीकों, जिरकोनिया मनका समरूपता के अपवाद के साथ, नमूनों की संख्या के संदर्भ में सीमाएं हैं जिन्हें एक साथ संसाधित किया जा सकता है। प्रस्तुत एक वैकल्पिक विधि है जिसे आसानी से उच्च-थ्रूपुट, सी एलिगेंस नमूनों से तेजी से प्रोटीन निकालने की तैयारी के लिए अनुमति देने के लिए बढ़ाया जा सकता है जिसके बाद सह-इम्यूनोप्रिपिपिटेशन होताहै। विशेष रूप से, विधि एक समय में 24 नमूने तैयार कर सकती है, जो एक्सट्रैक्ट तैयार करने के लिए आवश्यक समय को कम कर सकती है। इसके विपरीत, उदाहरण के लिए, douncing आम तौर पर एक समय में केवल एक नमूना तैयारी के लिए अनुमति देता है । इस निकालने की विधि का उपयोग सी एलिगेंसके किसी भी विकासात्मक चरण से अर्क तैयार करने के लिए किया जा सकता है।

वर्णित पशु नमूना संग्रह, निकालने की तैयारी, इम्यूनोप्रिपिटेशन, और पश्चिमी ब्लॉटिंग डेटा की प्रस्तुति के लिए एक कदम-दर-कदम प्रक्रिया है ताकि सफल प्रोटीन पुलडाउन और ब्याज के सह-इम्यूनोप्रिपिटिंग प्रोटीन का पता लगाने की पुष्टि की जा सके। प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करने के लिए, 1) माइक्रोआरएनए आर्गोन्यूट एएलजी-1 और एईएनएन-1, एक GW182 होमोलॉग के बीच दो सह-इम्यूनोप्रिपिपिटेशन प्रयोग किए गए; और 2) एएलजी-1 और एचआरपीके-1, एक नव पहचाने गए एएलजी-1 इंटरएक्टिव2। एएलजी-1 और एइन-1 कोर प्रोटीन हैं जिनमें माइक्रोआरएनए-प्रेरित सिलिंग कॉम्प्लेक्स (miRISC) शामिल है और इन दो प्रोटीनों के बीच बातचीत अच्छी तरह से10, 11स्थापितहै। एक्सट्रैक्ट तैयार करने का प्रोटोकॉल एएलजी-1-एआईएन-1 सह-इम्यूनोप्रिपिटेशन प्रयोग में प्रभावी था। इस प्रोटोकॉल ने एएलजी-1 और इसके नए पहचाने गए इंटरएक्टिवेटर एचआरपीके-12के बीच बातचीत की सफलतापूर्वक पुष्टि की ।

संक्षेप में, पांडुलिपि एक सी एलिगेंस एक्सट्रैक्ट तैयारी प्रोटोकॉल का वर्णन करती है जिसे सह-इम्यूनोप्रिपिCIPITेशन प्रोटोकॉल के साथ 24 नमूनों को एक साथ संसाधित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है जिसका उपयोग प्रोटीन के बीच नए या परिकल्पना बातचीत की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। निकालने की तैयारी प्रोटोकॉल कई डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के साथ संगत है, जिसमें प्रोटीन इम्यूनोप्रिपिटेशन2 और माइक्रोआरएनए पुलडाउन12शामिल हैं। इसके अलावा, इम्यूनोप्रिपिपिटेशन प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार की आनुवंशिक पृष्ठभूमि में किसी भी दो या अधिक अंतर्जात, अंतर्जात टैग, या अतिउच्च सी एलिगेंस प्रोटीन के बीच बातचीत के लिए परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Protocol

