Intraveneuze injectie van kankercellen wordt vaak gebruikt in metastaseonderzoek, maar de gemetastaseerde tumorbelasting kan moeilijk te analyseren zijn. Hierin demonstreren we een staartaderinjectiemodel van metastase en nemen we een nieuwe benadering op om de resulterende gemetastaseerde longtumorbelasting te analyseren.
Metastase, de primaire oorzaak van morbiditeit en mortaliteit voor de meeste kankerpatiënten, kan een uitdaging zijn om preklinisch te modelleren bij muizen. Er zijn weinig spontane uitzaaimodellen beschikbaar. Het experimentele metastasemodel met staartaderinjectie van geschikte cellijnen is dus een steunpilaar van metastaseonderzoek. Wanneer kankercellen in de laterale staartader worden geïnjecteerd, is de long hun voorkeursplaats van kolonisatie. Een mogelijke beperking van deze techniek is de nauwkeurige kwantificering van de gemetastaseerde longtumorbelasting. Terwijl sommige onderzoekers macrometastasen van een vooraf gedefinieerde grootte tellen en / of micrometastasen omvatten na sectie van weefsel, bepalen anderen het gebied van gemetastaseerde laesies ten opzichte van het normale weefselgebied. Beide kwantificeringsmethoden kunnen buitengewoon moeilijk zijn wanneer de metastatische belasting hoog is. Hierin demonstreren we een intraveneus injectiemodel van longmetastase gevolgd door een geavanceerde methode voor het kwantificeren van gemetastaseerde tumorbelasting met behulp van beeldanalysesoftware. Dit proces maakt het mogelijk om meerdere eindpuntparameters te onderzoeken, waaronder de gemiddelde metastasegrootte, het totale aantal metastasen en het totale metastasegebied, om een uitgebreide analyse te bieden. Bovendien is deze methode beoordeeld door een veterinaire patholoog-board-gecertificeerd door het American College of Veterinary Pathologists (SEK) om nauwkeurigheid te garanderen.
Ondanks het feit dat het een zeer complex en inefficiënt proces1 is, levert metastase een belangrijke bijdrage aan de morbiditeit en mortaliteit van kankerpatiënten2. In feite worden de meeste kankergerelateerde sterfgevallen toegeschreven aan gemetastaseerde verspreiding van ziekte3,4. Om tumorcellen met succes te laten metastaseren, moeten ze zich losmaken van de primaire plaats, binnendringen door aangrenzend stroma, intravaseren in de bloedcirculatie of lymfevaten, reizen naar het capillaire bed van een secundaire plaats, extravaseren in het secundaire weefsel en prolifereren of groeien om metastatische laesies te vormen5. Het gebruik van muismodellen is van cruciaal belang geweest voor het bevorderen van het begrip van de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor gemetastaseerd zaaien en groei6,7. Hierin richten we ons op borstkankermetastase, waarvoor zowel genetisch gemodificeerde muismodellen als transplantatiemethoden vaak worden gebruikt – elk met hun eigen reeks voordelen en beperkingen.
Genetisch gemanipuleerde borsttumormodellen maken gebruik van borstklierspecifieke promotors, waaronder MMTV-LTR (muismamatumorvirus long terminal repeat) en WAP (Whey Acidic Protein), om de expressie van transgenen in het borstepitheel8 te stimuleren. Oncogenen waaronder polyoma midden T-antigeen (PyMT), ErbB2 / Neu, c-Myc, Wnt-1 en simian virus 40 (SV40) zijn op deze manier tot expressie gebracht9,10,11,12,13, en hoewel deze genetische modellen nuttig zijn voor het bestuderen van primaire tumorinitiatie en -progressie, zijn er maar weinig gemakkelijk uitgezaaid naar verre organen. Bovendien zijn deze genetische muismodellen vaak duurder dan spontane of experimentele metastasemodellen. Gezien de beperking van de meeste genetisch gemanipuleerde borsttumormodellen om metastase te bestuderen, zijn transplantatietechnieken aantrekkelijke methoden geworden om dit complexe proces te bestuderen. Dit omvat orthotopische, staartader-, intracardiale en intracraniale injectie van geschikte cellijnen.
