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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Une plate-forme technologique open source pour fabriquer des modèles de culture 3D basés sur l’hydrogel de manière automatisée et standardisée

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/61261
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 1,3,4,5, 1,2, 1,2,3,4,6
1Centre in Regenerative Medicine, Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, 2School of Mechanical, Medical and Process Engineering, Science and Engineering Faculty, Queensland University of Technology, 3School of Biomedical Sciences, Faculty of Health, Queensland University of Technology, 4Australian Prostate Cancer Research Centre, Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, 5Translational Research Institute, Queensland University of Technology, 6ARC ITTC in Additive Biomanufacturing, Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology

Summary

Ce protocole sert de didacticiel complet pour le mélange standardisé et reproductible de matériaux visqueux avec une nouvelle technologie d’automatisation open source. Des instructions détaillées sont fournies sur le fonctionnement d’un poste de travail open source nouvellement développé, l’utilisation d’un concepteur de protocole open source et la validation et la vérification pour identifier les mélanges reproductibles.

Abstract

Les étapes de mélange actuelles des matériaux visqueux reposent sur des tâches répétitives et chronophages qui sont effectuées principalement manuellement dans un mode à faible débit. Ces problèmes représentent des inconvénients dans les flux de travail qui peuvent finalement entraîner l’irreproductibilité des résultats de la recherche. Les flux de travail manuels limitent davantage l’avancement et l’adoption généralisée des matériaux visqueux, tels que les hydrogels utilisés pour des applications biomédicales. Ces défis peuvent être surmontés en utilisant des flux de travail automatisés avec des processus de mélange standardisés pour augmenter la reproductibilité. Dans cette étude, nous présentons des instructions étape par étape pour utiliser un concepteur de protocole open source, pour faire fonctionner un poste de travail open source et pour identifier les mélanges reproductibles. Plus précisément, le concepteur de protocole open source guide l’utilisateur à travers la sélection expérimentale des paramètres et génère un code de protocole prêt à l’emploi pour faire fonctionner le poste de travail. Ce poste de travail est optimisé pour le pipetage de matériaux visqueux afin de permettre une manipulation automatisée et hautement fiable grâce à l’intégration de quais de température pour les matériaux thermorésensibles, de pipettes à déplacement positif pour les matériaux visqueux et d’un quai tactile en option pour éliminer l’excès de matériau de la pointe de la pipette. La validation et la vérification des mélanges sont effectuées par une mesure d’absorbance rapide et peu coûteuse d’Orange G. Ce protocole présente des résultats pour obtenir des mélanges de glycérol à 80% (v/v), une série de dilution pour la méthacryloyl de gélatine (GelMA) et des hydrogels à double réseau de 5% (p/v) de GelMA et de 2% (p/v) d’alginate. Un guide de dépannage est inclus pour aider les utilisateurs à adopter le protocole. Le flux de travail décrit peut être largement appliqué à un certain nombre de matériaux visqueux pour générer des concentrations définies par l’utilisateur de manière automatisée.

Introduction

La reproductibilité et la reproductibilité sont d’une importance capitale dans les travaux scientifiques1,2,3,4. Cependant, des preuves récentes ont mis en évidence des défis importants dans la répétition d’études biomédicales à fort impact en sciences fondamentales ainsi qu’en recherche translationnelle4,5,6,7. Les facteurs contribuant à des résultats irreproductibles sont complexes et multiples, tels qu’une conception d’étude médiocre ou biaisée6,8, une puissance statistique insuffisante3,9, une conformité insuffisante aux normes de déclaration7,10,11, une pression pour publier6 ou des méthodes ou un code logiciel indisponible6,9 . Parmi eux, des changements subtils dans le protocole et des erreurs humaines dans l’exécution des expériences ont été identifiés comme d’autres éléments expliquant l’irreproductibilité4. Par exemple, les tâches manuelles de pipetage introduisent une imprécision intra- et inter-individuelle12,13 et augmentent la probabilité d’erreurs humaines14. Alors que les robots commerciaux de manutention de liquides sont capables de surmonter ces inconvénients et ont démontré une fiabilité accrue pour les liquides15,16,17, la manipulation automatisée de matériaux ayant des propriétés visqueuses importantes reste difficile.

Les robots commerciaux de traitement des liquides utilisent généralement des pipettes à coussin d’air, également connues sous le nom de pipettes à piston d’air ou de pipettes à déplacement d’air. Le réactif et le piston sont séparés par un coussin d’air qui rétrécit pendant les étapes de distribution et se dilate pendant les étapes d’aspiration. À l’aide de pipettes à coussin d’air, les matériaux visqueux ne « s’écoulent » que lentement dans et hors de la pointe, et le retrait précoce de la pipette du réservoir peut entraîner l’aspiration de bulles d’air. Pendant les tâches de distribution, le matériau visqueux laisse un film sur la paroi interne de la pointe qui ne « coule » que lentement ou pas du tout lorsqu’il est forcé par l’air. Pour surmonter ces problèmes, des pipettes à déplacement positif ont été introduites commercialement pour extruder activement le matériau visqueux hors de la pointe à l’aide d’un piston solide. Bien que ces pipettes à déplacement positif permettent une manipulation précise et fiable des matériaux visqueux, les solutions automatisées avec des pipettes à déplacement positif sont encore trop coûteuses pour les laboratoires universitaires et, par conséquent, la plupart des flux de travail avec des matériaux visqueux reposent uniquement sur des tâches de pipetage manuel18.

En général, la viscosité est définie comme la résistance d’un fluide à l’écoulement, et les matériaux visqueux sont en outre définis comme des matériaux ayant une plus grande viscosité de l’eau (0,89 mPa·s s à 25 °C). Dans le domaine des applications biomédicales, les installations expérimentales contiennent souvent plusieurs matériaux ayant une viscosité supérieure à celle de l’eau, tels que le diméthylsulfoxyde (DMSO; 1,99 mPa·s à 25 °C), le glycérol (208,1 mPa·s à 25 °C pour 90 % de glycérol [v/v]), le triton X-100 (240 mPa·s à 25 °C) et les polymères gonflés à l’eau, appelés hydrogels19, 20. Les hydrogels sont des réseaux de polymères hydrophiles disposés en mode physique et/ou chimique utilisés pour diverses applications, y compris l’encapsulation cellulaire, l’administration de médicaments et les actionneurs souples19,20,21,22. La viscosité des hydrogels dépend de la concentration du polymère et du poids moléculaire19. Les hydrogels couramment utilisés pour des applications biomédicales présentent des valeurs de viscosité comprises entre 1 et 1000 mPa·s, tandis que des systèmes d’hydrogel spécifiques ont été rapportés avec des valeurs allant jusqu’à 6 x 107 mPa·s19,23,24. Cependant, les mesures de viscosité des hydrogels ne sont pas normalisées en termes de protocole de mesure et de préparation des échantillons, et, par conséquent, les valeurs de viscosité entre les différentes études sont difficiles à comparer.

Étant donné que les solutions automatisées disponibles dans le commerce spécialement conçues pour les hydrogels sont manquantes ou trop coûteuses, les flux de travail actuels pour l’hydrogel dépendent de la manipulation manuelle18. Pour comprendre les limites du flux de travail manuel actuel pour le pipetage des hydrogels, il est important de comprendre les tâches de manutention essentielles18. Par exemple, une fois qu’un nouveau matériau d’hydrogel a été synthétisé, une concentration souhaitée ou une série de dilution avec des concentrations variables est générée pour identifier des protocoles de synthèse fiables et des caractéristiques de réticulation avec une analyse ultérieure des propriétés mécaniques25,26,27,28 . En général, une solution mère est préparée ou achetée, puis mélangée avec un diluant et/ou d’autres réactifs pour obtenir un mélange. Les tâches de mélange ne sont généralement pas effectuées directement dans une plaque de puits (ou n’importe quel format de sortie), et sont plutôt effectuées dans un tube de réaction séparé, communément appelé mélange maître. Au cours de ces tâches de préparation, diverses étapes d’aspiration et de distribution sont nécessaires pour transférer le ou les matériaux visqueux, mélanger les réactifs et transférer le mélange dans un format de sortie (par exemple, une plaque de 96 puits). Ces tâches nécessitent une grande quantité de travail humain18, de longues heures expérimentales et augmentent la probabilité d’erreurs humaines qui pourraient potentiellement se manifester par des résultats inexacts. De plus, la manipulation manuelle empêche la préparation efficace de nombres d’échantillons élevés pour filtrer diverses combinaisons de paramètres afin une caractérisation détaillée. Le traitement manuel empêche également l’utilisation d’hydrogels pour des applications de criblage à haut débit, telles que l’identification de composés prometteurs pendant le développement de médicaments. Les étapes actuelles de préparation manuelle ne sont pas réalisables pour dépister les bibliothèques de médicaments composées de milliers de médicaments. Pour ces raisons, des solutions automatisées sont nécessaires pour fournir un processus de développement efficace et permettre la traduction réussie d’hydrogels pour les applications de dépistage de médicaments.

