Summary
Denne protokollen fungerer som en omfattende opplæring for standardisert og reproduserbar blanding av viskøse materialer med en ny åpen kildekode-automatiseringsteknologi. Detaljerte instruksjoner er gitt om driften av en nyutviklet åpen kildekode-arbeidsstasjon, bruk av en åpen kildekode-protokolldesigner og validering og verifisering for å identifisere reproduserbare blandinger.
Abstract
Nåværende blandingstrinn av viskøse materialer er avhengige av repeterende og tidkrevende oppgaver som hovedsakelig utføres manuelt i lav gjennomstrømningsmodus. Disse problemene representerer ulemper i arbeidsflyter som til slutt kan føre til uopprettelighet av forskningsfunn. Manuelle arbeidsflyter begrenser videre utviklingen og utbredt bruk av viskøse materialer, for eksempel hydrogeler som brukes til biomedisinske applikasjoner. Disse utfordringene kan løses ved å bruke automatiserte arbeidsflyter med standardiserte blandingsprosesser for å øke reproduserbarheten. I denne studien presenterer vi trinnvise instruksjoner for å bruke en åpen kildekode-protokolldesigner, for å drive en åpen kildekode-arbeidsstasjon og for å identifisere reproduserbare blandinger. Spesielt guider open source-protokolldesigneren brukeren gjennom det eksperimentelle parametervalget og genererer en bruksklar protokollkode for å betjene arbeidsstasjonen. Denne arbeidsstasjonen er optimalisert for pipettering av viskøse materialer for å muliggjøre automatisert og svært pålitelig håndtering ved integrering av temperaturdokker for termoresponsive materialer, positive forskyvningspipetter for viskøse materialer og en valgfri berøringsdokk for å fjerne overflødig materiale fra pipettespissen. Validering og verifisering av blandinger utføres ved en rask og billig absorbansmåling av Orange G. Denne protokollen presenterer resultater for å oppnå 80% (v / v) glyserolblandinger, en fortynningsserie for gelatinmetakryloyl (GelMA), og doble nettverkshydrgeler på 5% (w / v) GelMA og 2% (w / v) alginat. En feilsøkingsveiledning er inkludert for å støtte brukere med protokolladopsjon. Den beskrevne arbeidsflyten kan brukes bredt på en rekke viskøse materialer for å generere brukerdefinerte konsentrasjoner på en automatisert måte.
Introduction
Reproduserbarhet og replikerbarhet er av avgjørende betydning i vitenskapelig arbeid1,2,3,4. Nyere bevis har imidlertid fremhevet betydelige utfordringer med å gjenta biomedisinske studier med stor innvirkning i grunnleggende vitenskap samt translasjonell forskning4,5,6,7. Faktorer som bidrar til uopprettelige resultater er komplekse og mangfoldige, for eksempel dårlig eller partisk studiedesign6,8, utilstrekkelig statistisk kraft3,9, manglende overholdelse av rapporteringsstandarder7,10,11, press for å publisere6, eller utilgjengelige metoder eller programvarekode6,9 . Blant dem har subtile endringer i protokollen og menneskelige feil i utførelsen av eksperimenter blitt identifisert som ytterligere elementer som står for irreproducibility4. For eksempel introduserer manuelle pipetteringsoppgaver intra- og interpersonlig upresision12,13 og øker sannsynligheten for menneskelige feil14. Mens kommersielle væskehåndteringsroboter er i stand til å overvinne disse ulempene og har vist økt pålitelighet for væsker15,16,17, er automatisert håndtering av materialer med betydelige viskøse egenskaper fortsatt utfordrende.
Kommersielle væskehåndteringsroboter bruker vanligvis luftputepipetter, også kjent som luftstempel eller luftforskyvningspipetter. Reagenset og stempelet er skilt av en luftpute som krymper under dispenseringstrinn og utvides under aspirerende trinn. Ved hjelp av luftputepipetter strømmer viskøse materialer bare sakte inn og ut av spissen, og tidlig tilbaketrekking av pipetten fra reservoaret kan føre til aspirasjon av luftbobler. Under dispenseringsoppgaver etterlater det viskøse materialet en film på den indre spissveggen som "strømmer" bare sakte eller ikke i det hele tatt når det blir tvunget med luft. For å overvinne disse problemene ble positive forskyvningspipetter introdusert kommersielt for aktivt å ekstrudere det viskøse materialet ut av spissen ved hjelp av et solidt stempel. Selv om disse positive forskyvningspipettene muliggjør nøyaktig og pålitelig håndtering av viskøse materialer, er automatiserte løsninger med positive forskyvningspipetter fortsatt for dyre for akademiske laboratorieinnstillinger, og derfor er de fleste arbeidsflyter med viskøse materialer utelukkende avhengige av manuelle pipetteringsoppgaver18.
Generelt er viskositet definert som motstanden til en væske å strømme, og viskøse materialer defineres videre som materialer med større viskositet av vann (0,89 mPa·s ved 25 °C). Innen biomedisinske anvendelser inneholder eksperimentelle oppsett ofte flere materialer med større viskositet enn vann, for eksempel dimetylsulfoksid (DMSO; 1,99 mPa·s ved 25 °C), glyserol (208,1 mPa·s ved 25 °C ved 90 % glyserol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s ved 25 °C) og vannhovne polymerer, referert til som hydrogeler19, 20. Hydrogeler er hydrofile polymernettverk arrangert i en fysisk eller/og kjemisk modus som brukes til ulike bruksområder, inkludert celleinnkapsling, legemiddellevering og myke aktuatorer19,20,21,22. Viskositeten til hydrogeler avhenger av polymerkonsentrasjonen og molekylvekten19. Rutinemessig brukte hydrogeler for biomedisinske applikasjoner viser viskositetsverdier mellom 1 og 1000 mPa·s, mens spesifikke hydrogelsystemer er rapportert med verdier på opptil 6 x 107 mPa·s19,23,24. Viskositetsmålinger av hydrogeler er imidlertid ikke standardisert når det gjelder måleprotokoll og prøvepreparering, og derfor er viskositetsverdier mellom forskjellige studier vanskelig å sammenligne.
Siden kommersielt tilgjengelige automatiserte løsninger spesielt designet for hydrogeler enten mangler eller er for dyre, er gjeldende arbeidsflyter for hydrogel avhengig av manuell håndtering18. For å forstå begrensningene i den nåværende manuelle arbeidsflyten for pipettering av hydrogeler, er det viktig å forstå viktige håndteringsoppgaver18. For eksempel, når et nytt hydrogelmateriale er syntetisert, genereres en ønsket konsentrasjon eller en fortynningsserie med varierende konsentrasjoner for å identifisere pålitelige synteseprotokoller og krysskoblingsegenskaper med etterfølgende analyse av de mekaniske egenskapene25,26,27,28 . Generelt fremstilles eller kjøpes en lagerløsning, og deretter blandes med et fortynningsmiddel og / eller andre reagenser for å oppnå en blanding. Blandingsoppgavene utføres for det meste ikke direkte i en brønnplate (eller noe utdataformat), og utføres heller i et eget reaksjonsrør, som ofte kalles mesterblanding. Under disse forberedelsesoppgavene kreves det ulike aspirerende og dispenseringstrinn for å overføre viskøse materialer, blande reagensene og overføre blandingen til et utdataformat (f.eks. en 96 brønnplate). Disse oppgavene krever en høy mengde menneskelig arbeidskraft18, lange eksperimentelle timer, og øker sannsynligheten for menneskelige feil som potensielt kan manifestere seg som unøyaktige resultater. Videre forhindrer manuell håndtering effektiv forberedelse av høye prøvetall for å screene ulike parameterkombinasjoner for detaljert karakterisering. Den manuelle behandlingen hindrer også bruk av hydrogeler for screeningapplikasjoner med høy gjennomstrømning, for eksempel identifisering av lovende forbindelser under narkotikautvikling. De nåværende manuelle forberedelsestrinnene er ikke gjennomførbare for å screene narkotikabiblioteker som består av tusenvis av stoffer. Av disse grunnene kreves automatiserte løsninger for å gi en effektiv utviklingsprosess og muliggjøre vellykket oversettelse av hydrogeler for narkotikascreeningsapplikasjoner.
