التحليل المرضي لنقائل الرئة بعد الحقن الجانبي الوريد الذيل من الخلايا السرطانية
Summary
غالبا ما يستخدم الحقن الوريدي للخلايا السرطانية في أبحاث الانبثاث ، ولكن عبء الورم النقيلي قد يكون من الصعب تحليله. هنا، ونحن نظهر نموذج حقن ذيل الوريد من الانبثاث وتشمل نهجا جديدا لتحليل عبء ورم الرئة النقيلي الناتجة.
Abstract
الانبثاث، السبب الرئيسي للمراضة والوفيات بالنسبة لمعظم مرضى السرطان، يمكن أن يكون تحديا لنموذج قبل السريرية في الفئران. تتوفر نماذج قليلة من الانبثاث التلقائي. وبالتالي ، فإن نموذج الانبثاث التجريبي الذي ينطوي على حقن الوريد الخلفي لخطوط الخلايا المناسبة هو الدعامة الأساسية لأبحاث الانبثاث. عندما يتم حقن الخلايا السرطانية في الوريد الذيل الجانبي ، فإن الرئة هي موقعها المفضل للاستعمار. أحد القيود المحتملة لهذه التقنية هو التحديد الكمي الدقيق لعبء ورم الرئة النقيلي. في حين أن بعض المحققين عد macrometastases من حجم محدد مسبقا و / أو تشمل micrometastases بعد تقسيم الأنسجة، والبعض الآخر تحديد منطقة الآفات النقيلي بالنسبة لمنطقة الأنسجة العادية. كل من هذه الطرق الكمي يمكن أن تكون صعبة للغاية عندما يكون العبء النقيلي عالية. هنا، ونحن نظهر نموذج حقن الوريد من الانبثاث الرئة تليها طريقة متقدمة لقياس عبء الورم النقيلي باستخدام برنامج تحليل الصورة. تسمح هذه العملية بالتحقيق في معلمات متعددة لنقطة النهاية ، بما في ذلك متوسط حجم الانبثاث ، والعدد الإجمالي للنقائل ، وإجمالي منطقة الانبثاث ، لتوفير تحليل شامل. وعلاوة على ذلك، تم استعراض هذه الطريقة من قبل مجلس الأمراض البيطرية معتمدة من قبل الكلية الأمريكية لأخصائيي الأمراض البيطرية (SEK) لضمان الدقة.
Introduction
على الرغم من كونه عملية معقدة للغاية وغير فعالة1 ، فإن الانبثاث هو مساهم كبير في مراضة ووفيات مرضى السرطان2. وفي الواقع، تعزى معظم الوفيات المرتبطة بالسرطان إلى الانتشار النقيلي للمرض 3،4. من أجل أن تنتشر الخلايا السرطانية بنجاح ، يجب أن تنفصل عن الموقع الأساسي ، وتغزو من خلال ستروما المجاورة ، وتتغلغل في الدورة الدموية أو اللمفاويات ، والسفر إلى السرير الشعري لموقع ثانوي ، والبذخ في الأنسجة الثانوية ، وتتكاثر أو تنمو لتشكيل الآفات النقيلية5. وكان استخدام نماذج الماوس حاسما لتعزيز فهم الآليات الجزيئية المسؤولة عن البذر النقيلي والنمو6،7. هنا، ونحن نركز على الانبثاث سرطان الثدي، والتي غالبا ما تستخدم نماذج الماوس المعدلة وراثيا، فضلا عن أساليب زرع – كل مع مجموعة خاصة بهم من المزايا والقيود.
نماذج الورم الثديي المعدلة وراثيا الاستفادة من المروجين الغدة الثديية محددة، بما في ذلك MMTV-LTR (الماوس فيروس الورم الثديي تكرار محطة طويلة) وWAP (بروتين مصل اللبن الحمضية)، لدفع التعبير عن المتحولين جنسيا في ظهارة الثديي8. وقد تم التعبير عن الأورام المتجانسة بما في ذلك مستضد بوليوما تي الأوسط (PyMT) ، ErbB2 / Neu ، c-Myc ، Wnt-1 ، وفيروس سيميان 40 (SV40) بهذه الطريقة9،10،11،12،13 ، وبينما هذه النماذج الوراثية مفيدة لدراسة بدء الورم الأولي وتطوره ، إلا أن القليل منها ينتشر بسهولة إلى الأعضاء البعيدة. وعلاوة على ذلك، فإن نماذج الماوس الوراثية هذه غالبا ما تكون أكثر تكلفة والوقت باهظة من نماذج الانبثاث التلقائي أو التجريبي. نظرا للحد من معظم نماذج الأورام الثديية المعدلة وراثيا لدراسة الانبثاث ، أصبحت تقنيات الزرع طرقا جذابة لدراسة هذه العملية المعقدة. وهذا يشمل orthotopic, ذيل الوريد, داخل القلب, وحقن داخل الجمجمة من خطوط الخلايا المناسبة.
