Summary
Denne metoden beskriver en protokoll for høygjennomstrømning protein ekstrakt forberedelse fra Caenorhabditis elegans prøver og påfølgende co-immunoprecipitation.
Abstract
Co-immunoprecipitation metoder brukes ofte til å studere protein-protein interaksjoner. Bekreftelse av hypotesede proteinproteininteraksjoner eller identifisering av nye kan gi uvurderlig informasjon om funksjonen til et protein av interesse. Noen av de tradisjonelle metodene for ekstraktpreparat krever ofte arbeidsintensive og tidkrevende teknikker. Her beskrives en modifisert ekstraktforberedelsesprotokoll ved hjelp av en perlemølle homogenisator og metallperler som et raskt alternativ til tradisjonelle proteinforberedelsesmetoder. Denne ekstraktpreparatmetoden er kompatibel med nedstrøms co-immunoprecipitation studier. Som et eksempel ble metoden brukt til å lykkes med å co-immunoprecipitate C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 og to kjente ALG-1-interaktivitetsorer: AIN-1 og HRPK-1. Denne protokollen inkluderer beskrivelser av dyreprøvesamling, ekstraktpreparat, ekstraktavklaring og proteinimmunoprecipitation. Den beskrevne protokollen kan tilpasses for å teste for interaksjoner mellom to eller flere endogene, endogene taggete eller overekspresserte C. elegans proteiner i en rekke genetiske bakgrunner.
Introduction
Å identifisere makromolekylære interaksjoner av et protein av interesse kan være nøkkelen til å lære mer om funksjonen. Immunoprecipitation og co-immunoprecipitation eksperimenter kan brukes til å identifisere hele interaktivitet av et protein gjennom store proteomiske tilnærminger1 eller for å spesifikt teste et proteins evne til å coprecipitate med en hypotesibilisert interager. I C. eleganshar begge metodene blitt brukt til å lære mer om aktiviteten til en rekke proteiner, inkludert de som fungerer tett med mikroRNAer for å regulere genuttrykk2,3,4. Co-immunoprecipitation eksperimenter har fordelen av å teste protein-protein interaksjoner i sitt opprinnelige cellulære miljø, men ekstrakt forberedelse kan være utfordrende og tidkrevende. Effektiv lysis av prøven er nødvendig, men det må tas hensyn til å minimere forstyrrelsen av proteinproteininteraksjoner. Metoder som douncing5, sonikering6, Balch homogenisering7, og zirkonia perler-homogenisering8,9 har blitt brukt til å forberede C. elegans totale proteinekstrakter. Disse metodene, med unntak av zirkonia perle homogenisering, har begrensninger når det gjelder antall prøver som kan behandles samtidig. Presentert er en alternativ metode som lett kan skaleres opp for å tillate høy gjennomstrømning, rask proteinekstraktpreparat fra C. elegansprøver etterfulgt av co-immunoprecipitation. Spesielt kan metoden forberede opptil 24 prøver om gangen, noe som reduserer tiden som kreves for ekstraktforberedelse. Til sammenligning tillater for eksempel douncing vanligvis bare ett prøvepreparering om gangen. Denne ekstraktmetoden kan brukes til å forberede ekstrakter fra et hvilket som helst utviklingsstadium av C. elegans.
Beskrevet er en trinnvis prosedyre for innsamling av dyreforsøk, ekstraktpreparering, immunoprecipitation og presentasjon av vestlige blottingsdata for å bekrefte vellykket proteinnedtrekking og påvisning av det koimmunoprecipitating protein av interesse. For å demonstrere effektiviteten av protokollen ble det utført to co-immunoprecipitation eksperimenter mellom 1) microRNA Argonaute ALG-1 og AIN-1, en GW182 homolog; og 2) ALG-1 og HRPK-1, en nylig identifisert ALG-1 interaktivitet2. ALG-1 og AIN-1 er kjerneproteiner som utgjør det microRNA-induserte silencingkomplekset (miRISC) og samspillet mellom disse to proteinene er godt etablert10,11. Ekstraktforberedelsesprotokollen var effektiv i ALG-1-AIN-1 co-immunoprecipitation-eksperimentet. Denne protokollen bekreftet også vellykket samspillet mellom ALG-1 og den nylig identifiserte interageren HRPK-12.
