Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi
Summary
Kanser hücrelerinin intravenöz enjeksiyonu genellikle metastaz araştırmalarında kullanılır, ancak metastatik tümör yükünü analiz etmek zor olabilir. Burada, metastazın kuyruk damarı enjeksiyon modelini gösteriyoruz ve ortaya çıkan metastatik akciğer tümörü yükünü analiz etmek için yeni bir yaklaşım içeriyoruz.
Abstract
Çoğu kanser hastası için morbidite ve mortalitenin birincil nedeni olan metastazın farelerde preklinik olarak model alınması zor olabilir. Birkaç spontan metastaz modeli mevcuttur. Bu nedenle, uygun hücre hatlarının kuyruk damarı enjeksiyonu içeren deneysel metastaz modeli metastaz araştırmalarının bir dayanağıdır. Kanser hücreleri lateral kuyruk damarına enjekte edildiğinde akciğer tercih ettikleri kolonizasyon bölgesidir. Bu tekniğin potansiyel bir sınırlaması metastatik akciğer tümörü yükünün doğru ölçülmesidir. Bazı araştırmacılar önceden tanımlanmış boyuttaki makrometazları sayarken ve/veya dokunun kesitini takiben mikrometazlar içerirken, diğerleri normal doku alanına göre metastatik lezyonların alanını belirler. Metastatik yük yüksek olduğunda bu niceleme yöntemlerinin her ikisi de son derece zor olabilir. Burada, akciğer metastazının intravenöz enjeksiyon modelini ve ardından görüntü analiz yazılımı kullanarak metastatik tümör yükünü ölçmek için gelişmiş bir yöntem gösteriyoruz. Bu işlem, kapsamlı bir analiz sağlamak için ortalama metastaz boyutu, toplam metastaz sayısı ve toplam metastaz alanı dahil olmak üzere birden fazla uç nokta parametresinin araştırılmasına olanak tanır. Ayrıca, bu yöntem doğruluğu sağlamak için Amerikan Veteriner Patologlar Koleji (SEK) tarafından onaylanmış bir veteriner patolog kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
Introduction
Son derece karmaşık ve verimsiz bir süreç olmasına rağmen1, metastaz kanser hastalarının morbidite ve mortalitesine önemli bir katkıda bulunur2. Aslında, kansere bağlı ölümlerin çoğu hastalığın metastatik yayılmasına atfedilir3,4. Tümör hücrelerinin başarılı bir şekilde metastaz yapabilmesi için birincil bölgeden kopmaları, bitişik stroma yoluyla istila etmeleri, kan dolaşımına veya lenfatiklere intravazyona girmeleri, ikincil bir bölgenin kılcal yatağına gitmeleri, ikincil dokuya yayılmaları ve çoğalmaları veya metastatik lezyonlar oluşturmak için büyümeleri gerekir5. Fare modellerinin kullanımı, metastatik tohumlama ve büyümeden sorumlu moleküler mekanizmaların anlaşılmasını ilerletmek için kritik öneme sahiptir6,7. Burada, hem genetiği değiştirilmiş fare modellerinin hem de transplantasyon yöntemlerinin sıklıkla kullanıldığı meme kanseri metastazına odaklanıyoruz – her biri kendi avantajları ve sınırlamaları var.
Genetik olarak tasarlanmış meme tümörü modelleri, meme epitelinde transjenlerin ekspresyonini sağlamak için MMTV-LTR (fare meme tümörü virüsü uzun terminal tekrarı) ve WAP (Peynir Altı Suyu Asidik Protein) dahil olmak üzere meme bezine özgü promotörlerden yararlanır8. Polioma orta T antijeni (PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 ve simian virüs 40 (SV40) dahil olmak üzere onkogenler bu şekilde ifade edilmiştir9,10,11,12,13 ve bu genetik modeller primer tümör başlangıç ve ilerlemesini incelemek için yararlı olmakla birlikte, çok azı uzak organlara kolayca metastaz yapmaktadır. Ayrıca, bu genetik fare modelleri genellikle spontan veya deneysel metastaz modellerine göre daha fazla zaman ve maliyet yasaklayıcıdır. Genetik olarak tasarlanmış meme tümörü modellerinin çoğunun metastaz çalışması için sınırlandırılması göz önüne alındığında, transplantasyon teknikleri bu karmaşık süreci incelemek için cazip yöntemler haline gelmiştir. Buna ortotopik, kuyruk damarı, intrakardiyak ve uygun hücre hatlarının intrakraniyal enjeksiyonu dahildir.