1. कृमि नमूना संग्रह

  1. बीज मिश्रित चरण या आवश्यक तापमान पर एनजीएम ठोस प्लेटों पर13 कीड़े सिंक्रोनाइज्ड और वांछित चरण तक कीड़े को बढ़ने की अनुमति देते हैं। बुनियादी सी एलिगेंस विकास और रखरखाव के लिए, कृपया Stiernagle एट अल और पोर्टा-डी-ला-रिवा एट अल14,13देखें ।
  2. M9 बफर के साथ कीड़ा प्लेटों को धोकर 15 एमएल शंकुल सेंट्रलाइज ट्यूब में कीड़े ले लीजिए।
  3. 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 400 x ग्राम पर अपकेंद्री द्वारा कीड़े को गोली दें और सुपरनैंट को त्यागें।
    नोट: निकालने की तैयारी के लिए कृमि गोली का आकार 100 माइक्रोन और 500 माइक्रोन के बीच है। डाउनस्ट्रीम इम्यूनोप्रिपिटेशन प्रयोगों के लिए पैक किए गए कीड़े के 300 माइक्रोनल गोली की सिफारिश की जाती है और आम तौर पर ~ 4.5 मिलीग्राम कुल प्रोटीन की पैदावार होती है, जबकि 500 माइक्रोनल गोली कुल प्रोटीन की ~ 7.5 मिलीग्राम निकलेगी।
  4. M9 बफर के साथ अतिरिक्त 3-5 वॉश करें (तालिका 1देखें) या जब तक कि सुपरनैंट अब बादल न हो जाए।
  5. डीडीएच2ओ के साथ एक अंतिम वॉश करें।
  6. ढीले कृमि गोली को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब पर ले जाएं और 2 मिनट के लिए आरटी में 400 x ग्राम पर नीचे स्पिन करें। एक पैक कीड़ा गोली प्राप्त करने के लिए शेष सुपरनेट को त्यागें और तैयारी निकालने के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । वर्म छर्रों को तुरंत तरल नाइट्रोजन में फ्लैश किया जा सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस या तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किया जा सकता है। कृपया ध्यान दें कि कीड़े छर्रों केवल एक बार गल सकता है और फिर से जमे नहीं किया जा सकता है ।

2. कृमि गोली की तैयारी निकालें

नोट: निकालने की तैयारी बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर की जानी चाहिए।

  1. यदि जमे हुए हैं, तो बर्फ पर कीड़ा गोली गल।
    नोट: यदि नमूना संग्रह के दौरान 300 माइक्रोन का वांछित पैक किया गया कृमि गोली का आकार प्राप्त नहीं किया गया था, तो आगे निष्कर्षण के लिए पर्याप्त सामग्री मौजूद होने तक कई छोटे छर्रों को जोड़ा जा सकता है।
  2. बर्फ-ठंड 2x लाइसिस बफर (60 mM HEPES, पीएच = 7.4, 100 m m पोटेशियम क्लोराइड, 0.1% ट्राइटन एक्स, 4 एमएम मैग्नीशियम क्लोराइड, 10% ग्लाइस्रोल, 2 M M DTT के साथ RNase अवरोधक, प्रोटीज अवरोधक, और phosphatase अवरोधक; तालिका 1देखें) और भंवर या पिपेट ऊपर और नीचे मिश्रण करने के लिए। ट्यूब के नीचे मिश्रण को इकट्ठा करने के लिए ट्यूब (एस) को स्पिन करें।
  3. मिश्रण को धातु के मोतियों वाले 1.5 एमएल आरएनएसे-मुक्त ट्यूब में ले जाएं (सामग्री की तालिकादेखें) और नमूना को 4 डिग्री सेल्सियस पर मनका मिल होमोजेनाइजर (सामग्री की तालिकादेखें) में रखें। सुनिश्चित करें कि ट्यूब टोपियां कस रहे हैं और नमूने समरूप के अंदर संतुलित कर रहे हैं।
  4. 4 मिनट के लिए उच्चतम गति (12 सेटिंग) पर नमूना समरूप।
  5. मोतियों से नमूना निकालें और इसे एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें। वैकल्पिक रूप से, होमोजेनाइजर के साथ प्रदान किए गए एक चुंबक का उपयोग नमूने से मोतियों को हटाने के लिए किया जा सकता है।
  6. प्रोटीन निकालने को स्पष्ट करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 19,000 x ग्राम पर निकालने को स्पिन करें।
  7. बर्फ पर एक ताजा 1.5 एमएल ट्यूब में सुपरनैंट स्थानांतरित करें, जबकि सफेद, बादल के ऊपर से बचने के लिए जो नमूने के शीर्ष पर रूपों। सुपरनैक्ट अब स्पष्ट उद्धरण है।
    नोट: कुल प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करने के लिए स्पष्ट निकालने के 10 μL सहेजें।
  8. निम्नलिखित प्रयोगों के लिए तुरंत अर्क का उपयोग करें या तरल नाइट्रोजन में निकालने को फ्लैश करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रुका जा सकता है । अर्क अल्ट्रालो तापमान (-80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर या ~ 6 महीने के लिए तरल नाइट्रोजन) पर संग्रहीत किया जा सकता है। जमे हुए अर्क एक बार गल सकता है और फिर से जमे हुए नहीं किया जा सकता है।
  9. निर्माता के निर्देशों के अनुसार डिटर्जेंट (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ संगत प्रोटीन एकाग्रता परख किट का उपयोग करके निकालने की कुल प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें।