Pour passer de flux de travail manuels à des processus automatisés, nous avons optimisé un robot de pipetage open source commercial pour la manipulation de matériaux visqueux par l’intégration de stations de température pour les matériaux thermorésensibles, l’utilisation de pipettes volumétriques prêtes à l’emploi utilisant des pointes de piston capillaire et une station d’accueil tactile en option pour le nettoyage des pointes de pipette. Ce robot de pipetage a été intégré en tant que module de pipetage dans un poste de travail open source nouvellement développé, qui se compose de modules prêts à installer et personnalisables18,29. Les instructions de montage détaillées pour le poste de travail développé, y compris les fichiers matériels et logiciels, sont librement accessibles depuis le GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) et le référentiel Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). En plus du développement matériel, une application de conception de protocole open source a été programmée et publiée pour guider l’utilisateur tout au long du processus de sélection des paramètres et générer un code de protocole prêt à l’emploi (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp). Ce code s’exécute sur le robot de pipetage open source commercial ainsi que sur le poste de travail open source développé.

Un tutoriel complet est fourni ici sur le fonctionnement de la station de travail open source pour automatiser les tâches de mélange pour les matériaux visqueux (Figure 1). Les étapes de protocole spécifiques au didacticiel peuvent être effectuées avec la station de travail open source développée ainsi qu’avec le robot de pipetage open source commercial. Soutenu par une application de conception de protocole open source développée en interne, le mélange automatisé et la préparation des concentrations requises pour le glycérol, la géthacryloyl de gélatine (GelMA) et l’alginate sont démontrés. Le glycérol a été sélectionné dans ce tutoriel, car il est bien caractérisé30,31, il est peu coûteux et facilement disponible, et, par conséquent, il est couramment utilisé comme matériau de référence visqueux pour les tâches de pipetage automatisées. À titre d’exemples d’hydrogels utilisés dans des applications biomédicales, gelMA et solutions précurseurs d’hydrogel d’alginate ont été appliquées pour des expériences de mélange automatisées. GelMA présente l’un des hydrogels les plus couramment utilisés pour les études d’encapsulation cellulaire32,33, et l’alginate a été sélectionné dans cette étude pour démontrer la capacité de fabriquer des hydrogels à double réseau34,35. En utilisant Orange G comme colorant, une procédure rapide et peu coûteuse a été mise en œuvre pour valider et vérifier les résultats du mélange avec un spectrophotomètre16.

Un robot de pipetage open source commercial a été intégré en tant que module de pipetage dans le poste de travail open source développé (Figure 2a), et par conséquent, le nom de « module de pipetage » est également utilisé pour décrire le robot de pipetage. Une description détaillée du matériel installé dépasse le cadre de ce protocole et est disponible via les référentiels fournis qui incluent également des instructions étape par étape pour l’assemblage général de la plate-forme open source. Le module de pipetage peut être équipé de deux pipettes (pipette à un ou 8 canaux) qui sont installées sur l’axe A (à droite) et l’axe B (à gauche) (Figure 2b). Le module de pipetage offre une capacité de 10 ponts selon les normes ansI/SLAS (American National Standards Institute/Society for Laboratory Automation and Screening), et les positions d’emplacement suivantes sont définies sur le pont : A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (Figure 2c). Pour initier la polymérisation photo-induite des solutions d’hydrogel, un module de réticulation séparé est nécessaire et a été ajouté au poste de travail. Le module de réticulation est équipé de LED d’une longueur d’onde de 400 nm et, par conséquent, des substances qui excitent à une longueur d’onde de lumière visible peuvent être utilisées avec les systèmes actuels, telles que le lithium phényl-2,4,6 triméthylbenzoylphosphinate (LAP)36,37. L’intensité (en mW/cm2) des LED peut être traitée par l’utilisateur dans l’application de conception de protocole pour étudier le comportement de réticulation38. Le poste de travail comprend également un module de stockage pour permettre des études de débit accrues; toutefois, ce module n’est pas utilisé dans le cadre de la présente étude et, par conséquent, n’est pas décrit plus en détail. En général, il est recommandé d’utiliser le module de pipetage dans une armoire de sécurité biologique pour éviter la contamination des échantillons. Le circuit d’alimentation principal pour faire fonctionner le module de pipetage est un circuit de 12 V, qui est considéré comme une application basse tension dans la plupart des pays. Tous les composants électriques sont basés dans un boîtier de commande dédié empêchant les utilisateurs d’entrer en contact avec la source d’un danger électrique.

En suivant ces protocoles de mélange standardisés, les chercheurs sont en mesure d’obtenir des mélanges fiables pour les matériaux visqueux et non visqueux de manière automatisée. L’approche open source permet aux utilisateurs d’optimiser les séquences de mixage et de partager les protocoles nouvellement développés avec la communauté. En fin de compte, cette approche facilitera le criblage de combinaisons de paramètres multiples pour étudier les interdépendances entre différents facteurs et, par conséquent, accélérer l’application et le développement fiables de matériaux visqueux pour des applications biomédicales.

Protocol

REMARQUE: Le protocole commence par une introduction à (1) le logiciel et (2) la configuration matérielle pour familiariser l’utilisateur avec les installations requises et le poste de travail. Après une section sur (3) la préparation du matériel et (4) l’utilisation de l’application de concepteur de protocole, (5) l’étalonnage du module de pipetage et (6) l’exécution du protocole automatisé sont mis en évidence en détail. Enfin, (7) les procédures de validation et de vérification sont décrites, y compris la lecture de l’absorbance et l’analyse des données. Un flux de travail de protocole général avec des tâches individuelles est illustré à la figure 1.

1. Configuration du logiciel

REMARQUE: Cette section comprend une instruction détaillée pour installer l’interface de programmation d’application (API) ainsi que l’application de concepteur de protocole requise et le terminal d’étalonnage. Les instructions suivantes sont écrites pour un ordinateur monocarte Raspberry Pi (RPi) ; Cependant, Windows 8, 10 et macOS 10.13+ ont également été utilisés avec succès avec l’API et les applications.