Oppsummert beskriver manuskriptet en C. elegans ekstraktforberedelsesprotokoll som kan skaleres opp til samtidig å behandle 24 prøver sammen med en koimmunoprecipitation-protokoll som kan brukes til å identifisere nye eller bekrefte hypotesede interaksjoner mellom proteiner. Ekstraktpreparatprotokollen er kompatibel med en rekke nedstrøms eksperimenter, inkludert proteinimmunoprecipitation2 og microRNA pulldowns12. Videre kan immunoprecipitation protokollen tilpasses for å teste for interaksjoner mellom to eller flere endogene, endogene tagget, eller overekspresserte C. elegans proteiner i en rekke genetiske bakgrunner.
Protocol
1. Eksempelsamling for orm
- Frø blandet stadium eller synkronisert13 ormer på NGM faste plater ved ønsket temperatur og la ormene vokse til ønsket stadium. For grunnleggende C. elegans vekst og vedlikehold, vennligst se Stiernagle et al. og Porta-de-la-Riva et al.14,13.
- Samle ormer i et 15 ml konisk sentrifugerør ved å vaske ormeplatene med M9-buffer.
- Pellet ormene ved sentrifugering ved 400 x g ved romtemperatur (RT) i 2 minutter og kast supernatanten.
MERK: Ormpellets størrelse for ekstraktpreparat er mellom 100 μL og 500 μL. En 300 μL pellet av pakket ormer anbefales for nedstrøms immunoprecipitation eksperimenter og vanligvis gir ~ 4,5 mg av totalt protein, mens en 500 μL pellet vil gi ~ 7,5 mg totalt protein. - Utfør ytterligere 3–5 vasker med M9-buffer (se tabell 1) eller til supernatanten ikke lenger er uklar.
- Utfør en siste vask med ddH2O.
- Flytt den løse ormepellets til et 1,5 ml mikrosenterrør og spinn ned ved 400 x g ved RT i 2 minutter. Kast den gjenværende supernatanten for å få en pakket ormpellet og fortsett å trekke ut preparatet.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. Ormpellets kan blits frosset i flytende nitrogen umiddelbart og lagres ved -80 °C eller i flytende nitrogen. Vær oppmerksom på at ormpellets bare kan tines en gang og ikke kan fryses på nytt.
2. Ekstrakt forberedelse av ormpellet
MERK: Avtrekkspreparatet skal utføres på is eller ved 4 °C.
- Hvis frossen, tine orm pellet på is.
MERK: Hvis ønsket pakket ormpellets størrelse på 300 μL ikke ble oppnådd under prøvetaking, kan flere mindre pellets kombineres til nok materiale er til stede for ytterligere ekstraksjon. - Tilsett et likt volum av iskald 2x lysisbuffer (60 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM kaliumklorid, 0,1 % Triton X, 4 mM magnesiumklorid, 10 % glyserol, 2 mM DTT med RNase-hemmer, proteasehemmer og fosfatasehemmere; se tabell 1) og virvel eller pipette opp og ned for å blande. Snurr røret(e) ned for å samle blandingen nederst på røret.
- Flytt blandingen inn i et 1,5 ml RNase-fritt rør som inneholder metallperler (se Materialbord) og legg prøven i bead mill homogenisatoren (se Materialtabellen) ved 4 °C. Påse at rørhettene er strammet og at prøvene er balansert inne i homogenisatoren.
- Homogeniser prøven med høyeste hastighet (innstilling 12) i 4 minutter.
- Fjern prøven fra perlene og legg den i et nytt 1,5 ml mikrosenterrør. Alternativt kan en magnet som følger med homogenisatoren brukes til å fjerne perlene fra prøven.
- Spinn ned ekstraktet ved 19.000 x g i 20 min ved 4 °C for å avklare proteinekstraktet.
- Overfør supernatanten til et friskt 1,5 ml rør på is, samtidig som du unngår overdragelse av det hvite, overskyete bunnfallet som dannes på toppen av prøven. Supernatanten er nå det avklarte utdraget.
MERK: Spar 10 μL av det avklarte ekstraktet for å bestemme den totale proteinkonsentrasjonen. - Bruk ekstraktet umiddelbart for følgende eksperimenter eller blits fryse ekstraktet i flytende nitrogen og lagre ved -80 °C.
MERK: Protokollen kan være satt på pause her. Ekstrakter kan oppbevares ved ultralow temperatur (-80 °C fryser eller flytende nitrogen i ca. 6 måneder). Frosne ekstrakter kan tines en gang og kan ikke fryses på nytt. - Bestem den totale proteinkonsentrasjonen av ekstraktet ved hjelp av et proteinkonsentrasjonsanalysesett som er kompatibelt med vaskemidler (se Materialtabell) i henhold til produsentens instruksjoner.