3. इम्यूनोप्रिपिटेशन

नोट: निकालने की तैयारी के लिए सभी इम्यूनोप्रिपिटेशन चरण बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर किए जाने चाहिए। प्रत्येक इम्यूनोप्रिपिटेशन के लिए 2 मिलीग्राम कुल प्रोटीन का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। हालांकि, कुल प्रोटीन के 0.8-1 मिलीग्राम के साथ सफल इम्यूनोप्रिपिपिटेशन किया गया है। हमेशा ताजा या हौसले से गल प्रोटीन अर्क का उपयोग करें। निम्नलिखित प्रोटोकॉल को कुल प्रोटीन के 2 मिलीग्राम, या एक एकल इम्यूनोप्रिपिशन प्रयोग से इम्यूनोप्रिपिपिटेशन करने के लिए रेखांकित किया गया है। मोतियों और एंटीबॉडी की मात्रा को कई नमूनों के लिए तदनुसार बढ़ाया या घटाया जा सकता है या यदि प्रोटीन निकालने की एक अलग मात्रा का उपयोग किया जाता है।

  1. बर्फ पर प्रोटीन निकालने की जगह या गल जाएं। नमूना 10 मिलीग्राम/एमएल या 5 मिलीग्राम/एमएल बर्फ-ठंड 1x lysis बफर के साथ पतला किया जा सकता है (तालिका 1देखें) ।
  2. चुंबकीय मोतियों को उलटा करके फिर से 150 माइक्रोन को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 50% मोतियों के निलंबन को स्थानांतरित करें। 1 मिनट के लिए या समाधान स्पष्ट होने तक चुंबकीय स्टैंड के खिलाफ बर्फ पर मोतियों को चुंबकीय करें। सुपरनेट को त्याग दें।
  3. ट्यूब को चुंबकीय स्टैंड से हटा दें और मनका घोल के 2 वॉल्यूम (यानी 300 माइक्रोन) का उपयोग करके 1x लाइसिस बफर में मोतियों को धोएं। कुल तीन वॉश के लिए वॉश 2x दोहराएं।
  4. मोतियों को बर्फ की ठंडी तरह के बफर के 150 माइक्रोन में रीसस्ट करें।
  5. मनका घोल के 75 माइक्रोन को 2 मिलीग्राम प्रोटीन एक्सट्रैक्ट में स्थानांतरित करें और कोमल आंदोलन के साथ 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। बाद में उपयोग के लिए बर्फ पर शेष मनका निलंबन बचाओ।
    नोट: यह कदम इम्यूनोप्रिपिपिटेशन चरण के दौरान मोतियों के लिए गैर-विशिष्ट प्रोटीन को कम करने के लिए किया जाता है।
  6. ट्यूब को 1 मिनट के लिए बर्फ पर चुंबकीय स्टैंड पर नमूने के साथ रखें या जब तक मोती पूरी तरह से चुंबकीय न हो जाएं और नमूना स्पष्ट न हो जाए। सुपरनेट को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें; मोतियों को परेशान न करें। यह प्रीक्लीयर्ड प्रोटीन लिएट है। पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए नमूने का 10% बचाओ।
  7. कोमल आंदोलन के साथ 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर आत्मीयता शुद्ध एंटीबॉडी के 20 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: इम्यूनोप्रिपिपिटेशन के लिए उपयोग की जाने वाली एंटीबॉडी की मात्रा एंटीबॉडी और प्रोटीन के लिए विशिष्ट है और इसे अनुभवजन्य रूप से लक्षित प्रोटीन की प्रभावी इम्यूनोप्रिपिपिटेशन सुनिश्चित करने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए।
  8. प्रीवॉश किए गए मोतियों के शेष 75 माइक्रोन (चरण 3.5) को एंटीबॉडी/lysate मिश्रण में जोड़ें और कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  9. ट्यूब को 1 मिनट के लिए बर्फ पर चुंबकीय स्टैंड में रखें या जब तक मोतियों को पूरी तरह से चुंबकीय न किया जाए और नमूना स्पष्ट न हो जाए। पश्चिमी दाग विश्लेषण (वैकल्पिक) के लिए सुपरनॉट सहेजें।
  10. वॉश बफर (30 एमएम एचईपीई, पीएच = 7.4, 100 एमएम पोटेशियम क्लोराइड, 0.1% ट्राइटन एक्स, 2 एमएम मैग्नीशियम क्लोराइड, 10% ग्लिसरोल, 1 एमएम डीटी; आइस पर टेबल 1 देखें) में इम्यूनोप्रेसिपिटेट 3xयुक्त मोतियों को धोएं।
    नोट: यदि अधिक कठोर धोने की स्थिति को प्राथमिकता दी जाती है तो अतिरिक्त वॉश किए जा सकते हैं।
  11. 2x SDS/BME प्रोटीन जेल लोडिंग बफर (सामग्रीकी मेज देखें) के 20 माइक्रोन में मनका गोली को फिर से खर्च करें और एसडीएस-पेज जेल पर लोड होने से पहले 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबालकर विकृत करें । वैकल्पिक रूप से, विकृत नमूनों को कई महीनों तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    नोट: मनका इम्यूनोप्रिपिपेट का एक हिस्सा डाउनस्ट्रीम आरएनए अलगाव के लिए बचाया जा सकता है, यदि वांछित हो ।

