Summary
Denna metod beskriver ett protokoll för hög genomströmning protein extrakt beredning från Caenorhabditis elegans prover och efterföljande co-immunoprecipitation.
Abstract
Metoder för samimmunprecipitation används ofta för att studera proteinproteininteraktioner. Bekräftelse av hypotetiska proteinproteininteraktioner eller identifiering av nya kan ge ovärderlig information om funktionen hos ett protein av intresse. Några av de traditionella metoderna för extraktberedning kräver ofta arbetsintensiva och tidskrävande tekniker. Här beskrivs ett modifierat extraktberedningsprotokoll med hjälp av en pärlkvarn homogenisator och metallpärlor som ett snabbt alternativ till traditionella proteinberedningsmetoder. Denna extrakt beredning metod är kompatibel med nedströms co-immunoprecipitation studier. Som ett exempel användes metoden för att framgångsrikt co-immunoprecipitate C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 och två kända ALG-1 interactorer: AIN-1 och HRPK-1. Detta protokoll innehåller beskrivningar av insamling av djurprov, extraktberedning, förtydligande av extrakt och proteinimmunprecipitation. Det beskrivna protokollet kan anpassas för att testa interaktioner mellan två eller flera endogena, endogent märkta eller överuttryckta C. elegans proteiner i en mängd olika genetiska bakgrunder.
Introduction
Att identifiera makromolekylära interaktioner av ett protein av intresse kan vara nyckeln till att lära sig mer om dess funktion. Immunoprecipitation och co-immunoprecipitation experiment kan användas för att identifiera hela interactome av ett protein genom storskaliga proteomic metoder1 eller att specifikt testa ett proteins förmåga att coprecipitate med en hypotetisk interactor. I C. eleganshar båda metoderna framgångsrikt använts för att lära sig mer om aktiviteten hos en mängd olika proteiner, inklusive de som nära fungerar med mikroRNA för att reglera genuttryck2,3,4. Co-immunoprecipitation experiment har fördelen att testa protein-protein interaktioner i sin inhemska cellulära miljö, men extrakt förberedelse kan vara utmanande och tidskrävande. Effektiv lys av provet är nödvändigt, men försiktighet måste vidtas för att minimera störningarna i proteinproteininteraktioner. Metoder som douncing5, ultraljudsbehandling6, Balch homogenisering7, och zirconia pärlor-homogenisering8,9 har använts för att framgångsrikt förbereda C. elegans totala protein extrakt. Dessa metoder, med undantag för zirconia pärla homogenisering, har begränsningar när det gäller antalet prover som kan bearbetas samtidigt. Presenteras är en alternativ metod som lätt kan skalas upp för att möjliggöra hög genomströmning, snabb proteinextraktberedning från C. elegans prover följt av co-immunoprecipitation. Specifikt kan metoden förbereda upp till 24 prover åt gången, vilket kraftigt minskar den tid som krävs för extraktberedning. Däremot tillåter till exempel douncing vanligtvis endast ett provberedning i taget. Denna extraktmetod kan användas för att förbereda extrakt från alla utvecklingsstadier av C. elegans.
Beskrivs är ett steg-för-steg förfarande för djur prov insamling, extrakt beredning, immunoprecipitation och presentation av västerländska blotting data för att bekräfta framgångsrika protein pulldown och detektion av co-immunoprecipitating protein av intresse. För att visa protokollets effektivitet utfördes två co-immunoprecipitation experiment mellan 1) microRNA Argonaute ALG-1 och AIN-1, en GW182 homolog; och 2) ALG-1 och HRPK-1, en nyligen identifierad ALG-1 interactor2. ALG-1 och AIN-1 är kärnproteiner som utgör det mikroRNA-inducerade tysthetskomplexet (miRISC) och interaktionen mellan dessa två proteiner är väl etablerad10,11. Extrakt förberedelse protokollet var effektivt i ALG-1-AIN-1 co-immunoprecipitation experiment. Detta protokoll bekräftade också framgångsrikt interaktionen mellan ALG-1 och dess nyligen identifierade interactor, HRPK-12.
