ट्यूमर कोशिकाओं के पार्श्व पूंछ-शिरा इंजेक्शन के बाद फेफड़ों के मेटास्टेसिस का पैथोलॉजिकल विश्लेषण
Summary
कैंसर कोशिकाओं के अंतःशिरा इंजेक्शन का उपयोग अक्सर मेटास्टेसिस अनुसंधान में किया जाता है, लेकिन मेटास्टैटिक ट्यूमर बोझ का विश्लेषण करना मुश्किल हो सकता है। इसमें, हम मेटास्टेसिस के एक पूंछ-शिरा इंजेक्शन मॉडल का प्रदर्शन करते हैं और परिणामी मेटास्टैटिक फेफड़ों के ट्यूमर के बोझ का विश्लेषण करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण शामिल करते हैं।
Abstract
मेटास्टेसिस, अधिकांश कैंसर रोगियों के लिए रुग्णता और मृत्यु दर का प्राथमिक कारण, चूहों में प्रीक्लिनिकल रूप से मॉडल करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है। कुछ सहज मेटास्टेसिस मॉडल उपलब्ध हैं। इस प्रकार, उपयुक्त सेल लाइनों के पूंछ-शिरा इंजेक्शन को शामिल करने वाला प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस मॉडल मेटास्टेसिस अनुसंधान का मुख्य आधार है। जब कैंसर कोशिकाओं को पार्श्व पूंछ-नस में इंजेक्ट किया जाता है, तो फेफड़े उपनिवेशीकरण की उनकी पसंदीदा साइट होती है। इस तकनीक की एक संभावित सीमा मेटास्टैटिक फेफड़ों के ट्यूमर के बोझ का सटीक परिमाणीकरण है। जबकि कुछ जांचकर्ता एक पूर्व-परिभाषित आकार के मैक्रोमेटास्टेसिस की गिनती करते हैं और / या ऊतक के विभाजन के बाद माइक्रोमेटास्टेसिस शामिल करते हैं, अन्य सामान्य ऊतक क्षेत्र के सापेक्ष मेटास्टैटिक घावों के क्षेत्र को निर्धारित करते हैं। मेटास्टैटिक बोझ अधिक होने पर इन दोनों परिमाणीकरण विधियों को बहुत मुश्किल हो सकता है। यहां, हम छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मेटास्टैटिक ट्यूमर के बोझ को मापने के लिए एक उन्नत विधि के बाद फेफड़ों के मेटास्टेसिस के एक अंतःशिरा इंजेक्शन मॉडल का प्रदर्शन करते हैं। यह प्रक्रिया एक व्यापक विश्लेषण प्रदान करने के लिए औसत मेटास्टेसिस आकार, मेटास्टेसिस की कुल संख्या और कुल मेटास्टेसिस क्षेत्र सहित कई अंत-बिंदु मापदंडों की जांच की अनुमति देती है। इसके अलावा, सटीकता सुनिश्चित करने के लिए अमेरिकन कॉलेज ऑफ वेटरनरी पैथोलॉजिस्ट (एसईके) द्वारा प्रमाणित एक पशु चिकित्सा रोगविज्ञानी बोर्ड द्वारा इस विधि की समीक्षा की गई है।
Introduction
एक अत्यधिक जटिल और अक्षम प्रक्रिया 1 होने के बावजूद, मेटास्टेसिस कैंसर रोगियों की रुग्णता और मृत्यु दर के लिए एक महत्वपूर्ण योगदानकर्ता है2। वास्तव में, अधिकांश कैंसर से संबंधित मौतों को रोग 3,4 के मेटास्टैटिक प्रसार के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। ट्यूमर कोशिकाओं को सफलतापूर्वक मेटास्टेसाइज़ करने के लिए, उन्हें प्राथमिक साइट से अलग होना चाहिए, आसन्न स्ट्रोमा के माध्यम से आक्रमण करना चाहिए, रक्त परिसंचरण या लसीका में इंट्रावेसेट करना चाहिए, एक माध्यमिक साइट के केशिका बिस्तर की यात्रा करना चाहिए, माध्यमिक ऊतक में extravasate करना चाहिए, और मेटास्टैटिक घावों को बनाने के लिए फैलना या बढ़ना चाहिए5। माउस मॉडल का उपयोग मेटास्टैटिक सीडिंग और विकास के लिए जिम्मेदार आणविक तंत्र की समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण रहा है6,7। इसमें, हम स्तन कैंसर मेटास्टेसिस पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जिसके लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल के साथ-साथ प्रत्यारोपण के तरीकों दोनों का अक्सर उपयोग किया जाता है – प्रत्येक के फायदे और सीमाओं के अपने स्वयं के सेट के साथ।