  1. Configurez l’environnement informatique.
    REMARQUE: Familiarisez-vous avec les bases de Python39, comment configurer et utiliser un Raspberry Pi40,41 et comment vous connecter à Internet42. Les étapes suivantes du didacticiel se concentrent sur les étapes spécifiques au protocole et des informations supplémentaires sur l’utilisation d’un Raspberry Pi sont disponibles en ligne40.
    1. Ouvrez une fenêtre de terminal à partir de la barre des tâches ou du menu de l’application.
    2. Mettez à jour la liste des packages du système :
      sudo apt-get mise à jour
    3. Mettez à niveau tous les packages installés :
      sudo apt-get dist-upgrade
    4. Redémarrez le Raspberry Pi :
      sudo redémarrer
    5. Vérifiez la version de Python installée :
      python3 --version
      Assurez-vous qu’au moins Python 3.5 est installé ; sinon, installez la dernière version43.
    6. Installez python pip, qui publie des packages Python avec le Python Package Index44 :
      sudo apt-get installer python3-pip
    7. Installer les dépendances :
      pip installer numpy
      pip installer python-resize-image
      REMARQUE: Si vous utilisez Windows, vous devez installer le package windows-curses via: python -m pip install windows-curses
  2. Installez l’interface de programmation d’application (API).
    REMARQUE: L’API fournit un framework Python simple conçu pour écrire un script de protocoles expérimentaux et faire fonctionner le poste de travail. Les deux API suivantes sont requises pour exécuter correctement le code de protocole généré.
    1. Installer l’API du poste de travail :
      pip installer openworkstation
    2. Installez l’API Opentrons pour faire fonctionner le module de pipetage :
      pip install opentrons==2.5.2
    3. Vérifiez si l’API est installée avec succès :
      python3
      >>> importer openworkstation
      >>> importer des opentrons
      REMARQUE : La taille de l’API et de l’application de conception de protocole est de 2,2 Mo et 1,2 Mo, respectivement. Aucun problème n’a été rencontré lors de l’installation lorsqu’il est utilisé avec un espace disque limité (200 Mo). Toutefois, l’espace disque requis dépend du système d’exploitation.
  3. Sélectionnez un répertoire pour le téléchargement de fichiers (terminal d’étalonnage, application de conception de protocole, etc.).
    REMARQUE: Les fichiers peuvent être copiés et collés ailleurs par la suite.
  4. Cloner des fichiers à partir du référentiel GitHub :
    https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation de clone git
    REMARQUE: La commande 'git clone' clone et enregistre ensuite tous les fichiers dans le répertoire, qui est ouvert dans le terminal à ce moment-là. Étant donné que le référentiel inclut également les fichiers matériels de l’assembly, le référentiel entier n’est pas requis pour exécuter les protocoles présentés. Tous les fichiers requis pour répliquer les expériences sont disponibles en tant que fichier supplémentaire et dans le référentiel GitHub sous « /examples/publication-JoVE ».
  5. Ouvrez le dossier téléchargé. Si l’ensemble du référentiel a été téléchargé, accédez au dossier 'publication-JoVE' via
    cd openworkstation/exemples/publication-JoVE
    REMARQUE: Ce dossier comprend les fichiers nécessaires au fonctionnement du poste de travail et à l’utilisation de l’application de concepteur de protocole et du terminal d’étalonnage.

2. Configuration matérielle

  1. Placez le poste de travail dans une armoire de sécurité biologique pour éviter la contamination des échantillons.
  2. Installez des pipettes sur le poste de travail.
    1. Sélectionnez la taille de la pipette en fonction de la configuration expérimentale. En général, prenez une taille de pipette dont le volume à aspirer se situe à l’extrémité supérieure de la gamme. Si des tâches de mélange avec des volumes supérieurs à 1 mL sont nécessaires pour une configuration spécifique (par exemple, aspiration/distribution de 2 mL), choisissez le M1000E avec un volume maximal d’aspiration/distribution de 1 000 μL pour minimiser les étapes de pipetage et gagner du temps.
      REMARQUE : Une instruction détaillée pour les pipettes à déplacement d’air est disponible en ligne45. Le module de pipetage développé est capable d’intégrer les pipettes volumétriques standard suivantes : M10E (1–10 μL), M25E (3–25 μL), M50E (20–50 μL), M100E (10–100 μL), M250E (50–250 μL), M1000E (100–1 000 μL).
    2. Utilisez une clé M4 Allen pour desserrer et serrer les vis.
    3. Fixez les deux plaques de fixation de la pipette (plaques acryliques blanches) au rail en aluminium et serrez les vis M5 lâchement.
    4. Insérez la pipette dans les deux plaques de fixation de la pipette et assurez-vous que la queue ergonomique de la pipette repose sur le côté opposé de la plaque de montage en acrylique.
    5. Serrez fermement les quatre vis des deux plaques de fixation de la pipette.
    6. Faites glisser les deux écrous de fixation carrés, qui sont fixés à la plaque de montage en acrylique, dans la fente d’extrusion de l’axe Z et serrez les vis.
      REMARQUE: Fixez la pipette hermétiquement pour éviter tout mouvement pendant le fonctionnement.

3. Préparation du matériel

REMARQUE: Les matériaux visqueux (glycérol, GelMA, alginate) sont utilisés pour les expériences présentées dans cette étude et, par conséquent, les volumes préparés et les tâches de manipulation (par exemple, ajouter 5 mL de solution mère dans des tubes de réaction de 5 mL) sont spécifiquement destinés à cette configuration expérimentale.

  1. Gélatine méthacryloyl (GelMA)
    REMARQUE: La fonctionnalisation, la dialyse et la lyophilisation de GelMA ne sont pas la portée de cet article, et un protocole étape par étape est disponible dans Loessner et al.33. Le protocole commence à utiliser gelma lyophilisé, qui peut être préparé en interne ou acheté dans le commerce.
    1. Calculer la masse requise de GelMA (mGelMA) en fonction de la concentration finale souhaitée sur le stock (cGelMA) et du volume (VGelMA) en utilisant l’équation:
      mGelMA = cGelMA x VGelMA
      REMARQUE: VGelMA dépend de la configuration expérimentale et il est recommandé de préparer 20 à 30% de matériau en excès. Les protocoles présentés commencent avec 5 mL de GelMA à 20% (p/v) en solution mère.
    2. Peser la quantité requise de GelMA lyophilisée, l’ajouter dans un tube de réaction de 50 mL et ajouter la quantité requise de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    3. Mélanger GelMA soit en trempant dans le solvant à 4 °C pendant la nuit, soit en chauffant à 60 °C pendant 6 h au bain-marie.
      REMARQUE: Les solutions stériles de GelMA peuvent être conservées à l’abri de la lumière à 4 °C pendant au moins six mois.
    4. Remplissez 5 mL de GelMA dans des tubes de réaction de 5 mL.
  2. Photoinitiateur : Lithium phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate (LAP)
    REMARQUE: Évitez toute exposition supplémentaire à la lumière de la pièce, car lap est sensible à la lumière.
    1. Calculer la masse requise de LAP (mLAP) en fonction de la concentration finale souhaitée sur le stock (cLAP) et du volume requis (VLAP) à l’aide de l’équation :
      mLAP = cLAP x VLAP
      REMARQUE: Il est recommandé de préparer une solution mère à 3% (p / v).
    2. Peser la quantité requise de LAP, l’ajouter dans un tube de réaction de 15 mL et ajouter du PBS.
    3. Enveloppez le tube dans du papier d’aluminium pour éviter la décomposition photo-induite.
    4. Dissoudre le LAP en plaçant le tube de réaction dans un bain-marie à 37 °C pendant 2 h ou jusqu’à dissolution complète.
    5. Remplir 1 mL de solution mère LAP dans des tubes de 5 mL.
  3. Alginate
    1. Calculer la quantité requise d’alginate (malginate) en fonction de la concentration finale souhaitée sur le stock (calcomininé) et du volume (valginate) à l’aide de l’équation :
      malginate = calginate x valginate
      REMARQUE: Valginate dépend de la configuration expérimentale et il est recommandé de préparer 20-30% de matériel en excès. Les protocoles présentés commencent avec 5 mL d’alginate à 4 % (p/v) en solution mère.
    2. Peser la masse requise d’alginate, l’ajouter dans des tubes de réaction de 50 mL et ajouter du PBS.
    3. Placer le mélange d’alginate dans un bain-marie à 37 °C pendant 4 h.
      REMARQUE: L’utilisation d’un mélangeur vortex accélérera le processus de dissolution, mais générera également des bulles d’air. L’alginate dissous peut être conservé à 4 °C pendant au moins six mois.
    4. Remplir 5 mL d’alginate dans des tubes de réaction de 5 mL.
  4. Remplir 5 mL de glycérol dans des tubes de réaction de 5 mL.
  5. Solution Orange G
    1. Préparer une solution mère d’Orange G à 10 mg/mL dans un tube de réaction de 50 mL.
      REMARQUE: Le volume dépend du nombre d’expériences. Selon le type de diluant, préparer la solution mère dans de l’eau ultrapure, du PBS ou un réactif diluant approprié. Dans les expériences présentées, de l’eau ultrapure a été utilisée pour diluer le glycérol et le PBS pour diluer le GelMA et l’alginate. Le PBS a été utilisé comme diluant pour le GelMA et l’alginate, et peut être préparé à l’aide de comprimés ou acheté sur étagère.
    2. Mélanger pendant 10 s par vortex.
    3. Enveloppez le tube dans du papier d’aluminium pour éviter la décomposition photo-induite.
      REMARQUE: La solution mère peut être utilisée après 24 h pour assurer la dissolution correcte d’Orange G.
    4. Diluer la solution mère dans une solution de travail de 1 mg/mL dans un tube de réaction de 50 mL.
    5. Transférer la solution de travail dans des flacons/tubes appropriés pour l’installation expérimentale.
      REMARQUE: Pour les expériences présentées, la solution de travail a été remplie dans des tubes de 5 mL. Le stock et la solution de travail Orange G peuvent être conservés à 4 °C et utilisés dans les trois mois suivant la préparation.
    6. Remplir 5 mL de la solution de travail Orange G de 1 mg/mL dans des tubes de réaction de 5 mL.