Sammanfattningsvis beskriver manuskriptet ett C. elegans extrakt förberedelseprotokoll som kan skalas upp för att samtidigt bearbeta 24 prover tillsammans med ett co-immunoprecipitation protokoll som kan användas för att identifiera nya eller bekräfta hypotetiska interaktioner mellan proteiner. Extraktberedningsprotokollet är kompatibelt med ett antal nedströmsexperiment, inklusive proteinimmunprecipitation2 och microRNA pulldowns12. Dessutom kan immunoprecipitation protokollet anpassas för att testa för interaktioner mellan två eller flera endogena, endogent märkta eller överuttryckta C. elegans proteiner i en mängd olika genetiska bakgrunder.
Protocol
1. Insamling av maskprov
- Fröblandat stadium eller synkroniserade13 maskar på NGM fasta plattor vid önskad temperatur och låt maskarna växa till önskat stadium. För grundläggande C. elegans tillväxt och underhåll, se Stiernagle et al. och Porta-de-la-Riva et al.14,13.
- Samla maskar i ett 15 ml koniskt centrifugeringsrör genom att tvätta maskplattorna med M9-buffert.
- Pellet maskarna genom centrifugering vid 400 x g vid rumstemperatur (RT) i 2 min och kassera supernaten.
OBS: Maskpelletstorleken för extraktberedning är mellan 100 μL och 500 μL. En 300 μL pellet av packade maskar rekommenderas för nedströms immunoprecipitation experiment och ger vanligtvis ~ 4,5 mg totalt protein, medan en 500 μL pellet kommer att ge ~ 7,5 mg totalt protein. - Utför ytterligare 3–5 tvättar med M9-buffert (se tabell 1)eller tills supernaten inte längre är grumlig.
- Utför en sluttvätt med ddH2O.
- Flytta den lösa maskpelleten till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och snurra ner vid 400 x g vid RT i 2 min. Kassera den återstående supernaten för att få en packad maskpellet och fortsätt att extrahera preparatet.
Protokollet kan pausas här. Maskpellets kan omedelbart blixtfrysas i flytande kväve och lagras vid -80 °C eller i flytande kväve. Observera att maskpellets endast kan tinas en gång och inte kan återerövas.
2. Extrahera beredning av maskpelleten
OBS: Extraktberedningen ska utföras på is eller vid 4 °C.
- Om den är frusen, tina maskpellet på isen.
OBS: Om önskad förpackad maskpelletstorlek på 300 μL inte erhölls under provuppsamlingen kan flera mindre pellets kombineras tills tillräckligt med material finns för ytterligare extraktion. - Tillsätt en lika stor mängd 2x lysbuffert (60 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM kaliumklorid, 0,1% Triton X, 4 mM magnesiumklorid, 10% glycerol, 2 mM DTT med RNase-hämmare, proteashämmare och fosfatashämmare; se tabell 1) och virvel eller pipett upp och ner för att blanda. Snurra ner rören för att samla upp blandningen längst ner på röret.
- Flytta blandningen till ett 1,5 ml RNase-fritt rör som innehåller metallpärlor (se materialförteckning)och sätt provet i pärlkvarnens homogenisator (se materialförteckningen)vid 4 °C. Se till att rörlocken är åtdragna och att proverna balanseras inuti homogenisatorn.
- Homogenisera provet med högsta hastighet (inställning 12) i 4 minuter.
- Ta bort provet från pärlorna och placera det i ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör. Alternativt kan en magnet som är försedd med homogenisatorn användas för att ta bort pärlorna från provet.
- Snurra ner extraktet vid 19 000 x g i 20 min vid 4 °C för att förtydliga proteinextraktet.
- Överför supernatanten till ett friskt 1,5 ml-rör på is, samtidigt som du undviker överföring av det vita, grumliga fällningen som bildas ovanpå provet. Supernaten är nu det förtydligade extraktet.
OBS: Spara 10 μL av det klarnade extraktet för att bestämma den totala proteinkoncentrationen. - Använd extraktet omedelbart för följande experiment eller blixtfrysning av extraktet i flytande kväve och förvara vid -80 °C.
Protokollet kan pausas här. Extrakt kan förvaras vid ultrallow temperatur (-80 °C frys eller flytande kväve i ~6 månader). Frysta extrakt kan tinas en gång och kan inte återerövas. - Bestäm extraktens totala proteinkoncentration med hjälp av ett proteinkoncentrationstestkit som är kompatibelt med tvättmedel(se materialförteckningen) enligt tillverkarens instruktioner.