3. Immunoprecipitation
MERK: Alle immunoprecipitation trinn for ekstrakt forberedelse bør utføres på is eller ved 4 °C. Det anbefales å bruke 2 mg totalt protein for hver immunseffitering. Imidlertid har vellykkede immunoprecipitations med 0,8-1 mg totalt protein blitt utført. Bruk alltid ferske eller nytinte proteinekstrakter. Følgende protokoll er skissert for å utføre immunoprecipitation fra 2 mg totalt protein, eller et enkelt immunoprecipitation eksperiment. Mengden perler og antistoff kan økes eller reduseres tilsvarende for flere prøver, eller hvis en annen mengde proteinekstrakt brukes.
- Plasser eller tin proteinekstraktet på is. Prøven kan fortynnes til 10 mg/ml eller 5 mg/ml med iskald 1x lysisbuffer (se tabell 1).
- Resuspend de magnetiske perlene ved inversjon og overfør 150 μL av de 50% perler suspensjon i et 1,5 ml rør. Magnetiser perlene på is mot et magnetisk stativ i 1 min eller til løsningen er klar. Kast supernatanten.
- Fjern røret fra magnetstativet og vask perlene i 1x lysisbuffer ved hjelp av 2 volumer (dvs. 300 μL) perleslam. Gjenta vasken 2x for totalt tre vasker.
- Resuspend perlene i 150 μL iskald lysisbuffer.
- Overfør 75 μL av perleslammet til 2 mg proteinekstrakt og inkuber ved 4 °C i 1 time med mild agitasjon. Lagre den gjenværende perlefjæringen på is for senere bruk.
MERK: Dette trinnet utføres for å redusere ikke-spesifikk proteinbinding til perler under immunoprecipitation trinnet. - Plasser røret med prøve på det magnetiske stativet på is i 1 min eller til perlene er fullstendig magnetisert og prøven er klar. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml rør; Ikke forstyrr perlene. Dette er det precleared protein lysate. Spar 10% av prøven for vestlig blotanalyse.
- Tilsett 20 μg affinitet renset antistoff til precleared lysate og inkuber ved 4 °C i 1 time med mild agitasjon.
MERK: Mengden antistoff som brukes til immunoprecipitation er spesifikk for antistoffet og proteinet og bør bestemmes empirisk for å sikre effektiv immunoprecipitation av målproteinet. - Tilsett de resterende 75 μL av de forhåndsvaskede perlene suspensjon (trinn 3.5) til antistoff / lysat blanding og inkuber i 1 time ved 4 °C med mild agitasjon.
- Plasser røret i det magnetiske stativet på is i 1 min eller til perlene er fullstendig magnetisert og prøven er klar. Lagre supernatanten for vestlig flekkanalyse (valgfritt).
- Vask perlene som inneholder immunoprecipitatet 3x i 450 μL vaskebuffer (30 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM kaliumklorid, 0,1% Triton X, 2 mM magnesiumklorid, 10% glyserol, 1 mM DTT; se tabell 1) på is.
MERK: Ytterligere vasker kan utføres hvis det foretrekkes strengere vaskeforhold. - Resuspend perle pellets i 20 μL av 2x SDS / BME protein gel lasting buffer (se Tabell av materialer) og denature ved koking ved 95 °C i 5 min før lasting på en SDS-PAGE gel. Alternativt kan denaturerte prøver lagres ved -20 °C i flere måneder.
MERK: En del av perleimmunoprecipitaten kan spares for nedstrøms RNA-isolasjon, om ønskelig.
4. Vestlig blottdeteksjon av IP-prøver
- Legg IP-prøvene på SDS-PAGE gelen (se Materialfortegnelser). Unngå å overføre perlene ved å plassere IP-rørene på magnetstativet i 1 min før du aspirerer prøven.
- Utfør den vestlige blotting15,16 og antistofffarging16 med følgende modifikasjoner: fortynn ALG-1 antistoffet17 1:500 i 5% ikke-fett tørr melk (NFDM); fortynne HRPK-1antistoffet 2 1:1000 i 5% NFDM; og fortynne AIN-1antistoffet 18 1:10,000 i 5% NFDM. Sekundære antistoffer (se Materialfortegnelse) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner.
- Oppdag båndene med HRP-basert chemiluminescens (se Tabell over materialer).