Hoewel verschillende borstkankercellijnen gemakkelijk uitzaaien na orthotopische injectie in het borstvetkussen14,15, kan de consistentie en reproduceerbaarheid van gemetastaseerde tumorbelasting een uitdaging zijn en kan de duur van dergelijke onderzoeken enkele maanden zijn. Voor het evalueren van longmetastase, in het bijzonder, is intraveneuze injectie in de staartader vaak een meer reproduceerbare en tijdseffectieve methode met gemetastaseerde verspreiding die meestal binnen een tijdsbestek van enkele weken optreedt. Aangezien het intraveneuze injectiemodel echter de eerste stappen van de metastatische cascade omzeilt, moet voorzichtigheid worden betracht bij het interpreteren van de resultaten van deze onderzoeken. In deze demonstratie tonen we staartaderinjectie van borsttumorcellen samen met een nauwkeurige en uitgebreide analysemethode.
Hoewel de onderzoeksgemeenschap aanzienlijke vooruitgang heeft geboekt bij het begrijpen van het complexe proces van borstkankermetastase, wordt geschat dat meer dan 150.000 vrouwen momenteel gemetastaseerde borstkanker hebben16. Van degenen met stadium IV borstkanker heeft >36% van de patiënten longmetastase17; het plaatsspecifieke patroon en de incidentie van metastasen kunnen echter variëren op basis van moleculair subtype18,19,20,21. Patiënten met borstkanker-geassocieerde longmetastasen hebben een mediane overleving van slechts 21 maanden, wat de noodzaak benadrukt om effectieve behandelingen en nieuwe biomarkers voor deze ziekte te identificeren17. Het gebruik van experimentele metastasemodellen, waaronder de intraveneuze injectie van tumorcellen, zal onze kennis van deze belangrijke klinische uitdaging blijven vergroten. In combinatie met digitale beeldvormingspathologie en de methode van metastatische longtumorbelastingsanalyse die in dit protocol wordt beschreven, zijn staartaderinjecties een waardevol hulpmiddel voor onderzoek naar borstkankermetastase.
Omdat onderzoekers intraveneuze injectie van tumorcellen blijven gebruiken als een experimenteel model voor metastase, ontbreken standaardpraktijken om de resulterende gemetastaseerde tumorbelasting te analyseren. In sommige gevallen kunnen significante verschillen in gemetastaseerde tumorbelasting bij manipulatie van bepaalde cellijnen en/of gebruik van chemische verbindingen macroscopisch worden waargenomen. In andere gevallen kunnen subtiele verschillen in gemetastaseerde zaaiing en groei echter over het hoofd worden …
The authors have nothing to disclose.
Representatieve gegevens werden gefinancierd door het National Cancer Institute (K22CA218549 tot S.T.S). Naast hun hulp bij het ontwikkelen van de uitgebreide analysemethode die hierin wordt gerapporteerd, bedanken we de Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Directeur – Krista La Perle, DVM, PhD) voor histologie en immunohistochemiediensten en de Pathology Imaging Core voor de ontwikkeling en analyse van algoritmen.
alcohol prep pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | for cleaning tail prior to injection |
dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | for mouse dissection and lung tissue inflation |
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013CV | cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Fisher Scientific | MT21030CV | used for resuspending tumor cells for injection |
ethanol (70 % solution) | OSU | used to minimize mouse's fur during dissection; use caution – flammable | |
Evan's blue dye | Millipore Sigma | E2129 | used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution – dangerous reagent |
Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | F4135 | cell culture media additive; used at 10% in DMEM |
forceps | Fisher Scientific | 10-270 | for dissection and lung tissue inflation |
FVB/NJ mice | The Jackson Laboratory | 001800 | syngeneic mouse strain for MVT1 cells |
hemacytometer (Bright-Line) | Millipore Sigma | Z359629 | for use in cell culture to obtain cell counts |
insulin syringe (28 G) | Fisher Scientific | 14-829-1B | for tail-vein injections (BD 329424) |
MDA-MB-231 cells | ATCC | human breast cancer cell line | |
MVT1 cells | mouse mammary tumor cells | ||
needles (26 G) | Fisher Scientific | 14-826-15 | used to inflate the mouse's lungs |
neutral buffered formalin (10%) | Fisher Scientific | 245685 | used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution – dangerous reagent |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource |
Penicillin Streptomycin 100x | ThermoFisher | 15140163 | cell culture media additive |
sterile gauze | Fisher Scientific | NC9379092 | for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs |
syringe (5 mL) | Fisher Scientific | 14-955-458 | used to inflate mouse lung tissue |
tail-vein restrainer | Braintree Scientific, Inc. | TV-150 STD | used to restrain mouse for tail-vein injections |
Trypan blue (0.4 %) | ThermoFisher | 15250061 | used in cell culture to assess viability |
Trypsin-EDTA 0.25 % | ThermoFisher | 25200-114 | used in cell culture to detach tumor cells from plate |