For å gå fra manuelle arbeidsflyter til automatiserte prosesser, har vi optimalisert en kommersiell pipetteringsrobot med åpen kildekode for håndtering av viskøse materialer ved integrering av temperaturdokker for termoresponserende materialer, bruk av positive forskyvningspipetter utenfor hyllen ved hjelp av kapillære stempelspisser og en valgfri berøringsdokk for pipettespissrengjøring. Denne pipetteringsroboten er videre integrert som en pipetteringsmodul i en nyutviklet åpen kildekode-arbeidsstasjon, som består av ferdige og tilpassbare moduler18,29. Detaljerte monteringsinstruksjoner for den utviklede arbeidsstasjonen, inkludert maskinvare- og programvarefiler, er fritt tilgjengelige fra GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) og Zenodo-repositoriet (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). I tillegg til maskinvareutviklingen er en åpen kildekode-protokolldesignapplikasjon programmert og utgitt for å veilede brukeren gjennom parametervalgprosessen og generere en bruksklar protokollkode (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp). Denne koden kjører på den kommersielle open source pipetteringsroboten så vel som på den utviklede open source-arbeidsstasjonen.
Heri er det gitt en omfattende veiledning om driften av open source-arbeidsstasjonen for å automatisere blandingsoppgaver for viskøse materialer (figur 1). De opplæringsspesifikke protokolltrinnene kan utføres med den utviklede åpen kildekode-arbeidsstasjonen samt den kommersielle pipetteringsroboten med åpen kildekode. Støttet av en egenutviklet åpen kildekode protokoll design applikasjon, automatisert blanding og forberedelse av nødvendige konsentrasjoner for glyserol, gelatin methacryloyl (GelMA) og alginat er demonstrert. Glyserol har blitt valgt i denne opplæringen, siden den er godt karakterisert30,31, er den billig og lett tilgjengelig, og derfor brukes den ofte som viskøst referansemateriale for automatiserte pipetteringsoppgaver. Som eksempler på hydrogeler som brukes i biomedisinske anvendelser, er GelMA og alginathydrgelforløperløsninger brukt til automatiserte blandeforsøk. GelMA presenterer en av de mest brukte hydrogelene for celleinnkapslingsstudier32,33, og alginat ble valgt i denne studien for å demonstrere evnen til å produsere doble nettverkshydrgeler34,35. Ved hjelp av Orange G som fargestoff ble det implementert en rask og billig prosedyre for å validere og verifisere blandingsresultatene med et spektrofotometer16.
En kommersiell pipetteringsrobot med åpen kildekode er integrert som en pipetteringsmodul i den utviklede åpen kildekode-arbeidsstasjonen (figur 2a), og derfor brukes navnet 'pipetteringsmodul' videre til å beskrive pipetteringsroboten. En detaljert beskrivelse av den installerte maskinvaren er utenfor omfanget av denne protokollen og er tilgjengelig via de medfølgende repositoriene som også inkluderer trinnvise instruksjoner for den generelle monteringen av open source-plattformen. Pipetteringsmodulen kan utstyres med to pipetter (en- eller 8-kanals pipette) som er installert på akse A (høyre) og akse B (venstre) (figur 2b). Pipetteringsmodulen tilbyr en kapasitet på 10 dekk i henhold til american National Standards Institute/Society for Laboratory Automation and Screening (ANSI/SLAS) standarder, og følgende posisjonsposisjoner er definert på dekk: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (figur 2c). For å initiere fotoindusert polymerisering av hydrogelløsninger, er det nødvendig med en egen krysskoblingsmodul og er lagt til arbeidsstasjonen. Crosslinker-modulen er utstyrt med lysdioder med en bølgelengde på 400 nm, og derfor kan stoffer som begeistrer ved en synlig lysbølgelengde brukes med dagens systemer, for eksempel litiumfenyl-2,4,6 trimethylbenzoylfosponat (LAP)36,37. Intensiteten (i mW/cm2) av lysdiodene kan adresseres av brukeren i protokolldesignprogrammet for å studere krysskoblingsatferden38. Arbeidsstasjonen inneholder også en lagringsmodul for å muliggjøre økt gjennomstrømningsstudier; Denne modulen brukes imidlertid ikke i denne studien og er derfor ikke nærmere beskrevet. Generelt anbefales det å bruke pipetteringsmodulen i et biologisk sikkerhetsskap for å unngå prøveforurensning. Hovedstrømkretsen for å betjene pipetteringsmodulen er en 12 V-krets, som regnes som en lavspenningsapplikasjon i de fleste land. Alle elektriske komponenter er basert i en dedikert kontrollboks som hindrer brukere i å komme i kontakt med kilden til en elektrisk fare.
Ved å følge disse standardiserte blandeprotokollene kan forskere oppnå pålitelige blandinger for viskøse så vel som ikke-viskøse materialer på en automatisert måte. Åpen kildekode-tilnærmingen lar brukerne optimalisere blandingssekvenser og dele nyutviklede protokoller med samfunnet. Til syvende og sist vil denne tilnærmingen lette screeningen av flere parameterkombinasjoner for å undersøke gjensidig avhengighet mellom ulike faktorer og dermed akselerere pålitelig anvendelse og utvikling av viskøse materialer for biomedisinske applikasjoner.
Protocol
MERK: Protokollen starter med en introduksjon til (1) programvaren og (2) maskinvareoppsettet for å gjøre brukeren kjent med nødvendige installasjoner og arbeidsstasjonen. Etter et avsnitt om (3) materialforberedelse og (4) bruken av protokolldesignerapplikasjonen, (5) kalibreringen av pipetteringsmodulen og (6) utførelsen av den automatiserte protokollen er uthevet i detalj. Til slutt beskrives (7) validerings- og verifiseringsprosedyrer, inkludert absorbansavlesning og dataanalyse. En generell protokollarbeidsflyt med individuelle oppgaver vises i figur 1.
1. Programvareoppsett
MERK: Denne delen inneholder en detaljert instruksjon for å installere applikasjonsprogrammeringsgrensesnittet (API) samt det nødvendige protokolldesignerprogrammet og kalibreringsterminalen. Følgende instruksjoner er skrevet for en Raspberry Pi (RPi) enkeltkort datamaskin; Men også Windows 8, 10 og macOS 10.13+ har blitt brukt med API og applikasjonene.
- Konfigurer datamaskinmiljøet.
MERK: Vær kjent med det grunnleggende om Python39, hvordan du setter opp og bruker en Raspberry Pi40,41, og hvordan du kobler til internett42. Følgende opplæringstrinn fokuserer på protokollspesifikke trinn, og tilleggsinformasjon om bruken av en Raspberry Pi er tilgjengelig online40.- Åpne et terminalvindu fra oppgavelinjen eller programmenyen.
- Oppdater systemets pakkeliste:
sudo apt-get-oppdatering - Oppgrader alle installerte pakker:
sudo apt-get dist-oppgradering - Start Raspberry Pi på nytt:
sudo omstart - Kontroller installert Python-versjon:
python3 --versjon
Kontroller at minst Python 3.5 er installert. Hvis ikke, installerer du den nyeste versjonen43. - Installer python pip, som publiserer Python-pakker med Python Package Index44:
sudo apt-get installere python3-pip - Installer avhengigheter:
pip installere numpy
pip installere python-resize-image
MERK: Hvis du bruker Windows, må du installere Windows-curses-pakken via: python -m pip installere windows-forbannelser
- Installer API (Application Programming Interface).
MERK: API-en gir et enkelt Python-rammeverk designet for å skrive eksperimentelle protokoller skript og betjene arbeidsstasjonen. Følgende to APIer kreves for å kunne kjøre den genererte protokollkoden.- Installer API for arbeidsstasjon:
pip installere openworkstation - Installer Opentrons API for å betjene pipetteringsmodulen:
pip installere opentrons==2.5.2 - Kontroller om API er installert:
python3
>>> importerer openworkstation
>>> importerer opentrons
MERK: Størrelsen på API-en og protokolldesignprogrammet er henholdsvis 2,2 MB og 1,2 MB. Det oppstod ingen problemer under installasjonen når den ble brukt med begrenset diskplass (200 MB). Kravene til diskplass avhenger imidlertid av operativsystemet.
- Installer API for arbeidsstasjon:
- Velg en katalog for filnedlasting (kalibreringsterminal, protokolldesignprogram osv.).
MERK: Filer kan kopieres og limes inn et annet sted etterpå. - Klone filer fra GitHub repository:
git klone https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation
MERK: Kommandoen 'git clone' kloner og lagrer deretter alle filene i katalogen, som er åpne i terminalen på dette tidspunktet. Siden repositoriet også inneholder maskinvarefilene for samlingen, kreves ikke hele repositoriet for å kjøre de presenterte protokollene. Alle nødvendige filer for å replikere eksperimentene er tilgjengelige som Supplemental File og i GitHub-repositoriet under "/examples/publication-JoVE". - Åpne den nedlastede mappen. Hvis hele repositoriet ble lastet ned, navigerer du til mappen publication-JoVE via
cd openworkstation/examples/publication-JoVE
MERK: Denne mappen inneholder filer som kreves for driften av arbeidsstasjonen og bruken av protokolldesignerprogrammet og kalibreringsterminalen.
2. Maskinvareoppsett
- Plasser arbeidsstasjonen i et biologisk sikkerhetsskap for å unngå prøvekontaminering.