4. Générer du code de protocole avec l’application de concepteur de protocole

REMARQUE: Les paramètres spécifiés aux étapes 4.2 à 4.7 sont les mêmes pour toutes les expériences menées, à l’exception de la concentration en stock du matériau et de la concentration finale en sortie. Ces paramètres sont résumés dans le tableau 1 et, dans ce qui suit, des paramètres sont utilisés pour préparer des hydrogels à double réseau avec 5 % (p/v) de GelMA, 2 % (p/v) d’alginate, 0,15 % (p/v) lap et PBS comme diluant.

  1. Ouvrez l’application de concepteur de protocole en exécutant 'ProtocolDesignApp.html'.
    REMARQUE: L’application « ProtocolDesignApp.html » guide l’utilisateur tout au long du processus de sélection des paramètres et génère automatiquement le protocole prêt à l’emploi pour faire fonctionner le poste de travail. L’interface utilisateur fonctionne sur tous les navigateurs Internet couramment utilisés (c’est-à-dire Chrome, Firefox, Safari, Edge, Internet Explorer).
  2. Entrez le nom du protocole (par exemple, double-network-hydrogels) sur la page de configuration.
  3. Cliquez sur 'Continuer' pour confirmer le nom du protocole et passez à l’étape suivante.
  4. Définissez le bac d’entrée en sélectionnant « Bloc chauffant 3x4 » dans le menu déroulant et les paramètres d’entrée suivants :
    1. Sélectionnez 'Gel 1' dans le menu déroulant, entrez le nom 'GelMA', entrez la concentration en stock '20%', réglez 'Nombre d’échantillons' sur '3' pour remplir une colonne. Cliquez sur '+ajouter' pour enregistrer les entrées.
    2. Sélectionnez 'Gel 2' dans le menu déroulant, entrez le nom: 'Alginate', entrez la concentration en stock '4%', réglez 'Nombre d’échantillons' sur '3' pour remplir une colonne. Cliquez sur '+ajouter' pour enregistrer les entrées.
    3. Sélectionnez 'Photoinitiateur' dans le menu déroulant, entrez le nom: 'LAP', entrez la concentration de stock '3%', réglez 'Nombre d’échantillons' sur '3' pour remplir une colonne. Cliquez sur '+ajouter' pour enregistrer les entrées.
    4. Sélectionnez 'Diluant 1' dans le menu déroulant, entrez le nom: 'PBS', réglez 'Nombre d’échantillons' sur '3' pour remplir une colonne. Cliquez sur '+ajouter' pour enregistrer les entrées.
      REMARQUE: La visualisation du bac de saisie se met à jour automatiquement, une fois que vous avez cliqué sur « +ajouter ». Si plus d’entrées sont ajoutées que la capacité du plateau, l’avertissement « Trop d’échantillons pour ce plateau » sera affiché à l’utilisateur.
  5. Définissez les paramètres de réticulation en cochant 'Photo crosslinking' et en tapant le temps en secondes, '30', et l’intensité W/m2 avec '2'.
  6. Terminez la configuration de la saisie en cliquant sur 'CONTINUER'.
  7. Définissez la configuration du plateau de sortie en sélectionnant « Plaque de 96 puits » dans le menu déroulant pour le type de plaque de puits.
  8. Cliquez sur 'Groupe1' pour définir les sorties en créant un groupe d’échantillons.
    1. Spécifiez la composition de sortie en entrant les concentrations souhaitées et le volume d’échantillon dans les champs pour chaque entrée: GelMA = '5', Alginate = '2', LAP = '0,15', Volume total = '60'.
    2. Cochez la case pour appliquer le protocole de mélange avancé.
  9. Spécifiez le nombre d’échantillons en entrant le nombre d’échantillons dans le champ 'Nombre d’échantillons': '96'.
    REMARQUE: La visualisation de la barre d’exemples se met automatiquement à jour, une fois que vous avez cliqué sur « + ajouter un groupe ». Si plus d’échantillons sont ajoutés que la capacité du plateau, l’avertissement « Trop d’échantillons pour ce plateau » sera affiché à l’utilisateur.
  10. Terminez la configuration de la sortie en cliquant sur 'CONTINUER'.
    1. Sélectionnez la position du plateau sur la disposition du pont et préparez la plate-forme en conséquence:
    2. Cochez la case dans le champ 'SLOT A1' et sélectionnez 'Empty_Cell' dans le menu déroulant.
    3. Cochez la case dans le champ 'SLOT A2' et sélectionnez 'Trash_Cell' dans le menu déroulant.
    4. Cochez la case dans le champ 'SLOT B1' et sélectionnez 'Tips_Cell_100 μL' dans le menu déroulant.
    5. Cochez la case dans le champ 'SLOT B2' et sélectionnez 'Tips_Cell_1000 μL' dans le menu déroulant.
    6. Cochez la case dans le champ 'SLOT C1' et sélectionnez 'Input_Cell' dans le menu déroulant.
    7. Cochez la case dans le champ 'SLOT C2' et sélectionnez 'Empty_Cell' dans le menu déroulant.
    8. Cochez la case dans le champ 'SLOT D1' et sélectionnez 'Mixing_Cell' dans le menu déroulant.
    9. Cochez la case dans le champ 'SLOT D2' et sélectionnez 'Output_Cell' dans le menu déroulant.
    10. Définissez le type et les caractéristiques de la première pipette (M100E) en cochant 'Pipette Left', en sélectionnant '10-100μL de déplacement positif' dans le menu déroulant et en réglant la vitesse d’aspiration = '600', la vitesse de distribution = '800'.
    11. Définissez le type et les caractéristiques de la deuxième pipette (M1000E) en cochant 'Pipette Right', en sélectionnant '100-1000μL de déplacement positif' dans le menu déroulant et en réglant la vitesse d’aspiration = '800', la vitesse de distribution = '1200'.
  11. Cliquez sur 'GENERATE PROTOCOL' pour confirmer la configuration et générer le script de protocole.
    REMARQUE : L’application de concepteur de protocole développée génère automatiquement un nouveau dossier chaque fois qu’un nouveau protocole est généré. Tous les fichiers nécessaires à cette expérience et au fonctionnement du poste de travail sont enregistrés dans ce dossier nommé d’après le nom du protocole. Le dossier peut être copié dans différents répertoires sans causer de problèmes.
  12. Ne fermez pas l’interface, car elle sera utilisée pour exécuter le protocole (voir étape 6.6.).

5. Étalonnage du module de pipetage

REMARQUE : Les contenants (p. ex., plaques de puits, porte-embouts, poubelles) et les pipettes (p. ex., M1000E) doivent être étalonnés au départ. Si un récipient et/ou une position de pipette sont modifiés/changés, la nouvelle position doit être étalonnée.