Representative Results
Denne protokollen (skjematisert i figur 1) ble brukt med hell for å oppnå C. elegans totale proteinekstrakter (figur 2) for nedstrøms immunoprecipitation av flere proteiner2 (Figur 3 og Figur 4). Den presenterte homogeniseringsprotokollen for perlemølle var sammenlignbar i total proteinutvinning med dounce-baserte metoder (figur 2) og effektivt ekstrahert kjernekraft (COL-19::GFP(NLS) (figur 2) og cytoplasmatiske proteiner (figur 3 og figur 4). Flere prøver av forskjellige størrelser ble trukket ut samtidig (figur 2). Argonaute proteiner samhandler med medlemmer av GW182 proteinfamilien, danner miRISCene som binder seg til mål messenger RNAer og undertrykker deres uttrykk10. Figur 3 viser vellykket koimmunisering av kjerne-miRISC-komponenter ALG-1 og AIN-1, i samsvar med tidligere rapporter11,17. Mer nylig ble det gjort en innsats for å identifisere ytterligere proteininteraktorer av Argonaute ALG-13 for å lære mer om hvordan microRNA biogenese og aktivitet kan reguleres av hjelpefaktorer. Det RNA-bindende proteinet HRPK-1 ble identifisert i ALG-1 immunoprecipitates3. Denne interaksjonen ble nylig bekreftet i et gjensidig HRPK-1 immunoprecipitation eksperiment2. De presenterte ekstrakt- og immunrecipitasjonsprotokollene gjenvunnet ALG-1 i HRPK-1-spesifikke koimmunoprecipitates (figur 4). I tillegg ble ALG-1-AIN-1-interaksjonen testet i en rekke genetiske bakgrunner, og HRPK-1 ble vist å være unødvendig for ALG-1/AIN-1 miRISC-samlingen2 (Figur 3). Supplerende tall er gitt for å vise hele membranen probed (Supplerende figur 1).
Figur 1: Arbeidsflytskjematisk for C. elegans ekstraktpreparering og immunoprecipitation. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vestlig blot sammenligning av en kjernefysisk lokalisert GFP, COL-19::GFP(NLS), nivåer i dounce-forberedte og homogeniserte prøver fra 250 μL og 100 μL ormpellets. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: GW182 homolog AIN-1 co-immunoprecipitates med ALG-1. Vestlig blotting for ALG-1 og AIN-1 proteiner i ALG-1 immunoprecipitates. ALG-1/AIN-1 co-immunoprecipitation ble ikke påvirket av fraværet av hrpk-1. Inngang = 10 % av IP. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: ALG-1 koimmunoprecipitates med HRPK-1. Vestlig blotting for HRPK-1 og ALG-1 i HRPK-1 immunoprecipitates er vist. Inngang = 10 % av IP. * indikerer antistoff tungt kjede. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| M9-buffer (1 L) | |
| KH2Po4 | 3 g |
| Na2HPO4 | 6 g |
| NaCl | 5 g |
| 1 M MgSO4 | 1 ml |
| ddH2O | opptil 1 L |
| 2x Lysis buffer (5 ml) | |
| HEPES (pH 7,4) | 200 μL |
| 2 M KCl | 250 μL |
| 10% TritonX | 100 μL |
| 1 M MgCl2 | 20 μL |
| 100% glyserol | 1 ml |
| ddH2O | opptil 5 ml |
| Legg til fersk: | |
| 1 M DTT | 20 μL |
| EDTA-fri proteasehemmer | 1 nettbrett |
| fosfatasehemmer cocktail 2 | 100 μL |
| fosfatasehemmer cocktail 3 | 100 μL |
| 1x Lysis-buffer | |
| Fortynn 2x Lysis-buffer med et likt volum ddH20. | |
| 1x Vaskebuffer 10 ml) | |
| HEPES (pH 7,4) | 300 μL |
| 2 M KCl | 500 μL |
| 10% TritonX | 100 μL |
| 1 M MgCl2 | 20 μL |
| 100% glyserol | 1 ml |
| ddH2O | opptil 10 ml |
| 1 M DTT | 20 μL (tilsett frisk) |
Tabell 1: Oppskrifter
Supplerende figur 1. Full probed vestlige flekker membraner som brukes til å generere figur 2-4 vises. (A) Probed membran for figur 2. Vær oppmerksom på at membranen ble kuttet for å muliggjøre samtidig probing for GFP og Tubulin, noe som reduserer den totale flekkstørrelsen. (B) Probed membran for figur 3. (C) Probed membran for figur 3. *betegner antistoff tungt kjede. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