على الرغم من أن العديد من خطوط خلايا سرطان الثدي تنتشر بسهولة بعد الحقن التقويمي في وسادة الدهون الثديية14,15 ، فإن اتساق واستنساخ عبء الورم النقيلي يمكن أن يكون تحديا ، ويمكن أن تكون مدة هذه الدراسات على مدار عدة أشهر. لتقييم الانبثاث الرئوي، على وجه الخصوص، الحقن الوريدي في الوريد الذيل غالبا ما يكون طريقة أكثر استنساخا وفعالة من حيث الوقت مع انتشار النقيلي التي تحدث عادة في غضون بضعة أسابيع. ومع ذلك ، بما أن نموذج الحقن الوريدي يتجاوز الخطوات الأولية لسلسلة النقيلي ، يجب توخي الحذر في تفسير نتائج هذه الدراسات. في هذه المظاهرة، نعرض حقن الوريد الذيل من الخلايا السرطانية الثديية جنبا إلى جنب مع طريقة دقيقة وشاملة للتحليل.
على الرغم من أن مجتمع الأبحاث قد أحرز تقدما كبيرا في فهم العملية المعقدة للانبثاث سرطان الثدي، ويقدر أن أكثر من 150،000 امرأة حاليا سرطان الثدي النقيلي16. من بين المصابين بسرطان الثدي في المرحلة الرابعة، يعاني >36٪ من المرضى من انبثاث الرئة17؛ ومع ذلك، يمكن أن يختلف نمط وحدوث الانبثاث الخاصة بالموقع استنادا إلى النوع الفرعي الجزيئي18,19,20,21. المرضى الذين يعانون من انبثاث الرئة المرتبطة بسرطان الثدي لديهم متوسط البقاء على قيد الحياة من 21 شهرا فقط تسليط الضوء على الحاجة إلى تحديد العلاجات الفعالة والمؤشرات الحيوية الجديدة لهذا المرض17. استخدام نماذج الانبثاث التجريبية، بما في ذلك الحقن الوريدي للخلايا السرطانية، سوف تستمر في تعزيز معرفتنا بهذا التحدي السريري الهام. عند دمجها مع علم أمراض التصوير الرقمي وطريقة تحليل عبء ورم الرئة النقيلي الموصوف في هذا البروتوكول ، فإن حقن الوريد الخلفي هي أداة قيمة لأبحاث الانبثاث لسرطان الثدي.
Protocol
Representative Results
Discussion
مع استمرار الباحثين في استخدام الحقن الوريدي للخلايا السرطانية كنموذج تجريبي للانبثاث ، تفتقر إلى الممارسات القياسية لتحليل عبء الورم النقيلي الناتج. في بعض الحالات، يمكن ملاحظة اختلافات كبيرة في عبء الورم النقيلي عند التلاعب بخطوط خلايا معينة و / أو استخدام المركبات الكيميائية بشكل كل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل البيانات التمثيلية من خلال المعهد الوطني للسرطان (K22CA218549 إلى S.T.S). بالإضافة إلى مساعدتهم في تطوير طريقة التحليل الشامل المذكورة هنا ، نشكر مركز السرطان الشامل بجامعة ولاية أوهايو على علم الأمراض المقارن والموارد المشتركة في Phenotyping Mouse (مدير – كريستا لا بيرل ، DVM ، دكتوراه) لخدمات الأنسجة والكيمياء المناعية وجوهر تصوير علم الأمراض لتطوير الخوارزميات وتحليلها.