3. Immunoprecipitation
OBS: Alla immunoprecipitationssteg för extraktberedning bör utföras på is eller vid 4 °C. Det rekommenderas att använda 2 mg totalt protein för varje immunprecipitation. Framgångsrika immunprecipitationer med 0,8–1 mg totalt protein har dock utförts. Använd alltid färska eller ny tinade proteinextrakt. Följande protokoll beskrivs för att utföra immunoprecipitation från 2 mg totalt protein, eller ett enda immunoprecipitation experiment. Mängden pärlor och antikroppar kan ökas eller minskas i enlighet därmed för flera prover eller om en annan mängd proteinextrakt används.
- Placera eller tina proteinextraktet på is. Provet kan spädas ut till 10 mg/ml eller 5 mg/ml med 1x lysbuffert med iskyla (se tabell 1).
- Återanvänd magnetpärlorna genom inversion och överför 150 μL av 50% pärlor suspension till ett 1,5 ml rör. Magnetisera pärlorna på is mot ett magnetiskt stativ i 1 minut eller tills lösningen är klar. Kassera supernaten.
- Ta bort röret från magnetstativet och tvätta pärlorna i 1x lysisbuffert med 2 volymer (dvs. 300 μL) pärlgödsel. Upprepa tvätten 2x för totalt tre tvättar.
- Återanvänd pärlor i 150 μL iskyla lysbuffert.
- Överför 75 μL av pärlslammet till 2 mg proteinextrakt och inkubera vid 4 °C i 1 timme med mild agitation. Spara den återstående pärlfjädringen på isen för senare användning.
OBS: Detta steg utförs för att minska ospecificerad proteinbindning till pärlor under immunoprecipitationssteget. - Placera röret med prov på magnetstativet på is i 1 minut eller tills pärlorna är helt magnetiserade och provet är klart. Överför supernaten till ett nytt 1,5 ml-rör; stör inte pärlorna. Detta är det förklearerade proteinlyatet. Spara 10% av provet för western blot-analys.
- Tillsätt 20 μg affinitetsrenad antikropp till det precleared lysatet och inkubera vid 4 °C i 1 timme med mild omrörning.
OBS: Mängden antikroppar som används för immunprecipitation är specifik för antikroppen och proteinet och bör vara empiriskt bestämd för att säkerställa effektiv immunprecipitation av målproteinet. - Tillsätt resterande 75 μL av den förtvättade pärlor suspensionen (steg 3.5) till antikroppen/lysatblandningen och inkubera i 1 timme vid 4 °C med mild omrörning.
- Placera röret i magnetstativet på is i 1 minut eller tills pärlorna är helt magnetiserade och provet är klart. Spara supernaten för western blot-analys (valfritt).
- Tvätta pärlor som innehåller immunoprecipitatet 3x i 450 μL tvättbuffert (30 mM HEPES, pH = 7, 4, 100 mM kaliumklorid, 0,1% Triton X, 2 mM magnesiumklorid, 10% glycerol, 1 mM DTT; se tabell 1)på is.
OBS: Ytterligare tvättar kan utföras om strängare tvättförhållanden föredras. - Återanvänd pärlpellet i 20 μL 2x SDS/BME proteingelbelastningsbuffert (seMaterialförteckning) och denatur genom att koka vid 95 °C i 5 minuter innan den lastas på en SDS-PAGE-gel. Alternativt kan denaturerade prover lagras vid -20 °C i flera månader.
OBS: En del av pärlan immunoprecipitate kan sparas för nedströms RNA isolering, om så önskas.
4. Western blot detektering av IP-prover
- Ladda IP-proverna på SDS-PAGE-gelen (se Materialförteckning ). Undvik att överföra pärlorna genom att placera IP-rören på magnetstativet i 1 minut före provets aspiration.
- Utför den västerländska blotting15,16 och antikroppsfärgning16 med följande modifieringar: späd ALG-1-antikroppen17 1:500 i 5% fettfri torr mjölk (NFDM); späd HRPK-1-antikroppen2 1:1 000 i 5% NFDM; och späd ut AIN-1-antikroppen18 1:10 000 i 5% NFDM. Sekundära antikroppar (se Materialförteckning)användes enligt tillverkarens instruktioner.
- Upptäck banden med HRP-baserad chemiluminescens (se Materialförteckning ).