- Installer pipetter på arbeidsstasjonen.
- Velg pipettestørrelsen basert på det eksperimentelle oppsettet. Generelt, ta en pipettestørrelse hvilket volum som skal aspireres er på den høyere enden av området. Hvis det kreves blandingsoppgaver med volumer som er større enn 1 ml for et bestemt oppsett (f.eks. aspirerende/dispenserende 2 ml), velger du M1000E med et maksimalt aspirerende/dispenserende volum på 1000 μL for å minimere pipetteringstrinn og spare tid.
MERK: En detaljert instruksjon for luftforskyvningspipetter er tilgjengelig online45. Den utviklede pipetteringsmodulen er i stand til å integrere følgende positive forskyvningspipetter utenfor hyllen: M10E (1–10 μL), M25E (3–25 μL), M50E (20–50 μL), M100E (10–100 μL), M250E (50–250 μL), M1000E (100–1000 μL). - Bruk en M4-unbrakonøkkel til å løsne og stramme skruer.
- Fest de to pipettefikseringsplatene (hvite akrylplater) til aluminiumsskinnen og stram M5-skruene løst.
- Sett pipetten inn i de to pipettefesteplatene og sørg for at pipettens ergonomiske hale hviler på motsatt side av akrylmonteringsplaten.
- Stram de fire skruene på de to pipettefesteplatene godt.
- Skyv de to firkantede festemutterne, som er festet til akrylmonteringsplaten, inn i ekstruderingssporet på z-aksen og stram skruene.
MERK: Fest pipetten godt for å unngå bevegelse under bruk.
- Velg pipettestørrelsen basert på det eksperimentelle oppsettet. Generelt, ta en pipettestørrelse hvilket volum som skal aspireres er på den høyere enden av området. Hvis det kreves blandingsoppgaver med volumer som er større enn 1 ml for et bestemt oppsett (f.eks. aspirerende/dispenserende 2 ml), velger du M1000E med et maksimalt aspirerende/dispenserende volum på 1000 μL for å minimere pipetteringstrinn og spare tid.
3. Materialforberedelse
MERK: De viskøse materialene (glyserol, GelMA, alginat) brukes til forsøkene som presenteres i denne studien, og derfor er forberedte volumer og håndteringsoppgaver (f.eks. tilsett 5 ml lagerløsning i 5 ml reaksjonsrør) spesielt for dette eksperimentelle oppsettet.
- Gelatin methacryloyl (GelMA)
MERK: GelMA-funksjonalisering, dialyse og lyofilisering er ikke omfanget av dette papiret, og en trinnvis protokoll er tilgjengelig i Loessner et al.33. Protokollen begynner å bruke lyofilisert GelMA, som kan tilberedes internt eller kjøpes kommersielt.- Beregn nødvendig masse GelMA (mGelMA) basert på ønsket endelig lagerkonsentrasjon (cGelMA) og volum (VGelMA) ved hjelp av ligningen:
mGelMA = cGelMA x VGelMA
MERK: VGelMA avhenger av det eksperimentelle oppsettet, og det anbefales å tilberede 20-30% overflødig materiale. De presenterte protokollene starter med 5 ml 20 % (w/v) GelMA som lagerløsning. - Vei den nødvendige mengden lyofilisert GelMA, legg den til et 50 ml reaksjonsrør og tilsett den nødvendige mengden fosfatbufret saltvann (PBS).
- Bland GelMA enten ved å suge inn i oppløsningsvæsken ved 4 °C over natten eller ved oppvarming til 60 °C i 6 timer i et vannbad.
MERK: Sterile GelMA-løsninger kan oppbevares beskyttet mot lys ved 4 °C i minst seks måneder. - Fyll 5 ml GelMA i 5 ml reaksjonsrør.
- Beregn nødvendig masse GelMA (mGelMA) basert på ønsket endelig lagerkonsentrasjon (cGelMA) og volum (VGelMA) ved hjelp av ligningen:
- Fotoinitiator: Litiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosphinat (LAP)
MERK: Unngå ekstra eksponering for romlys, siden LAP er lysfølsom.- Beregn nødvendig masse LAP (mLAP) basert på ønsket endelig lagerkonsentrasjon (cLAP) og nødvendig volum (VLAP) ved hjelp av ligningen:
mLAP = cLAP x VLAP
MERK: Det anbefales å tilberede en lagerløsning på 3 % (w/v). - Vei den nødvendige mengden LAP, legg den til et 15 ml reaksjonsrør og legg til PBS.
- Vikle røret i aluminiumsfolie for å forhindre fotoindusert nedbrytning.
- Løs opp LAP ved å plassere reaksjonsrøret i et vannbad ved 37 °C i 2 timer eller til det er helt oppløst.
- Fyll 1 ml LAP-lagerløsning i 5 ml rør.
- Beregn nødvendig masse LAP (mLAP) basert på ønsket endelig lagerkonsentrasjon (cLAP) og nødvendig volum (VLAP) ved hjelp av ligningen:
- Alginat
- Beregn nødvendig mengde alginat (malginat) basert på ønsket sluttlagerkonsentrasjon (calginat) og volum (Valginate) ved hjelp av ligningen:
malginat = calginate x Valginate
MERK: Valginate avhenger av det eksperimentelle oppsettet, og det anbefales å tilberede 20-30% overflødig materiale. De presenterte protokollene starter med 5 ml 4 % (w/v) alginat som lagerløsning. - Vei den nødvendige massen av alginat, legg den til i en 50 ml reaksjonsrør, og legg til PBS.
- Plasser alginatblandingen i et vannbad ved 37 °C i 4 timer.
MERK: Bruken av en virvelblander vil akselerere oppløsningsprosessen, men også generere luftbobler. Oppløst alginat kan oppbevares ved 4 °C i minst seks måneder. - Fyll 5 ml alginat i 5 ml reaksjonsrør.
- Beregn nødvendig mengde alginat (malginat) basert på ønsket sluttlagerkonsentrasjon (calginat) og volum (Valginate) ved hjelp av ligningen:
- Fyll 5 ml glyserol i 5 ml reaksjonsrør.
- Oransje G-løsning
- Forbered en 10 mg/ml lagerløsning av Appelsin G i et 50 ml reaksjonsrør.
MERK: Volumet avhenger av antall eksperimenter. Avhengig av fortynningstype, lag lagerløsning enten i ultrarent vann, PBS eller et egnet fortynningsreagens. I de presenterte forsøkene ble ultrapure vann brukt til fortynning av glyserol og PBS for fortynning av GelMA og alginat. PBS ble brukt som fortynningsmiddel for GelMA og alginat, og kan enten tilberedes ved hjelp av tabletter eller kjøpes utenfor hyllen. - Bland i 10 s ved virveling.
- Vikle røret i aluminiumsfolie for å forhindre fotoindusert nedbrytning.
MERK: Lagerløsningen kan brukes etter 24 timer for å sikre riktig oppløsning av Orange G. - Fortynn lagerløsningen til en 1 mg/ml arbeidsløsning i et 50 ml reaksjonsrør.
- Overfør arbeidsløsningen til passende kolber/rør for det eksperimentelle oppsettet.
MERK: For de presenterte eksperimentene ble arbeidsløsningen fylt i 5 ml rør. Orange G lager og arbeidsløsning kan lagres ved 4 °C og brukes innen tre måneder etter tilberedning. - Fyll 5 ml av 1 mg/ml oransje G arbeidsløsning i 5 ml reaksjonsrør.
- Forbered en 10 mg/ml lagerløsning av Appelsin G i et 50 ml reaksjonsrør.
4. Generer protokollkode med protokolldesignerprogrammet
MERK: De angitte parametrene i trinn 4.2-4.7 er de samme for alle utførte eksperimenter, bortsett fra materialets lagerkonsentrasjon og den endelige utgangskonsentrasjonen. Disse parametrene er oppsummert i tabell 1 , og i det følgende brukes parametere til å forberede doble nettverkshydrgeler med 5% (w / v) GelMA, 2% (w / v) alginat, 0,15% (w / v) LAP og PBS som fortynningsmiddel.
- Åpne protokollutformingsprogrammet ved å kjøre ProtocolDesignApp.html.
MERK: Appen "ProtocolDesignApp.html" veileder brukeren gjennom parametervalgprosessen og genererer automatisk den bruksklare protokollen for å betjene arbeidsstasjonen. Brukergrensesnittet kjører på alle vanlige nettlesere (dvs. Chrome, Firefox, Safari, edge, Internet Explorer). - Skriv inn protokollnavn (f.eks. dobbeltnettverkshydrgeler) på oppsettsiden.
- Klikk Fortsett for å bekrefte protokollnavnet og gå videre til neste trinn.