Materials
| alcohol prep pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | for cleaning tail prior to injection |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | for mouse dissection and lung tissue inflation |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013CV | cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Fisher Scientific | MT21030CV | used for resuspending tumor cells for injection |
| ethanol (70 % solution) | OSU | used to minimize mouse's fur during dissection; use caution – flammable | |
| Evan's blue dye | Millipore Sigma | E2129 | used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution – dangerous reagent |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | F4135 | cell culture media additive; used at 10% in DMEM |
| forceps | Fisher Scientific | 10-270 | for dissection and lung tissue inflation |
| FVB/NJ mice | The Jackson Laboratory | 001800 | syngeneic mouse strain for MVT1 cells |
| hemacytometer (Bright-Line) | Millipore Sigma | Z359629 | for use in cell culture to obtain cell counts |
| insulin syringe (28 G) | Fisher Scientific | 14-829-1B | for tail-vein injections (BD 329424) |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | human breast cancer cell line | |
| MVT1 cells | mouse mammary tumor cells | ||
| needles (26 G) | Fisher Scientific | 14-826-15 | used to inflate the mouse's lungs |
| neutral buffered formalin (10%) | Fisher Scientific | 245685 | used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution – dangerous reagent |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource |
| Penicillin Streptomycin 100x | ThermoFisher | 15140163 | cell culture media additive |
| sterile gauze | Fisher Scientific | NC9379092 | for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs |
| syringe (5 mL) | Fisher Scientific | 14-955-458 | used to inflate mouse lung tissue |
| tail-vein restrainer | Braintree Scientific, Inc. | TV-150 STD | used to restrain mouse for tail-vein injections |
| Trypan blue (0.4 %) | ThermoFisher | 15250061 | used in cell culture to assess viability |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | ThermoFisher | 25200-114 | used in cell culture to detach tumor cells from plate |
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews: Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Steeg, P. S. Targeting metastasis. Nature Reviews: Cancer. 16 (4), 201-218 (2016).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nature Medicine. 12 (8), 895-904 (2006).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Eckhardt, B. L., Francis, P. A., Parker, B. S., Anderson, R. L. Strategies for the discovery and development of therapies for metastatic breast cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (6), 479-497 (2012).
- Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
- Schoenenberger, C. A., et al. Targeted c-myc gene expression in mammary glands of transgenic mice induces mammary tumours with constitutive milk protein gene transcription. EMBO Journal. 7 (1), 169-175 (1988).
- Nusse, R., Varmus, H. E. Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell. 31 (1), 99-109 (1982).
- Muller, W. J., Sinn, E., Pattengale, P. K., Wallace, R., Leder, P. Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene. Cell. 54 (1), 105-115 (1988).
- Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. American Journal of Pathology. 163 (5), 2113-2126 (2003).
- Green, J. E., et al. The C3(1)/SV40 T-antigen transgenic mouse model of mammary cancer: ductal epithelial cell targeting with multistage progression to carcinoma. Oncogene. 19 (1), 1020-1027 (2000).
- Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PloS One. 7 (10), 47995 (2012).
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (3), 443-447 (2010).
- Mariotto, A. B., Etzioni, R., Hurlbert, M., Penberthy, L., Mayer, M. Estimation of the Number of Women Living with Metastatic Breast Cancer in the United States. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. 26 (6), 809-815 (2017).
- Xiao, W., et al. Risk factors and survival outcomes in patients with breast cancer and lung metastasis: a population-based study. Cancer Medicine. 7 (3), 922-930 (2018).
- Smid, M., et al. Subtypes of breast cancer show preferential site of relapse. 암 연구학. 68 (9), 3108-3114 (2008).
- Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
- Soni, A., et al. Breast cancer subtypes predispose the site of distant metastases. American Journal of Clinical Pathology. 143 (4), 471-478 (2015).
- Leone, B. A., et al. Prognostic impact of metastatic pattern in stage IV breast cancer at initial diagnosis. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (3), 537-548 (2017).
- Pei, X. F., et al. Explant-cell culture of primary mammary tumors from MMTV-c-Myc transgenic mice. In Vitro Cellular and Developmental Biology: Animal. 40 (1-2), 14-21 (2004).
- Mathsyaraja, H., et al. CSF1-ETS2-induced microRNA in myeloid cells promote metastatic tumor growth. Oncogene. 34 (28), 3651-3661 (2015).
- Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
- La Perle, K. M. D. Comparative Pathologists: Ultimate Control Freaks Seeking Validation. Veterinary Pathology. 56 (1), 19-23 (2019).
- Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes and Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
- Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical and Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
- Yang, Y., et al. Immunocompetent mouse allograft models for development of therapies to target breast cancer metastasis. Oncotarget. 8 (19), 30621-30643 (2017).
- Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia. Laboratory Animals. 53 (2), 190-201 (2019).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
- Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 75 (4), 344-355 (2009).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Wright, L. E., et al. Murine models of breast cancer bone metastasis. BoneKEy Reports. 5, 804 (2016).
- Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
- Brown, D. L. Practical Stereology Applications for the Pathologist. Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).
- Aeffner, F., et al. Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).