C. elegans er en utmerket modell for å studere grunnleggende spørsmål i celle-, molekylær- og utviklingsbiologi19. I tillegg til sin kraft som et genetisk modellsystem, er C. elegans egnet til biokjemiske tilnærminger, inkludert, men ikke begrenset til, proteinimmunoprecipitation og co-immunoprecipitation. Et potensielt hinder når du utfører immunoprecipitation eksperimenter er mangel på antistoffer som er spesifikke for proteiner av interesse. Hvis ingen antistoff er tilgjengelig, kan tilpassede polyklonale eller monoklonale antistoffer genereres. Imidlertid har nyere innovasjoner innen genomredigeringsteknologi gjort det mulig for forskere å raskt introdusere mutasjoner eller merke endogene C. elegans gener20,21, og legge til rette for studier som avdekker genetiske, funksjonelle og fysiske interaksjoner mellom genene og de kodede proteinene. Spesielt crispr / cas9-mediert merking av C. elegans gener på den endogene loci har redusert avhengigheten av immunoprecipitation eksperimenter på antistoff tilgjengelighet, noe som gjør co-immunoprecipitation eksperimenter mye mer mulig. C. elegans gener kan merkes med en rekke koder som spenner fra fluorescerende koder som GFP eller mCherry til små koder som FLAG og HA. Antistoffer som gjenkjenner disse taggene er lett tilgjengelige kommersielt, noe som letter studiene av proteinproteininteraksjoner via immunoprecipitation tilnærminger.
Den presenterte protokollen, skissert i figur 1, kan utføres for et lite antall prøver eller skaleres opp, noe som gir opptil 24 prøveforberedelser om gangen. Mens de første karakteriseringene av proteinproteininteraksjoner via immunoprecipitation vanligvis gjøres i vill type bakgrunn under normale vekstforhold, krever oppfølgingsstudier ofte å teste proteinproteininteraksjonene i en rekke genetiske bakgrunner eller under forskjellige vekstforhold. Evnen til samtidig å forberede flere ekstrakter sparer tid og, viktigst, sikrer ekstraktforberedelseskonsistens blant de forskjellige prøvene. En negativ kontroll er alltid nødvendig, med den ideelle kontrollen som en nullmutasjon i genkodingen for det immunoprecipitated proteinet av interesse (se figur 3 og figur 4 for eksempler).
Denne ekstraktprotokollen muliggjør rask proteinekstraktpreparering fra C. elegans-prøver og kan sammenlignes med zirkoniumperlebasert homogenisering8. Perle homogenisering generelt kan skaleres opp til flere samtidige prøvepreparater ved hjelp av en rekke perle mill homogenisatorer eller lignende utstyr. Noen mer økonomiske perle mill homogenisatorer kan redusere antall prøver som kan behandles samtidig, men. Alternativt er den presenterte ekstraktprotokollen kompatibel med dounce-basert ekstraktpreparat, som representerer et økonomisk alternativ. Mens forskjellige perlemølle homogenisatorer ikke ble testet, vil de fleste sannsynligvis være kompatible med denne proteinekstraktprotokollen, så lenge fullstendig forstyrrelse av C. elegans-prøvene oppnås.
Som presentert er denne ekstraktforberedelsesprotokollen kompatibel med flere nedstrøms eksperimenter, inkludert proteinimmunoprecipitation2 og microRNA pull-down12 og muliggjør nedstrøms samling av både protein- og RNA-komponenter. Det trekker også effektivt ut både kjernefysiske og cytoplasmatiske proteiner (Figur 2, Figur 3og Figur 4). På samme måte tillater den presenterte immunoprecipitation-protokollen RNA-isolasjon fra proteinrelaterte immunoprecipitates. Mens immunoprecipitation protokollen opprinnelig ble utviklet for å identifisere ALG-1 proteininteraktorer, metoden kan tilpasses for å teste for interaksjoner mellom noen proteiner av interesse. Faktisk fungerte immunoprecipitation forholdene like bra for immunoprecipitating ALG-1 (Figur 3) og HRPK-1 (Figur 4). Denne protokollen er et utmerket utgangspunkt for immunopurifisering av RNA-bindende proteiner. Det skal imidlertid bemerkes at noen endringer i buffersammensetningen kan være nødvendig for andre proteiner av interesse. Endringene kan avhenge av de fysiske og biokjemiske egenskapene til proteinet av interesse og må implementeres fra sak til sak.
Når målproteinet (her, ALG-1 eller HRPK-1) er immunoprecipitated, kan vestlig blotting brukes til å teste co-immunoprecipitate for spesifikke proteininteraktorer.