- Definer inngangsskuff ved å velge '3x4 Varmeblokk' fra rullegardinmenyen og følgende inngangsparametere:
- Velg 'Gel 1' fra rullegardinmenyen, skriv inn navnet 'GelMA', skriv inn lagerkonsentrasjon '20%', sett 'Antall prøver' til '3' for å fylle en kolonne. Klikk på '+legg til' for å lagre oppføringer.
- Velg 'Gel 2' fra rullegardinmenyen, skriv inn navn: 'Alginate', skriv inn lagerkonsentrasjon '4%', sett 'Antall prøver' til '3' for å fylle en kolonne. Klikk på '+legg til' for å lagre oppføringer.
- Velg 'Photoinitiator' fra rullegardinmenyen, skriv inn navn: 'LAP', skriv inn lagerkonsentrasjon '3%', sett 'Antall prøver' til '3' for å fylle en kolonne. Klikk på '+legg til' for å lagre oppføringer.
- Velg 'Fortynningsmiddel 1' fra rullegardinmenyen, skriv inn navn: 'PBS', sett 'Antall prøver' til '3' for å fylle en kolonne. Klikk på '+legg til' for å lagre oppføringer.
MERK: Visualiseringen av innskuffen oppdateres automatisk når du klikker på '+add'. Hvis det legges til flere innganger enn skuffkapasiteten, vises advarselen "For mange prøver for denne skuffen" for brukeren.
- Definer krysskoblingsparametere ved å sjekke 'Photo crosslinking' og skrive inn tiden i sekunder, '30' og intensiteten W / m2 med '2'.
- Fullfør inndataoppsettet ved å klikke FORTSETT.
- Definer oppsett av utskuff ved å velge '96 brønnplate' i rullegardinmenyen for brønnplatetype.
- Klikk på 'Group1' for å definere utganger ved å opprette en gruppe prøver.
- Angi utgangssammensetning ved å angi ønskede konsentrasjoner og prøvevolum i feltene for hver inngang: GelMA = '5', Alginate = '2', LAP = '0,15', Totalt volum = '60'.
- Avmerkingsboks for å bruke avansert blandeprotokoll.
- Angi antall eksempler ved å skrive inn antall eksempler i feltet Antall eksempler: 96.
MERK: Visualiseringen av prøveskuffen oppdateres automatisk når du klikker på '+legg til gruppe'. Hvis det legges til flere prøver enn skuffkapasiteten, vises advarselen "For mange prøver for denne skuffen" for brukeren. - Fullfør utdataoppsettet ved å klikke FORTSETT.
- Velg skuffposisjon på dekkoppsettet og forbered plattformen tilsvarende:
- Merk av i feltet 'SLOT A1' og velg 'Empty_Cell' fra rullegardinmenyen.
- Merk av i feltet 'SLOT A2' og velg 'Trash_Cell' fra rullegardinmenyen.
- Merk av i feltet 'SPOR B1' og velg 'Tips_Cell_100 μL' fra rullegardinmenyen.
- Merk av i feltet 'SPOR B2' og velg 'Tips_Cell_1000 μL' fra rullegardinmenyen.
- Merk av i feltet 'SPOR C1' og velg 'Input_Cell' fra rullegardinmenyen.
- Merk av i feltet 'SLOT C2' og velg 'Empty_Cell' fra rullegardinmenyen.
- Merk av i feltet 'SLOT D1' og velg 'Mixing_Cell' fra rullegardinmenyen.
- Merk av i feltet 'SLOT D2' og velg 'Output_Cell' fra rullegardinmenyen.
- Definer type og egenskaper for første pipette (M100E) ved å sjekke 'Pipette Left', velge '10-100μL positiv forskyvning' fra rullegardinmenyen og stille inn aspirerende hastighet = '600', dispenseringshastighet = '800'.
- Definer type og egenskaper for andre pipette (M1000E) ved å sjekke 'Pipette Right', velge '100-1000μL positiv forskyvning' fra rullegardinmenyen og stille inn aspirerende hastighet = '800', dispenseringshastighet = '1200'.
- Klikk på 'GENERER PROTOKOLL' for å bekrefte oppsettet og generere protokollskriptet.
MERK: Den utviklede protokolldesignerappen genererer automatisk en ny mappe når en ny protokoll genereres. Alle filer som kreves for dette eksperimentet og for å betjene arbeidsstasjonen, lagres i denne mappen som er oppkalt etter protokollnavnet. Mappen kan kopieres til forskjellige mapper uten å forårsake problemer. - Ikke lukk grensesnittet, da det vil bli brukt til å utføre protokollen (se trinn 6.6.).
5. Kalibrering av pipetteringsmodulen
MERK: Beholdere (f.eks. brønnplater, spissstativ, søppel) og pipetter (f.eks. M1000E) må kalibreres i utgangspunktet. Hvis en beholder og/eller en pipetteposisjon endres/endres, må den nye posisjonen kalibreres.
- Naviger til protokollmappen og åpne kalibreringsterminalen ved å utføre filen "calibrate.py" i en terminal windox (se trinn 1.1.1):
phython.calibrate.py
MERK: Grensesnittet "calibrate.py" veileder brukeren gjennom kalibreringen av dekkoppsettet og pipettene. Kontroller at filen er i samme mappe som protokollfilen og modulfilene. Den genereres automatisk i trinn 4.10. - Velg bevegelsesintervaller for stempel, y,z-bevegelse med det numeriske tastaturet (1−8): '1' for 0,1 mm, '2' for 0,5 mm, '3' for 1 mm, '4' for 5 mm, '5' for 10, '6' for 20 mm, '7' for 40 mm og '8' for 8 mm.
- Kalibrer pipetten.
- Trykk hurtigtasten P for å velge pipettestørrelse.
- Trykk hurtigtast V for å gå inn i stempelkalibreringsmodus.
MERK: Det anbefales å starte med små trinn (2, 5 og 10 mm) for å bli kjent med pipettehodets økelsesstørrelse og bevegelseshandling. - Kalibrer følgende stempelposisjoner for en positiv forskyvningspipette: T–Top = hvileposisjon; B–Bunn = stempel skyves til motstanden er oppfylt; P-Pick-up = stempelet skyves til en posisjon der en stempelspiss kan festes; E–Eject = stempelet skyves til en festet spiss kastes ut. Varier stempelposisjonene ved hjelp av piler oppover og nedover på tastaturet, og lagre den endelige posisjonen ved hjelp av S på tastaturet.
- Forlat pipettestempemiddelkalibreringsmodusen ved å trykke på hurtigtasten V.
- Kalibrer beholderposisjon i forhold til pipettespissen.
- Trykk hurtigtasten P for å velge pipettetype. Kontroller at et tips er koblet til den valgte pipetten.
- Trykk hurtigtast C for å velge beholdertype.
- Velg et passende bevegelsesintervall, og flytt pipettespissen til følgende posisjoner. For brønnplater, kalibrer til 'A1' brønnposisjon nederst; For spissstativ kalibrerer du til A1-posisjonen. For søppel velger du en posisjon (definert som et punkt) der spissen kan kastes ut i papirkurven.
- Trykk hurtigtasten S for å lagre posisjonen.
- Gjenta trinn 5.3.1−5.3.3 for alle beholdere som er oppført under C for den valgte pipettetypen.
- Gjenta 5.3.1−5.3.5 for den andre pipettetypen.
- Lukk kalibreringsskriptet.
6. Protokollkjøring med arbeidsstasjonen
MERK: Protokollfiler er tilgjengelige via repositoriet og er også tilgjengelige som tilleggsfil.
- Plasser papirkurven, spissstativene, innskuffen, blandebrettet og utdataene på aggregatet (definert i trinn 4.3).
- Kalibrer pipetter og instrumenter som definert i avsnitt 5.
- Slå om nødvendig på temperaturdokken og velg temperaturen for inngang og blandebrett.
MERK: Forsøkene i denne opplæringen ble utført uten temperaturkontroll og ved 40 °C for glyserol, og 37 °C for GelMA og alginatpipettering. - Plasser rør med inngangsreagenser i aluminiumsblokkene på temperaturdokkene i henhold til det valgte oppsettet.
- Vent til inngangsreagensene har nådd ønsket temperatur.
MERK: For å sikre riktig temperaturfordeling anbefales en inkubasjonstid på 30 min for GelMA og alginat. - Utfør protokollfilen ved å klikke på 'RUN PYTHON SCRIPT'
MERK: Den valgte protokollen utføres nå av arbeidsstasjonen. Den medfølgende videoen fremhever automatisert blanding av GelMA og fordelingen av 60 μL i en 96 brønnplate. - Kjøringen er fullført når Ferdig vises.
7. Validerings- og verifiseringsprosess
- Fjern brønnplaten fra arbeidsstasjonen og transporter brønnplaten med prøvene til et spektrofotometer.