4. आईपी नमूनों का पश्चिमी दाग का पता लगाने

  1. एसडीएस-पेज जेल पर आईपी नमूनों को लोड करें (सामग्री की तालिकादेखें)। नमूने की आकांक्षा से पहले 1 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर आईपी ट्यूब रखकर मोतियों को स्थानांतरित करने से बचें।
  2. निम्नलिखित संशोधनों के साथ पश्चिमी ब्लॉटिंग15,16 और एंटीबॉडी धुंधला16 करें: एएलजी-1 एंटीबॉडी17 1:500 को 5% गैर-वसा शुष्क दूध (एनएफडीएम) में पतला करें; 5% एनएफडीएम में एचआरपीके-1 एंटीबॉडी2 1:1,000 को पतला करें; और 5% एनएफडीएम में AIN-1 एंटीबॉडी18 1:10,000 को पतला करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार माध्यमिक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग किया गया था।
  3. एचआरपी-आधारित रसायनीयसेंस के साथ बैंड का पता लगाएं (सामग्री की तालिकादेखें)।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल (चित्रा 1में स्कैमित) का उपयोग कई प्रोटीन2 (चित्रा 3और चित्रा 4)के डाउनस्ट्रीम इम्यूनोप्रिपिटेशन के लिए सी एलिगेंस टोटल प्रोटीन अर्क(चित्रा 2) प्राप्त करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया था। प्रस्तुत मनका मिल समरूप प्रोटोकॉल कुल प्रोटीन निष्कर्षण में dounce आधारित तरीकों(चित्रा 2)और कुशलता से निकाले गए परमाणु (COL-19::GFP (NLS)(चित्रा 2)और साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन(चित्र 3 और चित्रा 4)के लिए तुलनीय था । विभिन्न आकारों के कई नमूने एक साथ निकाले गए(चित्रा 2)। Argonaute प्रोटीन GW182 प्रोटीन परिवार के सदस्यों के साथ बातचीत, miRISCs कि लक्ष्य दूत RNAs से बांध और उनकी अभिव्यक्ति10दमन बनाने । चित्रा 3 पिछली रिपोर्टों 11,17के अनुरूप कोर एमआईआरआईएससी घटकों एएलजी-1 और एईएनएस-1 के सफल सह-इम्यूनोप्रिपिटेशन को दर्शाता है। हाल ही में, आर्गोनॉट एएलजी-13 के अतिरिक्त प्रोटीन इंटर इंटरेक्टर्स की पहचान करने के प्रयास किए गए थे ताकि इस बारे में अधिक जानने के लिए कि माइक्रोआरएनए बायोजेनेसिस और गतिविधि को सहायक कारकों द्वारा कैसे विनियमित किया जा सकता है। आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन एचआरपीके-1 की पहचान एएलजी-1 इम्यूनोप्रिपिट्स3में हुई थी । इस बातचीत की पुष्टि हाल ही में एक पारस्परिक एचआरपीके-1 इम्यूनोप्रिपिटेशन एक्सपेरिमेंट2में हुई थी । प्रस्तुत