  1. Accédez au dossier du protocole et ouvrez le terminal d’étalonnage en exécutant le fichier 'calibrate.py' dans un windox terminal (voir étape 1.1.1) :
    phython.calibrate.py
    REMARQUE: L’interface « calibrate.py » guide l’utilisateur tout au long de l’étalonnage de la configuration du pont et des pipettes. Assurez-vous que le fichier se trouve dans le même dossier que le fichier de protocole et les fichiers de module. Il est généré automatiquement à l’étape 4.10.
  2. Sélectionnez les incréments de mouvement pour le mouvement plungerx,y,z avec le pavé numérique (1−8): '1' pour 0,1 mm, '2' pour 0,5 mm, '3' pour 1 mm, '4' pour 5 mm, '5' pour 10, '6' pour 20 mm, '7' pour 40 mm et '8' pour 80 mm.
  3. Calibrez la pipette.
    1. Appuyez sur le raccourci clavier P pour sélectionner la taille de la pipette.
    2. Appuyez sur le raccourci clavier V pour passer en mode d’étalonnage du piston.
      REMARQUE: Il est recommandé de commencer par de petits incréments (2, 5 et 10 mm) pour se familiariser avec la taille de l’incrément et l’action de mouvement de la tête de pipette.
    3. Calibrer les positions de piston suivantes pour une pipette volumétrique : T–Top = position de repos ; B–Bottom = le piston est poussé jusqu’à ce que la résistance soit atteinte; P–Pick-up = le piston est poussé à une position où une pointe de piston peut être fixée; E–Eject = le piston est poussé jusqu’à ce qu’une pointe attachée soit éjectée. Variez les positions du piston à l’aide des flèches vers le haut et vers le bas du clavier et enregistrez la position finale à l’aide de S sur le clavier.
    4. Quittez le mode d’étalonnage du piston de pipette en appuyant sur le raccourci clavier V.
  4. Calibrer la position du récipient par rapport à l’embout de la pipette.
    1. Appuyez sur le raccourci clavier P pour sélectionner le type de pipette. Assurez-vous qu’une pointe est connectée à la pipette sélectionnée.
    2. Appuyez sur le raccourci clavier C pour sélectionner le type de conteneur.
    3. Sélectionnez un incrément de mouvement approprié et déplacez l’embout de la pipette aux positions suivantes. Pour les plaques de puits, calibrer à la position de puits « A1 » en bas; Pour le porte-embouts, calibrer à la position « A1 »; Pour la corbeille, choisissez une position (définie comme un point) où la pointe peut être éjectée dans la corbeille.
    4. Appuyez sur le raccourci clavier S pour enregistrer la position.
    5. Répétez les étapes 5.3.1 à 5.3.3 pour tous les récipients répertoriés sous « C » pour le type de pipette sélectionné.
    6. Répétez 5.3.1−5.3.5 pour le deuxième type de pipette.
    7. Fermez le script d’étalonnage.

6. Exécution du protocole avec le poste de travail

REMARQUE: Les fichiers de protocole sont accessibles via le référentiel et sont également disponibles en tant que fichier supplémentaire.

  1. Positionnez le conteneur à ordures, les porte-embouts, le bac d’entrée, le plateau de mélange et la sortie sur le pont (défini à l’étape 4.3).
  2. Calibrer les pipettes et les instruments tels que définis à la section 5.
  3. Si nécessaire, allumez la station de température et sélectionnez la température pour le plateau d’entrée et de mélange.
    REMARQUE: Les expériences de ce tutoriel ont été menées sans contrôle de la température et à 40 ° C pour le glycérol et à 37 ° C pour le pipetage de GelMA et d’alginate.
  4. Positionnez les tubes avec des réactifs d’entrée dans les blocs d’aluminium sur les quais de température en fonction de la configuration sélectionnée.
  5. Attendez que les réactifs d’entrée aient atteint la température souhaitée.
    REMARQUE: Pour assurer une bonne répartition de la température, un temps d’incubation de 30 min est recommandé pour gelma et alginate.
  6. Exécutez le fichier de protocole en cliquant sur 'RUN PYTHON SCRIPT'
    REMARQUE : Le protocole sélectionné est maintenant exécuté par le poste de travail. La vidéo d’accompagnement met en évidence le mélange automatisé de GelMA et la distribution de 60 μL dans une plaque de 96 puits.
  7. L’exécution est terminée lorsque 'Terminé' s’affiche.

7. Processus de validation et de vérification

  1. Retirez la plaque de puits du poste de travail et transportez la plaque de puits avec les échantillons vers un spectrophotomètre.
  2. Lire l’absorbance avec un spectrophotomètre à 450 nm. Lisez chaque plaque 2x pour comparer les résultats et assurer des résultats cohérents.
  3. Exportez et enregistrez les lectures d’absorbance.
  4. Analyse des données.
    REMARQUE : Les données expérimentales peuvent être traitées individuellement ou copiées et collées dans le modèle fourni pour évaluer la moyenne, l’écart-type et la valeur du coefficient de variance (CV) à l’aide d’un tableur.
    1. Ouvrez le fichier supplémentaire 'supplementary_template-analysis.xlsx », qui est également disponible dans le référentiel GitHub sous 'openworkstation/examples/publication-JoVE.
    2. Copiez les lectures d’absorbance dans la feuille « données brutes », assurez-vous que toutes les références de cellule sont correctement définies dans tous les tableaux et cliquez sur la feuille « analyse » pour obtenir des informations sur les valeurs moyennes, d’écart-type et de coefficient de variance (CV).
      REMARQUE: En fonction de la distribution de l’échantillon sur une plaque de puits, les types d’évaluation prédéfinis suivants sont disponibles avec le modèle: le type « Uniforme » est utilisé lorsque tous les échantillons ont la même composition, le type « Par lignes » est utilisé lorsque les échantillons de différentes lignes ont des compositions différentes, le type « Par colonnes » est utilisé lorsque les échantillons de différentes colonnes ont des compositions différentes, et le type « Personnalisé » est utilisé lorsque les positions de l’échantillon sont spécifiques à l’utilisateur.

Representative Results

Ce tutoriel présente les résultats d’expériences avec du glycérol (Figure 3) et du GelMA avec lap et alginate (Figure 4).

La génération d’une solution de glycérol à 80 % (v/v) a été étudiée soit sans contrôle de la température (température ambiante, 22 °C) et sans contact avec la pointe (définie comme la configuration 1), avec contrôle de la température (40 °C) et sans contact de la pointe (configuration 2), soit avec contrôle de la température (40 °C) et avec la pointe tactile (configuration 3) (figure 3a-i). Ces deux réglages de température ont été choisis pour évaluer la différence de manipulation, car la viscosité du glycérol diminue presque d’un facteur 3 lorsqu’il est chauffé de 22 °C (139,5 mPa·s) à 40 °C (46,6 mPa·s)30. Une solution mère de glycérol à 85 % (v/v) a été diluée à une concentration finale de 80 % et répartie uniformément dans une plaque de 96 puits (n = 96 par installation). Le temps expérimental, qui comprend la distribution de chaque matériau dans le tube de mélange, les tâches de mélange respectives et la distribution de l’échantillon dans une plaque de 96 puits, était de 30 min 42 s. Pour identifier les différences entre les mélanges de dilution, de l’eau ultrapure – comme diluant du glycérol – a été préparée avec 1 mg/mL d’Orange G. Les lectures d’absorbance soulignent que l’intégration du contrôle de la température et du toucher de pointe a un impact significatif sur les mélanges (p < 0,0001). En plus de l’analyse bidirectionnelle de variance (ANOVA) effectuée, les valeurs CV ont été calculées pour évaluer l’écart-type relatif. Le coefficient de variation décrit un indicateur normalisé permettant d’identifier le degré d’écart par rapport à la moyenne et est exprimé en pourcentage. Si les moyennes de l’échantillon ne sont pas particulièrement le point d’intérêt, mais la variabilité au sein des mesures, le coefficient de variation fournit des informations supplémentaires pour identifier les mélanges reproductibles46. Dans le cadre de cette expérience avec trois configurations différentes, les valeurs d’absorbance ont montré des valeurs CV décroissantes de 5,6 %, 4,2 % à 2,0 % pour la configuration 1, la configuration 2 et la configuration 3, respectivement, démontrant l’influence significative de la station d’accueil de température et de la fonction tactile de pointe sur la production de résultats fiables (Figure 3a-ii). Le traçage des valeurs d’absorbance de l’échantillon pour la configuration 3 (numéro d’échantillon #1 à #96 dans une plaque de puits 96) ne donne aucune valeur croissante ou décroissante tout au long de l’expérience et, par conséquent, n’indique aucune influence de la position de l’échantillon sur les valeurs d’absorbance (Figure 3a-iii). La visualisation des données pour chaque plaque de puits mesurée à l’aide de cartes thermiques fournit des informations supplémentaires pour identifier les hétérogénéités d’une ligne ou d’une colonne spécifique, ou les valeurs d’absorbance variables tout au long des tâches de distribution. Les cartes thermiques visualisées pour les trois configurations affichent des hétérogénéités réduites sur l’ensemble des plaques de puits, de la configuration 1 à la configuration 3 (Figure 3b). Enfin, la reproductibilité du mélange conduit a été évaluée en huit séries indépendantes (Figure 3c-i,ii), où chaque exécution a pris 6 min 57 s. Les cycles de mélange simples ont montré de faibles valeurs CV comprises entre 1,1% et 2,6%, ce qui indique des tâches de mélange et de distribution très fiables pour les séries individuelles. Les valeurs d’absorbance des huit séries ont donné une valeur CV de 3,3 % et ont démontré la reproductibilité du protocole de mélange établi.