Meme yağı pedine ortotopik enjeksiyondan sonra birkaç meme kanseri hücre hattı kolayca metastaz yapsa da14,15, metastatik tümör yükünün tutarlılığı ve tekrarlanabilirliği zor olabilir ve bu tür çalışmaların süresi birkaç ay sırasına göre olabilir. Akciğer metastazını değerlendirmek için, özellikle kuyruk damarına intravenöz enjeksiyon genellikle birkaç hafta içinde meydana gelen metastatik yayılma ile daha tekrarlanabilir ve zaman etkili bir yöntemdir. Ancak intravenöz enjeksiyon modeli metastatik kaskadın ilk adımlarını atlatığından, bu çalışmaların sonuçlarının yorumlanmasının dikkatli olunmalıdır. Bu gösteride, meme tümörü hücrelerinin kuyruk damarı enjeksiyonunun yanı sıra doğru ve kapsamlı bir analiz yöntemi gösteriyoruz.
Araştırma topluluğu meme kanseri metastazının karmaşık sürecini anlamada önemli ilerleme kaydetmiş olsa da, şu anda 150.000’den fazla kadının metastatik meme kanserine sahip olduğu tahmin edilmektedir16. Evre IV meme kanseri olanların % > 36’sı akciğer metastazı17; bununla birlikte, metastazların bölgeye özgü deseni ve insidansı moleküler alt tipe göre değişebilir18,19,20,21. Meme kanseri ile ilişkili akciğer metastazları olan hastalar, bu hastalık için etkili tedaviler ve yeni biyobelirteçler belirleme ihtiyacını vurgulayan sadece 21 aylık ortanca bir sağkalıma sahiptir17. Tümör hücrelerinin intravenöz enjeksiyonu da dahil olmak üzere deneysel metastaz modellerinin kullanımı, bu önemli klinik zorluk hakkındaki bilgimizi ilerletmeye devam edecektir. Bu protokolde açıklanan dijital görüntüleme patolojisi ve metastatik akciğer tümörü yük analizi yöntemi ile birleştirildiğinde kuyruk damar enjeksiyonları meme kanseri metastaz araştırmaları için değerli bir araçtır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Araştırmacılar metastaz için deneysel bir model olarak tümör hücrelerinin intravenöz enjeksiyonlarını kullanmaya devam ettikçe, ortaya çıkan metastatik tümör yükünü analiz etmek için standart uygulamalar eksiktir. Bazı durumlarda, belirli hücre hatlarının manipülasyonu ve/veya kimyasal bileşiklerin kullanımı üzerine metastatik tümör yükünde önemli farklılıklar makroskopik olarak gözlenebilir. Bununla birlikte, diğer durumlarda, metastatik tohumlama ve büyümedeki ince farklılıklar,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Temsili veriler Ulusal Kanser Enstitüsü (K22CA218549 ila S.T.S) aracılığıyla finanse edildi. Burada bildirilen kapsamlı analiz yönteminin geliştirilmesindeki yardımlarına ek olarak, histoloji ve immünofizyotimya hizmetleri için Ohio Eyalet Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi Karşılaştırmalı Patoloji ve Fare Fenotipleme Paylaşılan Kaynağına (Direktör – Krista La Perle, DVM, PhD) ve algoritma geliştirme ve analiz için Patoloji Görüntüleme Çekirdeğine teşekkür ederiz.