- Les absorbans med spektrofotometer ved 450 nm. Les hver plate 2x for å sammenligne resultater og sikre konsistente resultater.
- Eksporter og lagre absorbansavlesninger.
- Dataanalyse.
MERK: Eksperimentelle data kan behandles individuelt eller kopieres og limes inn i den medfølgende malen for å evaluere gjennomsnittlig, standardavvik og cv-verdi (coefficient of variance) ved hjelp av regnearkprogramvare.- Åpne Supplemental File 'supplementary_template-analysis.xlsx", som også er tilgjengelig i GitHub-repositoriet under 'openworkstation /examples/publication-JoVE.
- Kopier absorberingsavlesninger til rådataarket, sørg for at alle cellereferanser er riktig definert i alle tabeller, og klikk på analysearket for informasjon om gjennomsnittet, standardavviket og koeffisienten for variansverdier (CV).
MERK: Avhengig av prøvefordelingen på en brønnplate, er følgende forhåndsinnstilte evalueringstyper tilgjengelige med malen: "Uniform" -typen brukes når alle prøver har samme sammensetning, "Etter rader" -typen brukes når prøver i forskjellige rader har forskjellige komposisjoner, "Etter kolonner" -typen brukes når prøver i forskjellige kolonner har forskjellige komposisjoner, og tilpasset-typen brukes når prøveposisjonene er brukerspesifikke.
Representative Results
Denne opplæringen presenterer resultater for eksperimenter med glyserol (figur 3) og GelMA med LAP og alginat (figur 4).
Genereringen av en 80 % (v/v) glyserolløsning ble undersøkt enten uten temperaturkontroll (romtemperatur, 22 °C) og uten tuppberøring (definert som oppsett 1), med temperaturkontroll (40 °C) og uten tuppberøring (oppsett 2), eller med temperaturkontroll (40 °C) og med tuppberøring (oppsett 3) (figur 3a-i). Disse to temperaturinnstillingene ble valgt for å evaluere håndteringsforskjellen, siden glyserolens viskositet avtar nesten med en faktor på 3 ved oppvarming fra 22 °C (139,5 mPa·s) til 40 °C (46,6 mPa·s)30. En 85% (v / v) lagerløsning av glyserol ble fortynnet til en endelig konsentrasjon på 80% og jevnt fordelt på en 96 brønnplate (n = 96 per oppsett). Den eksperimentelle tiden, som inkluderer dispensering av hvert materiale i blandingsrøret, de respektive blandingsoppgavene og prøvefordelingen til en 96 brønnplate, var 30 min 42 s. For å identifisere forskjeller mellom fortynningsblandinger ble ultrarent vann – som fortynningsmiddel for glyserol – tilberedt med 1 mg/ml oransje G. Absorbansavlesningene fremhever at integreringen av temperaturkontrollen og spissberøringen påvirker blandingene betydelig (p < 0,0001). I tillegg til den utførte toveis variansanalysen (ANOVA) ble CV-verdiene beregnet for å evaluere det relative standardavviket. Variasjonskoeffisienten beskriver en standardisert indikator for å identifisere graden av avvik i forhold til gjennomsnittet og uttrykkes i prosent. Hvis utvalgsmidlene ikke er spesielt interessepunktet, men variasjonen i målingene, gir variasjonskoeffisienten ytterligere innsikt for å identifisere reproduserbare blandinger46. Innenfor dette eksperimentet med tre forskjellige oppsett viste absorbansverdiene synkende CV-verdier fra henholdsvis 5,6 %, 4,2 % til 2,0 % for oppsett 1, oppsett 2 og oppsett 3, noe som viser den betydelige påvirkningen av temperaturdokken og berøringsfunksjonen for spissen på å produsere pålitelige resultater (figur 3a-ii). Plotting av prøveabsorberingsverdier for oppsett 3 (prøvenummer #1 til #96 i en 96 brønnplate) gir ingen økende eller synkende verdier gjennom hele eksperimentet, og indikerer derfor ingen påvirkning av prøveposisjonen på absorbansverdiene (figur 3a-iii). Visualisering av dataene for hver målte brønnplate med varmekart gir ytterligere innsikt for å identifisere heterogeniteter for en bestemt rad eller kolonne, eller varierende absorberingsverdier gjennom dispenseringsoppgavene. De visualiserte varmekartene for de tre oppsettene viser reduserte heterogeniteter på tvers av hele brønnplatene fra oppsett 1 til oppsett 3 (figur 3b). Til slutt ble replikerbarheten av den utførte blandingen evaluert innen åtte uavhengige løp (figur 3c-i,ii), hvor hvert løp tok 6 min 57 s. Enkeltblandingskjøringer viste lave CV-verdier mellom 1,1 % og 2,6 %, noe som indikerer svært pålitelige blandings- og dispenseringsoppgaver for de enkelte kjøringene. Absorbansverdier for alle åtte kjøringene ga en CV-verdi på 3,3 % og demonstrerte reproduserbarheten til den etablerte blandeprotokollen.
GelMA-fortynningsserien ble utarbeidet ved å fortynne en 20% (w / v) lagerløsning med PBS til 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 og 0% (w / v) og legge LAP til en konstant konsentrasjon på 0,15% (w / v) (figur 4a-i), som tok totalt 55 min 12 s. Som spesifisert i det eksperimentelle protokollskriptet, var hydrogelen krysskobling i 30 s med en intensitet på 2,0 mW/cm2 ved 400 nm. For å evaluere forskjellene mellom blandingene, PBS ―som fortynningsmiddel for GelMA og alginat―ble tilberedt med 1 mg / ml Orange G. Derfor er absorbansforskjell mellom prøver i en blanding så vel som mellom serielle fortynninger identifisert med et spektrofotometer. Målte absorbansverdier for hvert konsentrasjonstrinn er signifikant forskjellige (p < 0,0001) og har svært lave CV-verdier mellom 1,2% og 3,4% gjennom konsentrasjonstrinnene (n = 12 per konsentrasjonstrinn). Lineær regresjon viste høy passform med en R²-verdi på 0,9869 (figur 4a-ii) og et varmekart bekreftet den homogene fordelingen for hver konsentrasjon og forskjellen mellom konsentrasjonene (figur 4a-iii). Automatisert blanding av fire reagenser ble utført for generering av 5% (w/v) GelMA, 2 % (w/v) alginat, 0,15 % (w/v) LAP og PBS som fortynningsmiddel uten (oppsett 2) og med (oppsett 3) berøringstips (n = 96 for hvert oppsett) med de samme krysskoblingsparametrene (30 s, 2,0 mW/cm2, 400 nm). Utlevering av de fire materialene, blanding og distribusjon i en 96 brønnplate tok 32 min 22 s. Alle eksperimenter med GelMA og alginat ble utført ved 37 °C for å forhindre termisk gelling som forhindrer pipettering av GelMA. Med berøringsalternativet ble CV-verdien redusert fra 5,2% til 3,4%, og spesielt ble outliers i nedre region forhindret ved å fjerne overflødig materiale fra spissen (figur 4b-i). Selv om gjennomsnittsverdien på 1,927 og 1,944 for oppsett 2 og oppsett 3 er svært nær, fremhever variasjonskoeffisienten det synkende avviket i forhold til gjennomsnittet. Enkeltrader på 96 brønnplaten kan sammenlignes med hverandre ved hjelp av en varmekartvisualisering for å oppdage rad- og/eller kolonneforskjeller (figur 4b-ii).