Les séries de dilution GelMA ont été préparées en diluant une solution mère à 20 % (p/v) avec du PBS à 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 et 0 % (p/v) et en ajoutant du LAP à une concentration constante de 0,15 % (p/v) (figure 4a-i), ce qui a pris au total 55 min 12 s. Comme spécifié dans le script du protocole expérimental, l’hydrogel a été réticulé pendant 30 s avec une intensité de 2,0 mW/cm2 à 400 nm. Pour évaluer les différences entre les mélanges, le PBS – en tant que diluant du GelMA et de l’alginate – a été préparé avec 1 mg/mL d’Orange G. Par conséquent, la différence d’absorbance entre les échantillons d’un mélange ainsi qu’entre les dilutions en série est identifiée à l’aide d’un spectrophotomètre. Les valeurs d’absorbance mesurées de chaque étape de concentration sont significativement différentes (p < 0,0001) et ont des valeurs CV très faibles comprises entre 1,2 % et 3,4 % tout au long des étapes de concentration (n = 12 par étape de concentration). La régression linéaire a démontré un ajustement élevé avec une valeur R² de 0,9869 (figure 4a-ii) et une carte thermique a confirmé la distribution homogène pour chaque concentration et la différence entre les concentrations (figure 4a-iii). Un mélange automatisé de quatre réactifs a été effectué pour la génération de GelMA à 5 % (p/v), d’alginate à 2 % (p/v), de LAP à 0,15 % (p/v) et de PBS comme diluant sans (configuration 2) et avec (configuration 3) embout tactile (n = 96 pour chaque configuration) avec les mêmes paramètres de réticulation (30 s, 2,0 mW/cm2, 400 nm). La distribution des quatre matériaux, le mélange et la distribution dans une plaque de 96 puits ont pris 32 min 22 s. Toutes les expériences avec GelMA et alginate ont été menées à 37 °C pour empêcher la gélification thermique qui empêche le pipetage de GelMA. Avec l’option tactile de la pointe, la valeur CV a été réduite de 5,2 % à 3,4 % et, surtout, les valeurs aberrantes dans la région inférieure ont été évitées en enlevant l’excès de matière de la pointe (Figure 4b-i). Bien que les valeurs moyennes de 1,927 et 1,944 pour la configuration 2 et la configuration 3 soient très proches, le coefficient de variation met en évidence l’écart décroissant par rapport à la moyenne. Les rangées individuelles de la plaque de 96 puits peuvent être comparées les unes aux autres à l’aide d’une visualisation de carte thermique pour détecter les différences de ligne et/ou de colonne (Figure 4b-ii).

Figure 1
Figure 1 : Flux de travail de protocole avec des tâches individuelles. Le flux de travail décrit est divisé en sept tâches, qui sont séparées en configuration, préparation, exécution et analyse. Au début, le logiciel (tâche 1) ainsi que le matériel (tâche 2) doivent être configurés. Après la préparation des matériaux (tâche 3) et la génération du script de protocole (tâche 4), le module de pipetage est étalonné en définissant les positions de la pipette et du conteneur (tâche 5). Ensuite, le script de protocole est exécuté sur le poste de travail (tâche 6) et la validation et la vérification (tâche 7) des mélanges sont effectuées pour évaluer les mélanges. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Station de travail open source et configuration du pont du module de pipetage. (a) Le poste de travail développé s’inspire d’une approche de chaîne de montage, où les échantillons sont transportés à travers différents modules, et se compose des modules suivants: pipetage, réticulation, stockage, transport et module de calcul. b) Le tablier du module de pipetage est aménagé en fonction de la disposition expérimentale (par exemple, type de plaque de puits, volume du tube, etc.). La configuration du pont affiché a été utilisée pour les expériences présentées et se compose de pipettes à déplacement positif avec une plage de 10−100 μL (M100E) et 100−1 000 μL (M1000E), les racks de pointe avec pistons capillaires (CP) pour 100 μL (CP1000) et 1 000 μL (CP1000), un conteneur à ordures, un plateau de mélange et un plateau d’entrée pour les réactifs d’entrée. c) Les positions de pont disponibles sont définies avec les numéros affichés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Résultats du pipetage automatisé des mélanges de glycérol. (a) La conception flexible du poste de travail permet d’évaluer trois configurations différentes (i) afin d’identifier les paramètres optimaux pour des résultats reproductibles. (ii) L’ajout d’un toucher de pointe et le chauffage du matériau ont entraîné une diminution des valeurs de coefficient de variance (CV) et des mélanges hautement reproductibles pour la configuration 3. Chaque expérience a été menée avec 96 échantillons. iii) Le traçage des valeurs d’un échantillon unique n’a montré aucune influence sur la séquence de pipetage. b) Les résultats expérimentaux de chaque installation ont été visualisés à l’aide de cartes thermiques afin d’identifier l’influence sur les différences brutes/colonnes, les arêtes ou le mélange maître. (c) La reproductibilité de la configuration 3 a été analysée en huit séries indépendantes en utilisant (i) la médiane, l’écart-type, la valeur CV et (ii) les cartes thermiques. Les données des panels a-ii (n = 96) et b-i (n = 12) sont présentées avec les moyennes et les points de données uniques. La signification statistique a été définie comme ****p < 0,0001 à l’aide d’une analyse bidirectionnelle de la variance (ANOVA). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Résultats pour les tâches de mélange avec des hydrogels. a) À partir d’une solution mère de gélatine métaacryloyle (GelMA) à 20 % (p/v), une dilution en série de 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 et 0 % (p/v) a été générée au cours d’un essai expérimental à l’aide d’une plaque de 96 puits (n = 12 par concentration). (i) Les valeurs du coefficient de variance (CV) variaient entre 1,2 % et 3,4 % dans l’ensemble des concentrations préparées, et (ii) la régression linéaire a montré un ajustement élevé avec une valeur R² de 0,9869. iii) Les dilutions homogènes ont été confirmées visuellement avec la carte thermique générée. b) Les hydrogels à double réseau ont été générés avec 5 % (p/v) de GelMA, 2 % (p/v) d’alginate et 0,15 % (p/v) LAP (i) avec et sans contact de pointe (n = 96 pour chaque installation) et réticulés pendant 30 s avec une intensité de 2,0 mW/cm2 à 400 nm. L’intégration du toucher de pointe a entraîné une diminution des valeurs CV de 5,2% à 3,4%. (ii,iii) Les cartes thermiques confirment moins d’écarts lors de l’utilisation du toucher de la pointe pour éliminer l’excès de matière de la pointe. Les données des panneaux a-i et b-i sont présentées avec les moyennes et les points de données uniques. La signification statistique a été définie comme *p < 0,05, ***p < 0,001 et ****p < 0,0001 à l’aide d’une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Résumé de la différence de type de pipette et des problèmes avec les biomatériaux visqueux. a) Le réactif et le piston sont séparés par un coussin d’air qui rétrécit pendant les étapes de distribution et se dilate pendant les étapes d’aspiration. Lors de l’aspiration et de la distribution de matériaux visqueux, le « flux » lent introduit des problèmes tels que des bulles d’air et un comportement de pipetage irrégulier. b) Les pipettes volumétriques permettent une aspiration et une distribution fiables du matériau visqueux par l’utilisation d’un piston à l’intérieur de la pointe. c) Le pipetage de matériaux très visqueux (par exemple, 4 % (p/v) d’alginate) peut entraîner l’accumulation d’un excès de matière sur la pointe, ce qui entraîne une imprécision tout au long des expériences. d) La mise en place d’un simple plateau tactile permet d’éliminer l’excès de matière sur la pointe et donne des volumes d’aspiration et de distribution précis. Ceci est réalisé en utilisant le côté intérieur du couvercle de la plaque de puits placé sur un conteneur de rack de pointe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Matériau #1 (concentration des stocks) Concentration finale du matériau #1 Matériau #2 (concentration des stocks) Concentration finale du matériau #2 Matériaux #3 (concentration des stocks) Concentration finale du matériau #3 Diluant (solution de travail Orange G) Concentration finale d’Orange G dans le mélange Affiché dans la figure
Glycérol (85 % (p/v)) 80 % (p/v) eau (1 mg/mL Orange G) 0,059 mg/mL Figure 3a−c
GelMA (20 % (p/v)) 0 % (p/v) LAP (3 % (p/v)) 0,15 % (p/v) PBS (1 mg/mL Orange G) 1 mg/mL Graphique 4a
GelMA (20 % (p/v)) 2 % (p/v) LAP (3 % (p/v)) 0,15 % (p/v) PBS (1 mg/mL Orange G) 0,85 mg/mL Graphique 4a
GelMA (20 % (p/v)) 4 % (p/v) LAP (3 % (p/v)) 0,15 % (p/v) PBS (1 mg/mL Orange G) 0,75 mg/mL Graphique 4a
GelMA (20 % (p/v)) 6 % (p/v) LAP (3 % (p/v)) 0,15 % (p/v) PBS (1 mg/mL Orange G) 0,65 mg/mL Graphique 4a
GelMA (20 % (p/v)) 8 % (p/v) LAP (3 % (p/v)) 0,15 % (p/v) PBS (1 mg/mL Orange G) 0,55 mg/mL Graphique 4a
GelMA (20 % (p/v)) 10 % (p/v) LAP (3 % (p/v)) 0,15 % (p/v) PBS (1 mg/mL Orange G) 0,45 mg/mL Graphique 4a
GelMA (20 % (p/v)) 12 % (p/v) LAP (3 % (p/v)) 0,15 % (p/v) PBS (1 mg/mL Orange G) 0,35 mg/mL Graphique 4a
GelMA (20 % (p/v)) 14 % (p/v) LAP (3 % (p/v)) 0,15 % (p/v) PBS (1 mg/mL Orange G) 0,25 mg/mL Graphique 4a
GelMA (20 % (p/v)) 5 % (p/v) Alginate (4 % (p/v)) 2 % (p/v) LAP (3 % (p/v)) 0,15 % (p/v) PBS (1 mg/mL Orange G) 0,2 mg/mL Graphique 4b