Materials
| alcohol prep pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | for cleaning tail prior to injection |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | for mouse dissection and lung tissue inflation |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013CV | cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Fisher Scientific | MT21030CV | used for resuspending tumor cells for injection |
| ethanol (70 % solution) | OSU | used to minimize mouse's fur during dissection; use caution – flammable | |
| Evan's blue dye | Millipore Sigma | E2129 | used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution – dangerous reagent |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | F4135 | cell culture media additive; used at 10% in DMEM |
| forceps | Fisher Scientific | 10-270 | for dissection and lung tissue inflation |
| FVB/NJ mice | The Jackson Laboratory | 001800 | syngeneic mouse strain for MVT1 cells |
| hemacytometer (Bright-Line) | Millipore Sigma | Z359629 | for use in cell culture to obtain cell counts |
| insulin syringe (28 G) | Fisher Scientific | 14-829-1B | for tail-vein injections (BD 329424) |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | human breast cancer cell line | |
| MVT1 cells | mouse mammary tumor cells | ||
| needles (26 G) | Fisher Scientific | 14-826-15 | used to inflate the mouse's lungs |
| neutral buffered formalin (10%) | Fisher Scientific | 245685 | used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution – dangerous reagent |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource |
| Penicillin Streptomycin 100x | ThermoFisher | 15140163 | cell culture media additive |
| sterile gauze | Fisher Scientific | NC9379092 | for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs |
| syringe (5 mL) | Fisher Scientific | 14-955-458 | used to inflate mouse lung tissue |
| tail-vein restrainer | Braintree Scientific, Inc. | TV-150 STD | used to restrain mouse for tail-vein injections |
| Trypan blue (0.4 %) | ThermoFisher | 15250061 | used in cell culture to assess viability |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | ThermoFisher | 25200-114 | used in cell culture to detach tumor cells from plate |
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews: Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Steeg, P. S. Targeting metastasis. Nature Reviews: Cancer. 16 (4), 201-218 (2016).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nature Medicine. 12 (8), 895-904 (2006).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Eckhardt, B. L., Francis, P. A., Parker, B. S., Anderson, R. L. Strategies for the discovery and development of therapies for metastatic breast cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (6), 479-497 (2012).
- Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Schoenenberger, C. A., et al. Targeted c-myc gene expression in mammary glands of transgenic mice induces mammary tumours with constitutive milk protein gene transcription. EMBO Journal. 7 (1), 169-175 (1988).
- Nusse, R., Varmus, H. E. Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell. 31 (1), 99-109 (1982).
- Muller, W. J., Sinn, E., Pattengale, P. K., Wallace, R., Leder, P. Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene. Cell. 54 (1), 105-115 (1988).
- Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. American Journal of Pathology. 163 (5), 2113-2126 (2003).
- Green, J. E., et al. The C3(1)/SV40 T-antigen transgenic mouse model of mammary cancer: ductal epithelial cell targeting with multistage progression to carcinoma. Oncogene. 19 (1), 1020-1027 (2000).
- Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PloS One. 7 (10), 47995 (2012).
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (3), 443-447 (2010).
- Mariotto, A. B., Etzioni, R., Hurlbert, M., Penberthy, L., Mayer, M. Estimation of the Number of Women Living with Metastatic Breast Cancer in the United States. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. 26 (6), 809-815 (2017).
- Xiao, W., et al. Risk factors and survival outcomes in patients with breast cancer and lung metastasis: a population-based study. Cancer Medicine. 7 (3), 922-930 (2018).
- Smid, M., et al. Subtypes of breast cancer show preferential site of relapse. 암 연구학. 68 (9), 3108-3114 (2008).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Soni, A., et al. Breast cancer subtypes predispose the site of distant metastases. American Journal of Clinical Pathology. 143 (4), 471-478 (2015).
- Leone, B. A., et al. Prognostic impact of metastatic pattern in stage IV breast cancer at initial diagnosis. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (3), 537-548 (2017).
- Pei, X. F., et al. Explant-cell culture of primary mammary tumors from MMTV-c-Myc transgenic mice. In Vitro Cellular and Developmental Biology: Animal. 40 (1-2), 14-21 (2004).
- Mathsyaraja, H., et al. CSF1-ETS2-induced microRNA in myeloid cells promote metastatic tumor growth. Oncogene. 34 (28), 3651-3661 (2015).
- Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
- La Perle, K. M. D. Comparative Pathologists: Ultimate Control Freaks Seeking Validation. Veterinary Pathology. 56 (1), 19-23 (2019).
- Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes and Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
- Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical and Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
- Yang, Y., et al. Immunocompetent mouse allograft models for development of therapies to target breast cancer metastasis. Oncotarget. 8 (19), 30621-30643 (2017).
- Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia. Laboratory Animals. 53 (2), 190-201 (2019).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 75 (4), 344-355 (2009).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Wright, L. E., et al. Murine models of breast cancer bone metastasis. BoneKEy Reports. 5, 804 (2016).
- Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
- Brown, D. L. Practical Stereology Applications for the Pathologist. Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).
- Aeffner, F., et al. Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).