Figur 1: Protokollarbeidsflyt med individuelle oppgaver. Den beskrevne arbeidsflyten er delt inn i sju oppgaver, som er delt inn i oppsett, klargjøring, utførelse og analyse. I begynnelsen må programvaren (oppgave 1) og maskinvaren (oppgave 2) være konfigurert. Etter utarbeidelsen av materialene (oppgave 3) og genereringen av protokollskriptet (oppgave 4), kalibreres pipetteringsmodulen ved å definere pipette- og beholderposisjonene (oppgave 5). Deretter utføres protokollskriptet på arbeidsstasjonen (oppgave 6) og validering og verifisering (oppgave 7) av blandinger utføres for å evaluere blandinger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Arbeidsstasjon med åpen kildekode og dekkoppsett av pipetteringsmodulen. (a) Den utviklede arbeidsstasjonen er inspirert av en samlebåndstilnærming, der prøver transporteres gjennom forskjellige moduler, og består av følgende moduler: pipettering, krysskobling, lagring, transport og beregningsmodul. (b) Dekk til pipetteringsmodulen er satt opp avhengig av eksperimentell layout (f.eks. brønnplatetype, rørvolum, etc.). Det viste dekkoppsettet ble brukt til de presenterte eksperimentene og består av positive forskyvningspipetter med et område fra 10-100 μL (M100E) og 100−1000 μL (M 1000E), spissstativene med kapillære stempler (CP) for 100 μL (CP1000) og 1000 μL (CP1000), en søppelbeholder, en blandebrett, og en inngangsskuff for inngangsreagensene. (c) Tilgjengelige dekkposisjoner defineres med tallene som vises. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Resultater for automatisert pipettering av glyserolblandinger. (a) Den fleksible arbeidsstasjonsutformingen gjør det mulig å evaluere tre forskjellige oppsett (i) for å identifisere optimale parametere for reproduserbare resultater. (ii) Tilsetning av en tupp berøring og oppvarming av materialet resulterte i en redusert varianskoeffisient (CV) verdier og svært reproduserbare blandinger for oppsett 3. Hvert eksperiment ble utført med 96 prøver. (iii) Plotting av enkeltprøveverdier viste ingen påvirkning på pipetteringssekvensen. (b) Eksperimentelle resultater fra hvert oppsett ble visualisert med varmekart for å identifisere påvirkningen på rå/kolonneforskjeller, kanter eller hovedblanding. (c) Reproduserbarheten til oppsett 3 ble analysert innen åtte uavhengige kjøringer ved hjelp av (i) median, standardavvik, CV-verdi og (ii) varmekart. Data i panelene a-ii (n = 96) og b-i (n = 12) presenteres med midler og enkeltdatapunkt. Statistisk signifikans ble definert som ****p < 0,0001 ved hjelp av toveis variansanalyse (ANOVA). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Resultater for blanding av oppgaver med hydrogeler. (a) Fra en gelatin metacryloyl (GelMA) 20% (w / v) lagerløsning, ble en seriell fortynning av 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 og 0% (w / v) generert innen ett eksperimentelt løp ved hjelp av en 96 brønnplate (n = 12 per konsentrasjon). (i) Varianskoeffisienten (CV) varierte mellom 1,2 % og 3,4 % gjennom de tilberedte konsentrasjonene, og (ii) lineær regresjon viste en høy passform med en R²-verdi på 0,9869. (iii) Homogene fortynninger ble bekreftet visuelt med det genererte varmekartet. (b) Doble nettverkshydrgeler ble generert med 5 % (w/v) GelMA, 2 % (w/v) alginat og 0,15 % (w/v) LAP (i) med og uten tuppberøring (n = 96 for hvert oppsett) og krysskoblet i 30 s med en intensitet på 2,0 mW/cm2 ved 400 nm. Integreringen av tipsberøringen resulterte i reduserte CV-verdier fra 5,2 % til 3,4 %. (ii,iii) Varmekart bekrefter færre avvik ved bruk av tuppberøring for å fjerne overflødig materiale fra spissen. Data i paneler a-i og b-i presenteres med midler og enkeltdatapunkter. Statistisk signifikans ble definert som *p < 0,05, ***p < 0,001 og ****p < 0,0001 ved hjelp av enveisvariasjonsanalyse (ANOVA). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Oppsummering av pipettetypeforskjellen og problemer med viskøse biomaterialer. (a) Reagenset og stempelet er adskilt av en luftpute som krymper under dispenseringstrinn og utvides under aspirerende trinn. Når du aspirerer og dispenserer viskøse materialer, introduserer den langsomme "strømmen" problemer som luftbobler og uregelmessig pipetteringsadferd. (b) Positive forskyvningspipetter muliggjør pålitelig aspirering og dispensering av viskøst materiale ved bruk av et stempel inne i spissen. (c) Pipettering av svært viskøse materialer (f.eks. 4% (w/v) alginat) kan resultere i opphopning av overflødig materiale på spissen, noe som fører til unøyaktighet gjennom forsøkene. (d) Implementeringen av en enkel berøringsskuff gjør det mulig å fjerne overflødig materiale på spissen og resulterer i nøyaktige aspirerende og dispenserende volumer. Dette realiseres ved å bruke innsiden av brønnplatelokket plassert på en spissstativbeholder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Materiale #1 (lagerkonsentrasjon) | Endelig konsentrasjon av materiale #1 | Materiale #2 (lagerkonsentrasjon) | Endelig konsentrasjon av materiale #2 | Materialer #3 (lagerkonsentrasjon) | Endelig konsentrasjon av materiale #3 | Fortynningsmiddel (Orange G arbeidsløsning) | Endelig Orange G-konsentrasjon i blanding | Vist i figur |
| Glyserol (85 % (m/v)) | 80 % (m/v) | vann (1 mg/ml oransje G) | 0,059 mg/ml | Figur 3a-c | ||||
| GelMA (20 % (uten v)) | 0 % (m/v) | RUNDE (3 % (m/v)) | 0,15 % (med/v) | PBS (1 mg/ml oransje G) | 1 mg/ml | Figur 4a | ||
| GelMA (20 % (uten v)) | 2 % (m/v) | RUNDE (3 % (m/v)) | 0,15 % (med/v) | PBS (1 mg/ml oransje G) | 0,85 mg/ml | Figur 4a | ||
| GelMA (20 % (uten v)) | 4 % (m/v) | RUNDE (3 % (m/v)) | 0,15 % (med/v) | PBS (1 mg/ml oransje G) | 0,75 mg/ml | Figur 4a | ||
| GelMA (20 % (uten v)) | 6 % (med/v) | RUNDE (3 % (m/v)) | 0,15 % (med/v) | PBS (1 mg/ml oransje G) | 0,65 mg/ml | Figur 4a | ||
| GelMA (20 % (uten v)) | 8 % (m/v) | RUNDE (3 % (m/v)) | 0,15 % (med/v) | PBS (1 mg/ml oransje G) | 0,55 mg/ml | Figur 4a | ||
| GelMA (20 % (uten v)) | 10 % (med/v) | RUNDE (3 % (m/v)) | 0,15 % (med/v) | PBS (1 mg/ml oransje G) | 0,45 mg/ml | Figur 4a | ||
| GelMA (20 % (uten v)) | 12 % (m/v) | RUNDE (3 % (m/v)) | 0,15 % (med/v) | PBS (1 mg/ml oransje G) | 0,35 mg/ml | Figur 4a | ||
| GelMA (20 % (uten v)) | 14 % (med/v) | RUNDE (3 % (m/v)) | 0,15 % (med/v) | PBS (1 mg/ml oransje G) | 0,25 mg/ml | Figur 4a | ||
| GelMA (20 % (uten v)) | 5 % (m/v) | Alginat (4 % (m/v)) | 2 % (m/v) | RUNDE (3 % (m/v)) | 0,15 % (med/v) | PBS (1 mg/ml oransje G) | 0,2 mg/ml | Figur 4b |
Tabell 1: Parameteroversikt for de utførte forsøkene.
| Protokolltrinn | Problem | Mulig årsak | Løsning |
| 1.1 | Programvaren kan ikke installeres eller oppdateres | Går tom for diskplass på SD-kort | Kontroller diskplassen på SD-kortet. Fjern om nødvendig unødvendige varer, tøm papirkurven eller bruk et SD-kort med riktig størrelse |
| 1.2 | API kan ikke installeres | Brukeres mulighet for installasjon er begrenset (ingen rotbrukertillatelse) | Bruk sudo-kommandoen foran angitte kommandoer for å få administratorrettigheter. I Linux er denne typen tilgang kjent som superbrukeren. |
| 3.1 | Problemer med GelMA | Funksjonalisering, dialyse eller lyofilisering | Detaljert trinnvis protokoll, inkludert feilsøkingsliste tilgjengelig i Loessner et al.33. |
| 5.1 og 6.2 | Arbeidsstasjonen reagerer ikke på kommandoer | Problemer med tilkobling | Slå av alt og slå av datamaskinen. Slå av strømforsyningen i 10 s. Slå på strømdatamaskinen og arbeidsstasjonen igjen. |
| 5.1 og 6.2 | Arbeidsstasjonen reagerer ikke på kommandoer | Problemer med tilkobling | Kontroller om datamaskinen gjenkjenner USB-tilkoblingen og USB-porten er riktig definert. Kontroller at brannmuren ikke hindrer tilkoblingsprosessen (se koblingen under tabell 2). |
| 5.1 og 6.2 | Kan ikke åpne filen | Feil katalog | Kontroller mappedirektøren (mappebanen) for å sikre at riktig bane brukes. Hvis en fil (f.eks. interface.py) ikke blir funnet, er det sannsynlig at feil bane brukes. |
| 6.6.2 | Spissen er ikke ordentlig festet eller faller under bevegelse | Kalibreringsproblem | Gjenta kalibreringstrinnene for pipetten, og kontroller at kapillærstempelet er riktig koblet til pipetten. |
| 6.6.2 | Spissen er ikke ordentlig festet eller faller under bevegelse | Problem med vedlegg | Pipette er ikke riktig koblet til pipetteaksen og beveger seg under bevegelsestrinnene. Stram skruene godt for å unngå dette. |
| 6.6.2 | Tipset aspirerer over materiale | Kalibreringsproblem | Gjenta kalibreringen av denne skufftypen for å definere høyden riktig. |
| 6.6.2 | Tipset aspirerer over materiale | Kalibreringsproblem | Kontroller volumet i røret, og kontroller at volumet er lik volumet som er definert i protokollutformingsprogrammet. |
| 6.6.2 | Materialet dypper under bevegelse | For mye overflødig materiale på spissen | Legg til alternativet for berøringsdokk med tupp. Eventuelt kan også tiden for tuppberøring økes. |
| 6.6.2 | Materialet er fast eller for viskøst for pipettering | Termoresponsiv oppførsel av materiale | Kontroller karakterisering av termoresponsivt materiale og juster oppvarmings-/kjøletemperaturen til temperaturdokken tilsvarende. |
| https://support.opentrons.com/en/articles/2687601-c-having-trouble-connecting-try-this-basic-troubleshooting | |||
Tabell 2: Feilsøkingstabell med identifiserte problemer, mulige årsaker samt løsninger for å løse problemene.