निकालने और इम्यूनोप्रिपिपिटेशन प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक एचआरपीके-1-विशिष्ट सह-इम्यूनोप्रिपिट्स(चित्रा 4)में एएलजी-1 बरामद किया । इसके अलावा एएलजी-1-एआईएन-1 इंटरैक्शन का कई तरह के जेनेटिक बैकग्राउंड में टेस्ट किया गया और एचआरपीके-1 को एएलजी-1/AIN-1 miRISC असेंबली2 (चित्रा 3)के लिए अनावश्यक दिखाया गया । पूरक आंकड़े पूर्ण झिल्ली जांच(पूरक चित्रा 1) दिखाने केलिए प्रदान किए जाते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: सी एलिगेंस एक्सट्रैक्ट तैयार करने और इम्यूनोप्रिपिटेशन के लिए वर्कफ़्लो योजनाबद्ध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक परमाणु स्थानीयकृत GFP, COL-19:GFP (NLS), dounce में स्तर-तैयार है और २५० μL और १०० μL कृमि छर्रों से समरूप नमूनों की पश्चिमी दाग तुलना । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: GW182 समरूप AIN-1 सह-इम्यूनोप्रिपिट्स एएलजी-1 के साथ। एएलजी-1 में एएलजी-1 और एआईएन-1 प्रोटीन के लिए वेस्टर्न ब्लॉटिंग। एचआरपीके-1 के न होने से एएलजी-1/एईएन-1 सह इम्यूनोप्रिपिटेशन प्रभावित नहीं हुआ। इनपुट = आईपी का 10%। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एचआरपीके-1 के साथ एएलजी-1 सह-इम्यूनोप्रिपिटेट्स। एचआरपीके-1 और एएलजी-1 में एचआरपीके-1 इम्यूनोप्रिपिट्स के लिए वेस्टर्न ब्लॉटिंग दिखाई गई है। इनपुट = आईपी का 10%। * एंटीबॉडी भारी श्रृंखला इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

M9 बफर (1 एल)
केएच2पीओ4 3 ग्राम
एनए 2एचपीओ4 6 ग्राम
नैक 5 ग्राम
1 एम एमजीएसओ4 1 एमएल
डीडीएच2ओ 1 एल तक
2x लाइसिस बफर (5 एमएल)
HEPES (पीएच 7.4) 200 माइक्रोल
2 एम केसीएल 250 माइक्रोल
10% ट्राइटनएक्स 100 माइक्रोल
1 एम एमजीसीएल2 20 माइक्रोन
100% ग्लाइस्रोल 1 एमएल
डीडीएच2ओ 5 एमएल तक
ताजा जोड़ें:
1 एम डीटीटी 20 माइक्रोन
EDTA मुक्त प्रोटीज़ अवरोधक 1 टैबलेट
फॉस्फेटे अवरोधक कॉकटेल 2 100 माइक्रोल
फॉस्फेटे अवरोधक कॉकटेल 3 100 माइक्रोल
1x लाइसिस बफर
ddH20 की बराबर मात्रा के साथ पतला 2x लाइसिस बफर।
1x वॉश बफर 10 एमएल)
HEPES (पीएच 7.4) 300 माइक्रोल
2 एम केसीएल 500 माइक्रोल
10% ट्राइटनएक्स 100 माइक्रोल
1 एम एमजीसीएल2 20 माइक्रोन
100% ग्लाइस्रोल 1 एमएल
डीडीएच2ओ 10 एमएल तक
1 एम डीटीटी 20 माइक्रोन (ताजा जोड़ें)