Representative Results
Detta protokoll (schematerat i figur 1) användes framgångsrikt för att erhålla C. elegans totala proteinextrakt ( figur2) för nedströms immunprecipitation av fleraproteiner 2 (figur 3 och figur 4). Det framlagda protokollet för homogenisering av pärlfabriken var jämförbart med douncebaserade metoder(figur 2)och effektivt extraherad nukleär (COL-19::GFP(NLS) (figur 2) och cytoplasmaproteiner (figur 3 och figur 4). Flera prover av olika storlekar extraherades samtidigt (figur 2). Argonaute proteiner interagerar med medlemmar av GW182 protein familjen, bildar miRISCs som binder till mål budbäraren RNAs och undertrycka deras uttryck10. Figur 3 visar framgångsrik samimmunprecipitation av kärnkomponenterna ALG-1 och AIN-1, i överensstämmelse med tidigarerapporter 11,17. På senare tid har ansträngningar gjorts för att identifiera ytterligare protein interactorer av Argonaute ALG-13 för att lära sig mer om hur mikroRNA biogenes och aktivitet kan regleras av hjälpfaktorer. RNA-bindande protein HRPK-1 identifierades i ALG-1 immunoprecipitates3. Denna interaktion bekräftades nyligen i en ömsesidig HRPK-1 immunoprecipitation experiment2. De presenterade extrakt- och immunoprecipitation protokollen återhämtade framgångsrikt ALG-1 i HRPK-1-specifika co-immunoprecipitates(figur 4). Dessutom testades alg-1-AIN-1-interaktionen i en mängd olika genetiska bakgrunder och HRPK-1 visade sig vara onödig för ALG-1/AIN-1 miRISC-sammansättningen2 (figur 3). Kompletterande siffror tillhandahålls för att visa hela membranet sonderade(kompletterande figur 1).
Figur 1: Arbetsflödesschema för C. elegans extraktpreparat och immunprecipitation. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Västlig blotjämförelse av ett kärntekniskt lokaliserat GFP, COL-19::GFP(NLS), halter i dounce-beredda och homogeniserade prover från 250 μL och 100 μL maskpellets. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: GW182 homolog AIN-1 samimmunfälls med ALG-1. Western blotting för ALG-1 och AIN-1 proteiner i ALG-1 immunoprecipitates. ALG-1/AIN-1 co-immunoprecipitation påverkades inte av avsaknaden av hrpk-1. Indata = 10 % av IP. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: ALG-1 samimmunfällda med HRPK-1. Western blotting för HRPK-1 och ALG-1 i HRPK-1 immunoprecipitates visas. Indata = 10 % av IP. * indikerar antikropp tung kedja. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| M9 buffert (1 L) | |
| KH2PO4 | 3 g |
| Na2HPO4 | 6 g |
| NaCl (NaCl) | 5 g |
| 1 M MgSO4 | 1 ml |
| ddH2O | upp till 1 L |
| 2x Lysis buffert (5 ml) | |
| HEPES (pH 7.4) | 200 μL |
| 2 M KCl | 250 μL |
| 10% TritonX | 100 μL |
| 1 M MgCl2 | 20 μL |
| 100% glycerol | 1 ml |
| ddH2O | upp till 5 ml |
| Tillsätt färskt: | |
| 1 M DTT | 20 μL |
| EDTA-fri proteashämmare | 1 tablett |
| fosfatashämmare cocktail 2 | 100 μL |
| fosfatashämmare cocktail 3 | 100 μL |
| 1x Lysis buffert | |
| Späd 2x Lysis buffert med en lika stor volym ddH20. | |
| 1x Tvättbuffert 10 ml) | |
| HEPES (pH 7.4) | 300 μL |
| 2 M KCl | 500 μL |
| 10% TritonX | 100 μL |
| 1 M MgCl2 | 20 μL |
| 100% glycerol | 1 ml |
| ddH2O | upp till 10 ml |
| 1 M DTT | 20 μL (tillsätt färskt) |
Tabell 1: Recept
Kompletterande figur 1. Full sonderade västerländska fläckar som används för att generera figur 2-4 visas. A) Sonderat membran för figur 2. Observera att membranet skars för att möjliggöra samtidig sondering för GFP och Tubulin, vilket minskar den totala fläckstorleken. B) Sonderat membran för figur 3. C) Sonderat membran för figur 3. *betecknar antikropp tung kedja. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Discussion