Tableau 1 : Aperçu des paramètres pour les expériences menées.

Étape du protocole Problème Raison possible Solution
1.1 Le logiciel ne peut pas être installé ou mis à jour Manque d’espace disque sur la carte SD Vérifiez l’espace disque sur la carte SD. Si nécessaire, retirez les éléments inutiles, videz le bac ou utilisez une carte SD de taille appropriée
1.2 L’API ne peut pas être installée La capacité d’installation des utilisateurs est limitée (pas d’autorisation d’utilisateur root) Utilisez la commande 'sudo' devant les commandes spécifiées pour obtenir des droits d’administrateur. Sous Linux, ce type d’accès est connu sous le nom de superutilisateur.
3.1 Problèmes avec GelMA Fonctionnalisation, dialyse ou lyophilisation Protocole détaillé étape par étape, y compris la liste de dépannage disponible dans Loessner et al.33.
5.1 et 6.2 Le poste de travail ne réagit pas aux commandes Problèmes de connexion Tournez tout et éteignez l’ordinateur. Coupez l’alimentation pendant 10 s. Rallumez l’ordinateur et la station de travail.
5.1 et 6.2 Le poste de travail ne réagit pas aux commandes Problèmes de connexion Vérifiez si l’ordinateur reconnaît la connexion USB et si le port USB est correctement défini. Assurez-vous que le pare-feu n’empêche pas le processus de connexion (voir le lien ci-dessous Tableau 2).
5.1 et 6.2 Impossible d’ouvrir le fichier Répertoire incorrect Vérifiez director (chemin d’accès au dossier) pour vous assurer que le bon chemin est utilisé. Si un fichier (par exemple, interface.py) est introuvable, il est probable que le mauvais chemin soit utilisé.
6.6.2 La pointe n’est pas correctement attachée ou tombe pendant le mouvement Problème d’étalonnage Répétez les étapes d’étalonnage de la pipette et assurez-vous que le piston capillaire est correctement connecté à la pipette.
6.6.2 La pointe n’est pas correctement attachée ou tombe pendant le mouvement Problème de pièce jointe La pipette n’est pas correctement connectée à l’axe de la pipette et se déplace pendant les étapes de mouvement. Serrez fermement les vis pour éviter cela.
6.6.2 La pointe aspire au-dessus du matériau Problème d’étalonnage Répétez l’étalonnage de ce type de plateau pour définir correctement la hauteur.
6.6.2 La pointe aspire au-dessus du matériau Problème d’étalonnage Vérifiez le volume dans le tube et assurez-vous que le volume est égal au volume défini dans l’application du concepteur de protocole.
6.6.2 Le matériau trempe pendant le mouvement Trop d’excès de matière sur la pointe Ajouter une option de station d’accueil tactile à pointe; en option, le temps de toucher la pointe peut également être augmenté.
6.6.2 Le matériau est solide ou trop visqueux pour le pipetage Comportement thermoréactif du matériau Vérifiez la caractérisation des matériaux thermosensibles et ajustez la température de chauffage / refroidissement de la station de température en conséquence.
https://support.opentrons.com/en/articles/2687601-c-having-trouble-connecting-try-this-basic-troubleshooting

Tableau 2 : Tableau de dépannage avec les problèmes identifiés, les raisons possibles ainsi que les solutions pour résoudre les problèmes.

Fichier supplémentaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le pipetage de matériaux visqueux, en particulier d’hydrogels pour des applications biomédicales19,20,21,33,47, sont des tâches de routine dans de nombreux laboratoires de recherche pour préparer une concentration définie par l’utilisateur ou une série de dilution avec des concentrations variables. Bien qu’elle soit répétitive et que l’exécution soit plutôt simple, elle est principalement effectuée manuellement avec un faible débit d’échantillon18. Ce tutoriel présente le fonctionnement d’un poste de travail open source, spécialement conçu pour les matériaux visqueux, afin de permettre le mélange automatisé de matériaux visqueux pour une génération reproductible des concentrations souhaitées. Ce poste de travail est optimisé pour le pipetage d’hydrogels afin de permettre une manipulation automatisée et hautement fiable grâce à l’intégration de quais de température pour les matériaux thermorésensibles, de pipettes à déplacement positif pour les matériaux visqueux et d’un quai tactile à pointe en option pour éliminer l’excès de matériau de la pointe. Le module de pipetage a été spécialement optimisé pour permettre le traitement des matériaux visqueux de manière standardisée et automatisée. Par rapport aux pipettes à coussin d’air (figure 5a), les pipettes à déplacement positif (figure 5b) distribuent des matériaux visqueux sans laisser de matière résiduelle dans la pointe, ce qui donne des volumes d’aspiration et de distribution précis. La station d’accueil tactile à embout en option élimine l’excès de matériau d’échantillon de la pointe (Figure 5c,d), ce qui est utile pour les matériaux collants (par exemple, 4 % (p/v) d’alginate).