तालिका 1: व्यंजनों

पूरक चित्रा 1. आंकड़े 2-4 उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पूर्ण जांच पश्चिमी दाग झिल्ली दिखाए जाते हैं। (क) चित्रा 2 के लिए झिल्ली की जांच की गई । ध्यान दें कि झिल्ली को जीएफपी और तुबुलिन के लिए एक साथ जांच करने की अनुमति देने के लिए काटा गया था, जिससे समग्र दाग आकार कम हो गया था। (ख) चित्रा 3 के लिए झिल्ली की जांच की । (ग) चित्रा 3 के लिए झिल्ली की जांच की । * एंटीबॉडी भारी श्रृंखला को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

C. elegans सेल, आणविक, और विकासात्मक जीव विज्ञान19में बुनियादी सवालों का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है । एक आनुवंशिक मॉडल प्रणाली के रूप में अपनी शक्ति के अलावा, सी एलिगेंस जैव रासायनिक दृष्टिकोणों के लिए उत्तरदायी है, जिसमें प्रोटीन इम्यूनोप्रिपिटेशन और सह-इम्यूनोप्रिपिटेशन शामिल हैं, लेकिन सीमित नहीं हैं। इम्यूनोप्रिपिCIPITेशन प्रयोगों का संचालन करते समय एक संभावित बाधा ब्याज के प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी की कमी है। यदि कोई एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं है, तो कस्टम पॉलीक्लोनल या मोनोक्लोनल एंटीबॉडी उत्पन्न की जा सकती है। हालांकि, जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी में हाल ही में नवाचारों ने शोधकर्ताओं को तेजी से उत्परिवर्तन या टैग अंतर्जात सी एलिगेंस जीन20,21को लागू करनेकीअनुमति दी है, जो जीन और एन्कोडेड प्रोटीन के बीच आनुवंशिक, कार्यात्मक और शारीरिक बातचीत को जानने वाले अध्ययनों को सुविधाजनक बनाता है । विशेष रूप से, CRISPR/Cas9-अंतर्जात loci पर सी elegans जीन की मध्यस्थता टैगिंग एंटीबॉडी उपलब्धता पर इम्यूनोप्रिपिcipitेशन प्रयोगों की निर्भरता कम हो गई है, सह इम्यूनोप्रिपिपिटेशन प्रयोगों को और अधिक व्यवहार्य बना रही है । सी एलिगेंस जीन को विभिन्न प्रकार के टैग के साथ टैग किया जा सकता है, जैसे कि जीएफपी या एमएचरी जैसे फ्लोरोसेंट टैग से लेकर फ्लैग और एचए जैसे छोटे टैग तक। इन टैगों को पहचानने वाले एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से आसानी से उपलब्ध हैं, जो इम्यूनोप्रिपिपिटेशन दृष्टिकोण के माध्यम से प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के अध्ययन को सुविधाजनक बनाते हैं।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल, चित्रा 1में उल्लिखित, नमूनों की एक छोटी संख्या के लिए किया जा सकता है या ऊपर पहुंचा, एक समय में 24 नमूना तैयारी के लिए अनुमति देता है । जबकि इम्यूनोप्रिपिcipitation के माध्यम से प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के प्रारंभिक लक्षण आम तौर पर सामान्य बढ़ती परिस्थितियों में जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि में किया जाता है, अनुवर्ती अध्ययन अक्सर आनुवंशिक पृष्ठभूमि की एक किस्म में या विभिन्न विकास की स्थिति में प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का परीक्षण करने की आवश्यकता होती है। एक साथ कई अर्क तैयार करने की क्षमता समय बचाता है और, महत्वपूर्ण बात, विभिन्न नमूनों के बीच तैयारी स्थिरता निकालने सुनिश्चित करता है। एक नकारात्मक नियंत्रण हमेशा आवश्यक है, आदर्श नियंत्रण के साथ ब्याज की इम्यूनोप्रिपिटेटेड प्रोटीन के लिए जीन एन्कोडिंग में एक शून्य उत्परिवर्तन किया जा रहा है (उदाहरण के लिए चित्रा 3 और चित्रा 4 देखें)।