Tilleggsfil. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Pipettering av viskøse materialer, spesielt hydrogeler for biomedisinske anvendelser19,20,21,33,47, er rutinemessige oppgaver i mange forskningslaboratorier for å forberede en brukerdefinert konsentrasjon eller en fortynningsserie med varierende konsentrasjoner. Selv om det er repeterende og utførelsen er ganske enkel, utføres den for det meste manuelt med lav prøvegjennomstrømning18. Denne opplæringen introduserer driften av en åpen kildekode-arbeidsstasjon, som er spesielt designet for viskøse materialer, for å muliggjøre automatisert blanding av viskøse materialer for reproduserbar generering av ønskede konsentrasjoner. Denne arbeidsstasjonen er optimalisert for pipettering av hydrogeler for å muliggjøre automatisert og svært pålitelig håndtering ved integrering av temperaturdokker for termoresponsive materialer, positive forskyvningspipetter for viskøse materialer og en valgfri berøringsdokk for å fjerne overflødig materiale fra spissen. Pipetteringsmodulen er spesielt optimalisert for å muliggjøre behandling av viskøst materiale på en standardisert og automatisert måte. Sammenlignet med luftputepipetter (figur 5a) dispenserer positive forskyvningspipetter (figur 5b) viskøse materialer uten å etterlate restmateriale igjen i spissen, noe som resulterer i nøyaktige aspirerende og dispenserende volumer. Den valgfrie berøringsdokken fjerner overflødig prøvemateriale fra spissen (figur 5c,d), som er nyttig for limmaterialer (f.eks. 4 % (w/v) alginat).
Protokolldesignerapplikasjonen er spesielt programmert for hydrogeler og tillater fortynning av opptil fire reagenser med forskjellige konsentrasjoner og opptil to fortynningsstoffer. Risikoen for feil i beregningen av endelige fortynninger forhindres i dette programmet, da brukerne bare velger ønsket konsentrasjon eller de serielle fortynningstrinnene. Nødvendige aspirerende og dispenserende volumer beregnes automatisk, lagres i en egen dokumentasjonstekstfil og fylles deretter ut i protokollskriptet. Denne protokolldesignapplikasjonen gir brukeren full kontroll over alle eksperimentelle parametere (f.eks. pipetteringshastighet) og sikrer intern dokumentasjon av de viktige parametrene. Protokolldesignappen tar hensyn til reservoarets fyllingsnivå (f.eks. godt) og varierer den aspirerende/ dispenserende høyden for å forhindre unødvendig dypping i de viskøse materialene. Denne integrerte funksjonen unngår materialakkumulering på spissens yttervegg, og sikrer dermed pålitelige aspirerende og dispenserende oppgaver gjennom hele protokollen. Selv om protokolldesignerapplikasjonen er utviklet for hydrogelfortynningstrinn, kan den også brukes til fortynning av ikke-utilcous væsker, for eksempel Orange G-fargestoffer. Protokolldesignerprogrammet, som er tilgjengelig via repositoriet under '/examples/publication-JoVE', er versjonen som er forklart i protokolldelen og uthevet i videoen. Denne versjonen vil ikke bli oppdatert. En oppdatert versjon av protokolldesignerprogrammet er imidlertid tilgjengelig via hovedrepositoriet. Kalibreringsterminalen ble opprinnelig utviklet av Sanderson48 og er optimalisert for kalibrering av positive forskyvningspipetter.
Som beskrevet i protokollen avsnitt 4, må pipetter og beholdere kalibreres i utgangspunktet. Denne kalibreringsprosessen er avgjørende for å definere og lagre posisjonene som deretter brukes til å beregne bevegelsesintervallene. Derfor er vellykket protokollutførelse avhengig av veldefinerte kalibreringsposisjoner, da feil kalibreringspunkter kan føre til krasj av spissen i en beholder. Siden pipettenes stempelposisjoner må kalibreres manuelt, avhenger pipetteringsnøyaktigheten og presisjonen sterkt av den utførte kalibreringen. Disse kalibreringsprosedyrene avhenger sterkt av brukeropplevelsen med pipetteringsmodulen, og derfor anbefales opplæring med erfarne ansatte i begynnelsen for å sikre riktige kalibreringsprosedyrer. I tillegg til den manuelle kalibreringen på pipetteringsmodulen, må pipetten selv kalibreres for å sikre nøyaktig pipettering. Det anbefales å kalibrere pipettene minst hver 12. For å evaluere pipettekalibrering internt er validering og verifisering tilgjengelig som beskrevet av Stangegaard et al.16.
For generering av et pålitelig datasett er det avgjørende å starte med reagenser av høy kvalitet. Dette er spesielt viktig for hydrogelbehandlingsoppgaver, da satsvise variasjoner kan påvirke de genererte resultatene i denne protokollen. I tillegg til batch-til-batch-variasjoner kan små endringer i utarbeidelsen av små volumer også bidra til egenskapsforskjeller. For å forhindre dette anbefales forberedelse av større volumer, som kan brukes til hele forsøkene.
Validerings- og verifiseringsprosedyrene er avhengige av bruk av fargestoff for å identifisere pålitelige blandinger. Den presenterte protokollen beskriver anvendelsen av Orange G, men den generelle protokollen og analysearbeidsflyten kan også tilpasses fluorescerende fargestoffer49,50. Bruken av Orange G reduserer de tekniske kravene til spektrofotometeret og eliminerer forholdsregler som tas for å forhindre bleking av fluorescerende fargestoffer etter eksponering for lys. Problemer i oppløsningsadferd eller klyngedannelse av fargestoffet har ikke blitt observert med de presenterte materialene under eksperimenter, men kan vises med andre materialer. Potensiell klyngedannelse og derfor kan samspillet mellom fargestoff og materiale lett oppdages med et mikroskop.
Prosedyrene og teknikkene som presenteres i denne opplæringen, legger til automatiseringsevne i gjeldende arbeidsflyter for viskøse materialer for å oppnå svært pålitelige oppgaver med minimal menneskelig arbeidskraft. Feilsøkingstabellen (tabell 2) inneholder identifiserte problemer og presenterer mulige årsaker i tillegg til løsninger for å løse problemene. Den presenterte arbeidsstasjonen har blitt brukt på naturlig (gelatin, gellan tyggegummi, matrigel) og syntetisk (f.eks. poly(etylenglykol) [PEG], Pluronic F127, Lutrol F127) polymere materialer for automatiserte pipetteringsoppgaver. Spesielt vil kombinasjonen av en åpen kildekode-arbeidsstasjon og en åpen kildekode-protokolldesignapplikasjon designet for viskøse materialer være svært nyttig for forskere som arbeider innen biomedisinsk ingeniørfag, materialvitenskap og mikrobiologi.