L’application de concepteur de protocole a été spécialement programmée pour les hydrogels et permet la dilution de jusqu’à quatre réactifs avec des concentrations différentes et jusqu’à deux diluants. Le risque d’erreurs dans le calcul des dilutions finales est évité dans cette application, car les utilisateurs ne choisissent que la concentration souhaitée ou les étapes de dilution en série. Les volumes d’aspiration et de distribution requis sont calculés automatiquement, enregistrés dans un fichier texte de documentation distinct, puis remplis dans le script de protocole. Cette application de conception de protocole donne à l’utilisateur un contrôle total de tous les paramètres expérimentaux (par exemple, la vitesse de pipetage) et assure la documentation interne des paramètres importants. L’application de conception du protocole prend en compte le niveau de remplissage du réservoir (par exemple, le puits) et fait varier la hauteur d’aspiration / distribution pour éviter les trempettes inutiles dans les matériaux visqueux. Cette fonction intégrée évite l’accumulation de matériau sur la paroi extérieure de la pointe et, par conséquent, garantit des tâches d’aspiration et de distribution fiables tout au long du protocole. Bien que l’application de concepteur de protocole ait été développée pour les étapes de dilution de l’hydrogel, elle peut également être utilisée pour la dilution de liquides non visqueux, tels que les colorants Orange G. L’application de concepteur de protocole, qui est accessible via le référentiel sous '/examples/publication-JoVE', est la version qui est expliquée dans la section protocole et mise en évidence dans la vidéo. Cette version ne sera pas mise à jour. Toutefois, une version mise à jour de l’application de concepteur de protocole est disponible via la page principale du référentiel. Le terminal d’étalonnage a été initialement développé par Sanderson48 et a été optimisé pour l’étalonnage des pipettes à déplacement positif.

Comme décrit dans la section 4 du protocole, les pipettes ainsi que les contenants doivent être étalonnés au départ. Ce processus d’étalonnage est crucial pour définir et enregistrer les positions qui sont ensuite utilisées pour calculer les incréments de mouvement. Par conséquent, l’exécution réussie du protocole repose sur des positions d’étalonnage bien définies, car des points d’étalonnage incorrects pourraient entraîner un crash de la pointe dans un conteneur. Étant donné que les positions du piston des pipettes doivent être étalonnées manuellement, l’exactitude et la précision du pipetage dépendent grandement de l’étalonnage effectué. Ces procédures d’étalonnage dépendent fortement de l’expérience utilisateur avec le module de pipetage et, par conséquent, une formation avec du personnel expérimenté est recommandée au début pour assurer des procédures d’étalonnage appropriées. En plus de l’étalonnage manuel sur le module de pipetage, la pipette elle-même doit être étalonnée pour assurer un pipetage précis. Il est recommandé d’étalonner les pipettes au moins tous les 12 mois pour répondre aux critères d’acceptation spécifiés dans la norme ISO 8655. Pour évaluer l’étalonnage de la pipette en interne, la validation et la vérification sont disponibles comme décrit par Stangegaard et al.16.

Pour la génération d’un ensemble de données fiables, il est crucial de commencer avec des réactifs de haute qualité. Ceci est particulièrement important pour les tâches de traitement de l’hydrogel, car les variations de lot à lot peuvent avoir un impact sur les résultats générés dans ce protocole. En plus des variations d’un lot à l’autre, des changements subtils dans la préparation de petits volumes peuvent également contribuer aux différences de propriété. Pour éviter cela, la préparation de plus grands volumes est recommandée, qui peut être utilisée pour l’ensemble des expériences.

Les procédures de validation et de vérification reposent sur l’utilisation d’un colorant pour identifier des mélanges fiables. Le protocole présenté décrit l’application d’Orange G, mais le protocole général et le flux de travail d’analyse peuvent également être adaptés aux colorants fluorescents49,50. L’utilisation d’Orange G réduit les exigences techniques du spectrophotomètre et élimine les précautions prises pour empêcher le blanchiment des colorants fluorescents après exposition à la lumière. Des problèmes dans le comportement de dissolution ou la formation d’amas du colorant n’ont pas été observés avec les matériaux présentés au cours des expériences, mais peuvent apparaître avec d’autres matériaux. La formation potentielle d’amas et, par conséquent, l’interaction entre le colorant et le matériau pourraient être facilement détectées au microscope.

Les procédures et techniques présentées dans ce didacticiel ajoutent une capacité d’automatisation aux flux de travail actuels pour les matériaux visqueux afin de réaliser des tâches très fiables avec un minimum de travail humain. Le tableau de dépannage fourni (tableau 2) comprend les problèmes identifiés et présente les raisons possibles ainsi que les solutions pour résoudre les problèmes. Le poste de travail présenté a été appliqué avec succès aux matériaux polymères naturels (gélatine, gomme gellane, matrigel) et synthétiques (par exemple, poly(éthylène glycol) [PEG], Pluronic F127, Lutrol F127) pour les tâches de pipetage automatisées. En particulier, la combinaison d’un poste de travail open source et d’une application de conception de protocole open source conçue pour les matériaux visqueux sera très utile pour les chercheurs travaillant dans les domaines du génie biomédical, de la science des matériaux et de la microbiologie.

Disclosures

CM et DWH sont fondateurs et actionnaires de Gelomics Pty Ltd. CM est également le directeur de Gelomics Pty Ltd. Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts pertinent pour le sujet de cet article. Les auteurs n’ont aucune autre affiliation ou implication financière pertinente avec une organisation ou une entité ayant un intérêt financier ou un conflit financier avec le sujet ou les documents discutés dans l’article, à l’exception de ceux divulgués.

Acknowledgments

Les auteurs remercient les membres du Centre de médecine régénérative de QUT, en particulier Antonia Horst et Pawel Mieszczanek pour leurs suggestions et commentaires utiles. Ce travail a été soutenu par le Postgraduate Research Award for SE du QUT et par l’Australian Research Council (ARC) dans le cadre de la convention de subvention IC160100026 (ARC Industrial Transformation Training Centre in Additive Biomanufacturing). Le Nouveau-Brunswick a reçu une bourse de recherche en début de carrière Peter Doherty (APP1091734) du Conseil national de la santé et de recherches médicales (NHMRC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 reaction tubes Fisher Scientific, Inc. (USA) 14-959-53A
5 mL tubes Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia) SCT-5ML size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name
50 mL reaction tubes Fisher Scientific, Inc. (USA) 14-432-22
70% w/w Ethanol LabChem, Inc. (USA) aja726-5Lpl
96-well plate Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055
Alginate NovaMatrix 4200001 https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/
Demineralized or ultrapure (MilliQ) water
Gelatin methacryloyl (GelMA) Synthetized in-house detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Sigma-Aldrich, Inc. (USA) 900889
M4 and M5 Allen key OpenBuilds, inc. (USA) 179, 190 also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/
OrangeG Fisher Scientific (USA) O267-25 https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) 14190-144 alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific)
Equipment
Aluminium blocks for temperature dock Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia) SB16 blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html
Analytical balance Sartorius AG (Germany) ED224S
Open source liquid handling robot: commercial product Opentrons Laboratories, Inc. (USA) OT-One S Pro https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro
Open source liquid handling robot: open source hardware Assembled in-house following an open source approach hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24
Positive displacement pipette: MicromanE Gilson, Inc. (USA) FD10006 depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html
Spectrophotometer BMG LABTECH GmbH (Germany) CLARIOstar
Tips: capillary pistons Gilson, Inc. (USA) F148180 depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191

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Bioingénierie Numéro 181 automatisation reproductibilité open source hydrogel culture cellulaire 3D bioimpression biofabrication additive ingénierie tissulaire matériau visqueux pipette volumétrique méthacryloyle à la gélatine (GelMA)
Une plate-forme technologique open source pour fabriquer des modèles de culture 3D basés sur l’hydrogel de manière automatisée et standardisée
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Eggert, S., Kahl, M., Kent, R., Gaats, L., Bock, N., Meinert, C., Hutmacher, D. W. An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion. J. Vis. Exp. (181), e61261, doi:10.3791/61261 (2022).

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