यह निकालने प्रोटोकॉल सी एलिगेंस नमूनों से तेजी से प्रोटीन निकालने की तैयारी के लिए अनुमति देता है और जिरकोनियम मनका आधारित समरूपता8के बराबर है। सामान्य रूप से बीड समरूपता को विभिन्न प्रकार के मनका मिल समरूप या समान उपकरणों का उपयोग करके कई एक साथ नमूना तैयारियों तक बढ़ाया जा सकता है। कुछ और किफायती मनका मिल समरूप नमूनों की संख्या को कम कर सकते हैं जिन्हें एक साथ संसाधित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, प्रस्तुत उद्धरण प्रोटोकॉल dounce-आधारित निकालने की तैयारी के साथ संगत है, जो एक किफायती विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है। जबकि विभिन्न मनका मिल समरूप का परीक्षण नहीं किया गया था, अधिकांश इस प्रोटीन निकालने प्रोटोकॉल के साथ संगत होने की संभावना है, जब तक कि सी एलिगेंस नमूनों का पूर्ण व्यवधान हासिल किया जाता है।

जैसा कि प्रस्तुत किया गया है, यह अर्क तैयारी प्रोटोकॉल कई डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के साथ संगत है, जिसमें प्रोटीन इम्यूनोप्रिपिपिटेशन2 और माइक्रोआरएनएपुल-डाउन 12 शामिल हैं और प्रोटीन और आरएनए घटकों दोनों के डाउनस्ट्रीम संग्रह के लिए अनुमति देता है। यह परमाणु और साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन(चित्र 2, चित्र 3और चित्र4) दोनों को कुशलतापूर्वक निकालता है। इसी तरह, प्रस्तुत इम्यूनोप्रिपिटेशन प्रोटोकॉल प्रोटीन से जुड़े इम्यूनोप्रिपिटेट्स से आरएनए अलगाव की अनुमति देता है। जबकि इम्यूनोप्रिपिcipitेशन प्रोटोकॉल मूल रूप से एएलजी-1 प्रोटीन इंटरेक्टर्स की पहचान करने के लिए विकसित किया गया था, विधि ब्याज के किसी भी प्रोटीन के बीच बातचीत के लिए परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । वास्तव में, इम्यूनोप्रिपिपिटेशन की स्थिति ने एएलजी-1(चित्रा 3)और एचआरपीके-1(चित्रा 4)को इम्यूनोप्रिपिपिट करने के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम किया। यह प्रोटोकॉल आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन के इम्यूनोपुरिफिकेशन के लिए एक उत्कृष्ट प्रारंभिक बिंदु है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ब्याज के अन्य प्रोटीन के लिए बफर संरचना में कुछ परिवर्तनों की आवश्यकता हो सकती है। परिवर्तन ब्याज के प्रोटीन के भौतिक और जैव रासायनिक गुणों पर निर्भर हो सकते हैं और इसे केस-बाय-केस आधार पर लागू किया जाना चाहिए।

एक बार लक्ष्य प्रोटीन (यहां, एएलजी-1 या एचआरपीके-1) इम्यूनोप्रिपिटेटेड हो जाता है, तो पश्चिमी ब्लॉटिंग का उपयोग विशिष्ट प्रोटीन इंटरएक्टिवेटर के लिए सह-इम्यूनोप्रिपिटेट का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।