Alternativt kan det kopurifiserte immunoprecipitaten bli utsatt for massespektrometrianalyse for å identifisere alle putative interagerende proteiner. Bekreftede koimmunoprecipitation interaksjoner kan deretter undersøkes i en rekke genetiske bakgrunner eller forhold for å identifisere potensiell regulering av den spesifikke interaksjonen. Hvis du for eksempel vil finne ut om hrpk-1 spiller en rolle i ALG-1/AIN-1 miRISC-montering, ble ALG-1-AIN-1-koduktering vurdert både i en vill type bakgrunn og i fravær av HRPK-1 (figur 3). hrpk-1 ble funnet å være dispenserbar for ALG-1/AIN-1 interaksjon2 (Figur 3). I tillegg kan CRISPR/Cas9 genomredigeringsteknologi brukes til å generere enkeltpunkts- eller domeneslettingsmutasjoner i interessante proteiner. Retesting av evnen til de genererte mutantene til å korecipitate med sine proteininteraksjonorer kan avsløre hvilke domener eller rester som formidler den fysiske interaksjonen. Slike fremtidige studier kan gi uvurderlig informasjon om mekanismen for proteinfunksjon og regulering. Disse tilnærmingene, kombinert med kraften i C. elegans genetikk, kan gi viktig innsikt i de grunnleggende molekylære prosessene som styrer dyreutvikling og cellulær funksjon.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av Kansas INBRE, P20GM103418 til Li og Zinovyeva og R35GM124828 til Zinovyeva. Vi takker Min Han for sjenerøst å dele anti-AIN-1 antistoffet. Noen av stammene som ble brukt i løpet av dette arbeidet ble levert av Caenorhabditis Genetics Center (CGC), finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | VWR | 89039-664 | STEP 1.2 |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRed | 1610737 | STEP 3.11 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRed | 4561096 | STEP 4.1 |
| anti-AIN-1 monoclonal antibody | custom generated | n/a | STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007 |
| anti-ALG-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| anti-HRPK-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
| Bullet Blender Storm Homogenizer | MidSci | BBY24M | STEP 2.3 |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779-5G | Table 1 |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher | 10002D | STEP 3.2 |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | STEP 3.2 |
| EDTA-free protease inhibitors | Roche | 11836170001 | Table 1 |
| GFP antibody (FL) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8334 | Figure 2 |
| Glycerol | Thermo Fisher | G33-500 | Table 1 |
| Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP | BioRed | 1662408 | STEP 4.2 |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | 31470 | STEP 4.2 |
| HEPES | Sigma | H4034-500G | Table 1 |
| LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit | LI-COR | 926-95000 | STEP 4.3 |
| Magnesium chloride hexahydrate ACS | VWR | VWRV0288-500G | Table 1 |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Thermo Fisher | M65-500 | Table 1 |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | STEP 1.6 |
| N2 wild type | CGC | ||
| Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL) | MidSci | NAVYR1-RNA | STEP 2.3 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726-1ML | Table 1 |
| Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044-1ML | Table 1 |
| Potassium Chloride | Thermo Fisher | P217-500 | Table 1 |
| Potassium phosphate monobasic | Thermo Fisher | P285-3 | Table 1 |
| RC DC Protein Assay Kit I | BioRed | 5000121 | STEP 2.9 |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | Table 1 |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher | S271-500 | Table 1 |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Thermo Fisher | S374-500 | Table 1 |
| TritionX-100 | Sigma | X100-500ML | Table 1 |
| UY38 hrpk-1(zen17) | available upon request | ||
| VT1367 col-19::gfp(maIS105) | available upon request | ||
| VT3841 alg-1(tm492) | available upon request |
References
- Liu, X., et al. An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations. Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).
- Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development. PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).
- Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).
- Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans. Cell. 136 (5), 926-938 (2009).
- Zou, Y., et al. Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers. Science. 340 (6130), 372-376 (2013).
- Zanin, E., Dumont, J., et al. Affinity purification of protein complexes in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).
- Bhaskaran, S., et al. Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application. Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).
- Kohl, K., et al. Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes. Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).
- Larance, M., Bailly, A. P., et al. Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes. Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).
- Ding, L., Han, M. GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing. Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).
- Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans. Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).
- Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2’-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices. Methods in Molecular Biology. 725, Chapter 16 233-249 (2011).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T.
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression. PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).
- Zhang, L., et al. Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2. Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Farboud, B., et al. Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms. Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