C. elegans är en utmärkt modell för att studera grundläggande frågor inom cell-, molekylär- och utvecklingsbiologi19. Förutom sin kraft som ett genetiskt modellsystem är C. elegans mottaglig för biokemiska metoder, inklusive, men inte begränsat till, proteinimmunprecipitation och co-immunoprecipitation. Ett potentiellt hinder vid immunprecipitationsexperiment är brist på antikroppar som är specifika för de proteiner som är av intresse. Om ingen antikropp finns tillgänglig kan anpassade polyklonala eller monoklonala antikroppar genereras. Men de senaste innovationerna inom genomredigeringsteknik har gjort det möjligt för forskare att snabbt införa mutationer eller märka endogena C. elegans gener20,21, vilket underlättar studier som löser upp de genetiska, funktionella och fysiska interaktionerna mellan generna och de kodade proteinerna. Specifikt har CRISPR/Cas9-medierad märkning av C. elegans gener vid den endogena lokusen minskat beroendet av immunoprecipitation experiment på antikropp tillgänglighet, vilket gör co-immunoprecipitation experiment mycket mer genomförbara. C. elegans gener kan märkas med en mängd olika taggar som sträcker sig från fluorescerande taggar som GFP eller mCherry till små taggar som FLAG och HA. Antikroppar som känner igen dessa taggar är lätt tillgängliga kommersiellt, vilket underlättar studier av proteinproteininteraktioner via immunprecipitationsmetoder.
Det framlade protokollet, som beskrivs i figur 1,kan utföras för ett litet antal prover eller skalas upp, vilket möjliggör upp till 24 provpreparat åt gången. Medan de första karakteriseringarna av proteinproteininteraktioner via immunprecipitation vanligtvis görs i vilda bakgrunder under normala odlingsförhållanden, kräver uppföljningsstudier ofta testning av proteinproteininteraktioner i en mängd olika genetiska bakgrunder eller under olika tillväxtförhållanden. Förmågan att samtidigt förbereda flera extrakt sparar tid och, viktigast av allt, säkerställer extraktberedningskonsistens mellan de olika proverna. En negativ kontroll krävs alltid, med den idealiska kontrollen är en nollmutation i genkodningen för det immunoprecipiterade proteinet av intresse (se figur 3 och figur 4 för exempel).
Detta extraktprotokoll möjliggör snabb proteinextraktberedning från C. elegans prover och är jämförbart med zirkonium pärla-baserade homogenisering8. Pärlhom homogenisering i allmänhet kan skalas upp till flera samtidiga provpreparat med hjälp av en mängd olika pärlkvarn homogenisatorer eller liknande utrustning. Vissa mer ekonomiska pärlkvarn homogenisatorer kan dock minska antalet prover som kan bearbetas samtidigt. Alternativt är det presenterade extraktprotokollet kompatibelt med dounce-baserade extrakt förberedelse, som representerar ett ekonomiskt alternativ. Även om olika pärlkvarn homogenisatorer inte testades, de flesta är sannolikt kompatibla med detta protein extrakt protokoll, så länge fullständig störning av C. elegans prover uppnås.
Som presenteras, detta extrakt förberedelse protokoll är kompatibel med flera nedströms experiment, inklusive protein immunprecipitation2 och microRNA pull-down12 och möjliggör nedströms insamling av både protein och RNA komponenter. Det extraherar också effektivt både nukleära och cytoplasmaproteiner(figur 2, figur 3och figur 4). På samma sätt tillåter det presenterade immunoprecipitation protokollet RNA isolering från protein-associerade immunoprecipitates. Medan immunoprecipitation protokollet ursprungligen utvecklades för att identifiera ALG-1 protein interactors, metoden kan anpassas för att testa för interaktioner mellan alla proteiner av intresse. De immunprecipitationsförhållanden som användes fungerade faktiskt lika bra för immunoprecipiterande ALG-1 (figur 3) och HRPK-1 (figur 4). Detta protokoll är en utmärkt utgångspunkt för immunpurifiering av RNA-bindande proteiner. Det bör dock noteras att vissa förändringar i buffertsammansättningen kan krävas för andra proteiner av intresse. Förändringarna kan bero på de fysiska och biokemiska egenskaperna hos det protein som är av intresse och måste genomföras från fall till fall.
När målproteinet (här, ALG-1 eller HRPK-1) är immunoprecipitated, kan western blotting användas för att testa co-immunoprecipitate för specifika protein interactors.