वैकल्पिक रूप से, कोपुरीकृत इम्यूनोप्रेसिपिटेट को सभी ख्यात बातचीत प्रोटीन की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है। पुष्टि की सह इम्यूनोप्रिपिक्शन बातचीत तो आनुवंशिक पृष्ठभूमि या शर्तों की एक किस्म में जांच की जा सकती है विशिष्ट बातचीत के संभावित विनियमन की पहचान करने के लिए । उदाहरण के लिए, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या एचआरपीके-1 एएलजी-1/AIN-1 miRISC विधानसभा में भूमिका निभाता है, एएलजी-1-AIN-1 सहप्रिक्षति दोनों एक जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि में और HRPK-1(चित्रा 3)की अनुपस्थिति में मूल्यांकन किया गया था । एचआरपीके-1 एएलजी-1/AIN-1 इंटरैक्शन2 (चित्रा 3)के लिए डिस्पेबल पाया गया । इसके अलावा, CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी ब्याज के प्रोटीन में एकल बिंदु या डोमेन हटाने उत्परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए नियोजित किया जा सकता है । उत्पन्न म्यूटेंट की क्षमता को उनके प्रोटीन इंटरप्राक्टेटर के साथ सहप्रेषित करने की क्षमता का पुनर्परीक्षण करने से पता चल सकता है कि कौन से डोमेन या अवशेष शारीरिक बातचीत में मध्यस्थता करते हैं। इस तरह के भविष्य के अध्ययन प्रोटीन समारोह और विनियमन के तंत्र के बारे में अमूल्य जानकारी प्राप्त कर सकते हैं । ये दृष्टिकोण, सी एलिगेंस जेनेटिक्स की शक्ति के साथ संयुक्त, पशु विकास और सेलुलर कार्य को नियंत्रित करने वाली मौलिक आणविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम कंसास इनब्रे, पी 20जीएम103418 द्वारा ली और ज़िनोवयेवा और R35GM124828 से जिनोवयेवा को समर्थित किया गया था। हम मिन हान को उदारता से विरोधी AIN-1 एंटीबॉडी साझा करने के लिए धन्यवाद देते हैं । इस काम के दौरान उपयोग किए जाने वाले कुछ उपभेदों को कैनोरहैब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर (सीजीसी) द्वारा प्रदान किया गया था, जो एनआईएच ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम्स (P40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL tube VWR 89039-664 STEP 1.2
2x Laemmli Sample Buffer BioRed 1610737 STEP 3.11
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BioRed 4561096 STEP 4.1
anti-AIN-1 monoclonal antibody custom generated n/a STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007
anti-ALG-1 monoclonal antibody custom generated by PRF&L n/a STEP 4.2
anti-HRPK-1 monoclonal antibody custom generated by PRF&L n/a STEP 4.2
Bullet Blender Storm Homogenizer MidSci BBY24M STEP 2.3
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma D9779-5G Table 1
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation Thermo Fisher 10002D STEP 3.2
DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher 12321D STEP 3.2
EDTA-free protease inhibitors Roche 11836170001 Table 1
GFP antibody (FL) Santa Cruz Biotechnology sc-8334 Figure 2
Glycerol Thermo Fisher G33-500 Table 1
Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP BioRed 1662408 STEP 4.2
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP Thermo Fisher 31470 STEP 4.2
HEPES Sigma H4034-500G Table 1
LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit LI-COR 926-95000 STEP 4.3
Magnesium chloride hexahydrate ACS VWR VWRV0288-500G Table 1
Magnesium Sulfate Anhydrous Thermo Fisher M65-500 Table 1
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL VWR 20170-333 STEP 1.6
N2 wild type CGC
Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL) MidSci NAVYR1-RNA STEP 2.3
Phosphatase inhibitor cocktail 2 Sigma P5726-1ML Table 1
Phosphatase inhibitor cocktail 3 Sigma P0044-1ML Table 1
Potassium Chloride Thermo Fisher P217-500 Table 1
Potassium phosphate monobasic Thermo Fisher P285-3 Table 1
RC DC Protein Assay Kit I BioRed 5000121 STEP 2.9
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher 10777019 Table 1
Sodium Chloride Thermo Fisher S271-500 Table 1
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Thermo Fisher S374-500 Table 1
TritionX-100 Sigma X100-500ML Table 1
UY38 hrpk-1(zen17) available upon request
VT1367 col-19::gfp(maIS105) available upon request
VT3841 alg-1(tm492) available upon request

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 159 सी एलिगेंस,प्रोटीन एक्सट्रैक्ट तैयारी इम्यूनोप्रिपेशन माइक्रोआरएनए एएलजी-1 एइन-1
<em>कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस</em> से प्रोटीन एक्सट्रैक्ट तैयारी और सह-इम्यूनोप्रिपिटेशन
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Li, L., Zinovyeva, A. Y. Protein… More

Li, L., Zinovyeva, A. Y. Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (159), e61243, doi:10.3791/61243 (2020).

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