Disclosures
CM og DWH er grunnleggere og aksjonærer i Gelomics Pty Ltd. CM er også direktør for Gelomics Pty Ltd. Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt som er relevant for emnet i denne artikkelen. Forfatterne har ingen andre relevante tilknytninger eller økonomisk involvering med noen organisasjon eller enhet med økonomisk interesse i eller økonomisk konflikt med emnet eller materialet som er diskutert i artikkelen bortsett fra de som er avslørt.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner medlemmene av senteret for regenerativ medisin ved QUT, spesielt Antonia Horst og Pawel Mieszczanek for deres nyttige forslag og tilbakemeldinger. Dette arbeidet ble støttet av QUTs Postgraduate Research Award for SE, og av Australian Research Council (ARC) under tilskuddsavtale IC160100026 (ARC Industrial Transformation Training Centre in Additive Biomanufacturing). NB ble støttet av National Health and Medical Research Council (NHMRC) Peter Doherty Early Career Research Fellowship (APP1091734).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 reaction tubes | Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14-959-53A | |
| 5 mL tubes | Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia) | SCT-5ML | size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name |
| 50 mL reaction tubes | Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14-432-22 | |
| 70% w/w Ethanol | LabChem, Inc. (USA) | aja726-5Lpl | |
| 96-well plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055 | |
| Alginate | NovaMatrix | 4200001 | https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/ |
| Demineralized or ultrapure (MilliQ) water | |||
| Gelatin methacryloyl (GelMA) | Synthetized in-house | detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich, Inc. (USA) | 900889 | |
| M4 and M5 Allen key | OpenBuilds, inc. (USA) | 179, 190 | also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/ |
| OrangeG | Fisher Scientific (USA) | O267-25 | https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14190-144 | alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific) |
| Equipment | |||
| Aluminium blocks for temperature dock | Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia) | SB16 | blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html |
| Analytical balance | Sartorius AG (Germany) | ED224S | |
| Open source liquid handling robot: commercial product | Opentrons Laboratories, Inc. (USA) | OT-One S Pro | https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro |
| Open source liquid handling robot: open source hardware | Assembled in-house following an open source approach | hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24 | |
| Positive displacement pipette: MicromanE | Gilson, Inc. (USA) | FD10006 | depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html |
| Spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH (Germany) | CLARIOstar | |
| Tips: capillary pistons | Gilson, Inc. (USA) | F148180 | depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191 |
References
- Jarvis, M. F., Williams, M. Irreproducibility in Preclinical Biomedical Research: Perceptions, Uncertainties, and Knowledge Gaps. Trends in Pharmacological Sciences. 37 (4), 290-302 (2016).
- Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505 (7485), 612-613 (2014).
- Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The economics of reproducibility in preclinical research. PLoS Biology. 13 (6), 1-9 (2015).
- Niepel, M., et al. A Multi-center Study on the Reproducibility of Drug-Response Assays in Mammalian Cell Lines. Cell Systems. 9 (1), 35-48 (2019).
- Prinz, F., Schlange, T., Asadullah, K. Believe it or not: how much can we rely on published data on potential drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (9), 712 (2011).
- Baker, M. 1,500 scientists lift the lid on reproducibility. Nature. 533 (7604), 452-454 (2016).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).
- Sena, E. S., van der Worp, H. B., Bath, P. M. W., Howells, D. W., Macleod, M. R. Publication Bias in Reports of Animal Stroke Studies Leads to Major Overstatement of Efficacy. PLoS Biology. 8 (3), 1000344 (2010).
- Ioannidis, J. P. A., Kim, B. Y. S., Trounson, A. How to design preclinical studies in nanomedicine and cell therapy to maximize the prospects of clinical translation. Nature Biomedical Engineering. 2 (11), 797-809 (2018).
- Enserink, M. Sloppy reporting on animal studies proves hard to change. Science. 357 (6358), 1337-1338 (2017).
- Freedman, L. P., Inglese, J. The Increasing Urgency for Standards in Basic Biologic Research. Cancer Research. 74 (15), 4024-4029 (2014).
- Lippi, G., Lima-Oliveira, G., Brocco, G., Bassi, A., Salvagno, G. L. Estimating the intra- and inter-individual imprecision of manual pipetting. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 55 (7), 962-966 (2017).
- Hentz, N. G., Knaide, T. R. Effect of Liquid-Handling Accuracy on Assay Performance. Journal of Laboratory Automation. 19 (2), 153-162 (2014).
- Reason, J. Understanding adverse events: human factors. Quality and Safety in Health Care. 4 (2), 80-89 (1995).
- Schober, L., et al. Cell Dispensing in Low-Volume Range with the Immediate Drop-on-Demand Technology (I-DOT). Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 154-163 (2015).
- Stangegaard, M., Hansen, A. J., Frøslev, T. G., Morling, N. A Simple Method for Validation and Verification of Pipettes Mounted on Automated Liquid Handlers. Journal of Laboratory Automation. 16 (5), 381-386 (2011).
- Crombie, D. E., et al. Development of a Modular Automated System for Maintenance and Differentiation of Adherent Human Pluripotent Stem Cells. SLAS Discovery. 22 (8), 1016-1025 (2017).
- Eggert, S., Hutmacher, D. W. In vitro disease models 4.0 via automation and high-throughput processing. Biofabrication. 11 (4), 043002 (2019).
- Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Advanced Materials. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Zhang, Y. S., Khademhosseini, A.
- Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 1-11 (2014).
- Gao, G., Huang, Y., Schilling, A. F., Hubbell, K., Cui, X. Organ Bioprinting: Are We There Yet. Advanced Healthcare Materials. 7 (1), 1701018 (2018).
- Schuurman, W., et al. Gelatin-Methacrylamide Hydrogels as Potential Biomaterials for Fabrication of Tissue-Engineered Cartilage Constructs. Macromolecular Bioscience. 13 (5), 551-561 (2013).
- Lim, K. S., et al. New Visible-Light Photoinitiating System for Improved Print Fidelity in Gelatin-Based Bioinks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1752-1762 (2016).
- Müller, M., et al. Development and thorough characterization of the processing steps of an ink for 3D printing for bone tissue engineering. Materials Science and Engineering C. 108, 110510 (2020).
- Sewald, L., et al. Beyond the Modification Degree: Impact of Raw Material on Physicochemical Properties of Gelatin Type A and Type B Methacryloyls. Macromolecular Bioscience. 18 (12), 1-10 (2018).
- Eggert, S., Mieszczanek, P., Meinert, C., Hutmacher, D. W. A modular open source technology for automated in vitro workflows. Zenodo. , (2020).
- Volk, A., Kähler, C. J. Density model for aqueous glycerol solutions. Experiments in Fluids. 59 (5), 75 (2018).
- Zhang, H., Grinstaff, M. W. Recent Advances in Glycerol Polymers: Chemistry and Biomedical Applications. Macromolecular Rapid Communications. 35 (22), 1906-1924 (2014).
- Klotz, B. J., Gawlitta, D., Rosenberg, A. J. W. P., Malda, J., Melchels, F. P. W. Gelatin-Methacryloyl Hydrogels: Towards Biofabrication-Based Tissue Repair. Trends in Biotechnology. 34 (5), 394-407 (2016).
- Loessner, D., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Ansari, S., et al. Regulation of the fate of dental-derived mesenchymal stem cells using engineered alginate-GelMA hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2957-2967 (2017).
- Axpe, E., Oyen, M. Applications of Alginate-Based Bioinks in 3D Bioprinting. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 1976 (2016).
- Ma, X., et al. 3D printed micro-scale force gauge arrays to improve human cardiac tissue maturation and enable high throughput drug testing. Acta Biomaterialia. 95, 319-327 (2019).
- Bas, O., et al. Rational design and fabrication of multiphasic soft network composites for tissue engineering articular cartilage: A numerical model-based approach. Chemical Engineering Journal. 340, 15-23 (2018).
- O'Connell, C. D., et al. Tailoring the mechanical properties of gelatin methacryloyl hydrogels through manipulation of the photocrosslinking conditions. Soft Matter. 14 (11), 2142-2151 (2018).
- LearnPython.org. , Available from: https://www.learnpython.org (2020).
- Raspberry Pi Foundation: Using your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-using (2020).
- Raspberry Pi Foundation: Setting up your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-setting-up/4 (2020).
- Raspberry Pi Foundation: Connect your Raspberry Pi. , Available from: https://projects.raspberrypi.org/en/projects/raspberry-pi-setting-up/3 (2020).
- Python Software Foundation: python.org. , Available from: https://www.pthon.org (2020).
- Python Software Foundation: pypi.org. , Available from: https://pypi.org (2020).
- Opentrons Labworks, Inc: Installing pipettes. , Available from: https://support.opentrons.com/en/articles/689945-installing-pipettes (2020).
- Kang, C. W., Lee, M. S., Seong, Y. J., Hawkins, D. M. A Control Chart for the Coefficient of Variation. Journal of Quality Technology. 39 (2), 151-158 (2007).
- Annabi, N., et al. 25th Anniversary Article: Rational Design and Applications of Hydrogels in Regenerative Medicine. Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).
- Theo Sanderson: OpenTronsTerminalCalibration. , Available from: https://github.com/theosanderson/OpentronsTerminalCalibration (2020).
- Rhode, H., et al. An Improved Method for Checking HTS/uHTS Liquid-Handling Systems. Journal of Biomolecular Screening. 9 (8), 726-733 (2004).
- Taylor, P. B., et al. A Standard Operating Procedure for Assessing Liquid Handler Performance in High-Throughput Screening. Journal of Biomolecular Screening. 7 (6), 554-569 (2002).