Alternativt kan det samförda immunprecipitatet utsättas för masspektrometrianalys för att identifiera alla förmodade interagerande proteiner. Bekräftade samimmunprecipitation interaktioner kan sedan undersökas i en mängd olika genetiska bakgrunder eller villkor för att identifiera potentiella reglering av den specifika interaktionen. För att till exempel avgöra om hrpk-1 spelar en roll i ALG-1/AIN-1 miRISC-sammansättning bedömdes ALG-1-AIN-1-koprecipitation både i en vild typbakgrund och i avsaknad av HRPK-1 (figur 3). hrpk-1 konstaterades vara dispenserbart för ALG-1/AIN-1 interaktion2 (Figur 3). Dessutom kan CRISPR/Cas9 genomredigeringsteknik användas för att generera enstaka punkt- eller domänborttagningsmutationer i de proteiner som är av intresse. Att testa de genererade mutanternas förmåga att koprecipitera med sina proteininteraktorer kan avslöja vilka domäner eller rester som förmedlar den fysiska interaktionen. Sådana framtida studier kan ge ovärderlig information om mekanismen för proteinfunktion och reglering. Dessa tillvägagångssätt, i kombination med kraften i C. elegans genetik, kan ge viktiga insikter i de grundläggande molekylära processer som styr djurs utveckling och cellulära funktion.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av Kansas INBRE, P20GM103418 till Li och Zinovyeva och R35GM124828 till Zinovyeva. Vi tackar Min Han för att han generöst delade anti-AIN-1-antikroppen. Några av de stammar som användes under detta arbete tillhandahölls av Caenorhabditis Genetics Center (CGC), finansierat av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | VWR | 89039-664 | STEP 1.2 |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRed | 1610737 | STEP 3.11 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRed | 4561096 | STEP 4.1 |
| anti-AIN-1 monoclonal antibody | custom generated | n/a | STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007 |
| anti-ALG-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| anti-HRPK-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| Bullet Blender Storm Homogenizer | MidSci | BBY24M | STEP 2.3 |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779-5G | Table 1 |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher | 10002D | STEP 3.2 |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | STEP 3.2 |
| EDTA-free protease inhibitors | Roche | 11836170001 | Table 1 |
| GFP antibody (FL) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8334 | Figure 2 |
| Glycerol | Thermo Fisher | G33-500 | Table 1 |
| Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP | BioRed | 1662408 | STEP 4.2 |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | 31470 | STEP 4.2 |
| HEPES | Sigma | H4034-500G | Table 1 |
| LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit | LI-COR | 926-95000 | STEP 4.3 |
| Magnesium chloride hexahydrate ACS | VWR | VWRV0288-500G | Table 1 |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Thermo Fisher | M65-500 | Table 1 |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | STEP 1.6 |
| N2 wild type | CGC | ||
| Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL) | MidSci | NAVYR1-RNA | STEP 2.3 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726-1ML | Table 1 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044-1ML | Table 1 |
| Potassium Chloride | Thermo Fisher | P217-500 | Table 1 |
| Potassium phosphate monobasic | Thermo Fisher | P285-3 | Table 1 |
| RC DC Protein Assay Kit I | BioRed | 5000121 | STEP 2.9 |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | Table 1 |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher | S271-500 | Table 1 |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Thermo Fisher | S374-500 | Table 1 |
| TritionX-100 | Sigma | X100-500ML | Table 1 |
| UY38 hrpk-1(zen17) | available upon request | ||
| VT1367 col-19::gfp(maIS105) | available upon request | ||
| VT3841 alg-1(tm492) | available upon request |
References
- Liu, X., et al. An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations. Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).
- Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development. PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).
- Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).
- Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans. Cell. 136 (5), 926-938 (2009).
- Zou, Y., et al. Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers. Science. 340 (6130), 372-376 (2013).
- Zanin, E., Dumont, J., et al. Affinity purification of protein complexes in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).
- Bhaskaran, S., et al. Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application. Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).
- Kohl, K., et al. Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes. Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).
- Larance, M., Bailly, A. P., et al. Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes. Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).
- Ding, L., Han, M. GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing. Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).
- Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans. Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).
- Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2’-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices. Methods in Molecular Biology. 725, Chapter 16 233-249 (2011).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T.
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression. PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).
- Zhang, L., et al. Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2. Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Farboud, B., et al. Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms. Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