आनुवंशिक रूप से इंजीनियर स्तन ट्यूमर मॉडल स्तन ग्रंथि विशिष्ट प्रवर्तकों का उपयोग करते हैं, जिसमें एमएमटीवी-एलटीआर (माउस स्तन ट्यूमर वायरस लंबे टर्मिनल दोहराने) और डब्ल्यूएपी (मट्ठा अम्लीय प्रोटीन) शामिल हैं, स्तन उपकला 8 में ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए। पॉलीओमा मिडिल टी एंटीजन (PyMT), ErbB2 / Neu, c-Myc, WNT-1, और सिमियन वायरस 40 (SV40) सहित ऑन्कोजीन को इस तरह से व्यक्त किया गया है9,10,11,12,13, और जबकि ये आनुवंशिक मॉडल प्राथमिक ट्यूमर दीक्षा और प्रगति का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हैं, कुछ आसानी से दूर के अंगों में मेटास्टेसाइज़ करते हैं। इसके अलावा, ये आनुवंशिक माउस मॉडल अक्सर सहज या प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस मॉडल की तुलना में अधिक समय और लागत निषेधात्मक होते हैं। मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए सबसे आनुवंशिक रूप से इंजीनियर स्तन ट्यूमर मॉडल की सीमा को देखते हुए, प्रत्यारोपण तकनीक इस जटिल प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए आकर्षक तरीके बन गए हैं। इसमें ऑर्थोटोपिक, पूंछ-शिरा, इंट्राकार्डियक और उपयुक्त सेल लाइनों के इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन शामिल हैं।
यद्यपि कई स्तन कैंसर सेल लाइनें स्तन वसा पैड 14,15 में ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन के बाद आसानी से मेटास्टेसाइज़ करती हैं, मेटास्टैटिक ट्यूमर बोझ की स्थिरता और पुनरुत्पादन एक चुनौती हो सकती है, और इस तरह के अध्ययनों की अवधि कई महीनों के आदेश पर हो सकती है। फेफड़ों के मेटास्टेसिस का मूल्यांकन करने के लिए, विशेष रूप से, पूंछ-नस में अंतःशिरा इंजेक्शन अक्सर मेटास्टैटिक प्रसार के साथ एक अधिक पुनरुत्पादक और समय-प्रभावी तरीका होता है जो आमतौर पर कुछ हफ्तों की अवधि के भीतर होता है। हालांकि, चूंकि अंतःशिरा इंजेक्शन मॉडल मेटास्टैटिक कैस्केड के प्रारंभिक चरणों को दरकिनार करता है, इसलिए इन अध्ययनों के परिणामों की व्याख्या करने में सावधानी बरतनी चाहिए। इस प्रदर्शन में, हम विश्लेषण की एक सटीक और व्यापक विधि के साथ स्तन ट्यूमर कोशिकाओं की पूंछ-शिरा इंजेक्शन दिखाते हैं।
भले ही अनुसंधान समुदाय ने स्तन कैंसर मेटास्टेसिस की जटिल प्रक्रिया को समझने में महत्वपूर्ण प्रगति की है, यह अनुमान लगाया गया है कि वर्तमान में 150,000 से अधिक महिलाओं को मेटास्टैटिक स्तन कैंसर है। चरण IV स्तन कैंसर वाले लोगों में से, >36% रोगियों में फेफड़े के मेटास्टेसिस 17 हैं; हालांकि, साइट-विशिष्ट पैटर्न और मेटास्टेसिस की घटनाएं आणविक उपप्रकार 18,19,20,21 के आधार पर भिन्न हो सकती हैं। स्तन कैंसर से जुड़े फेफड़ों के मेटास्टेसिस वाले रोगियों में केवल 21 महीनों का औसत अस्तित्व होता है, जो इस बीमारी के लिए प्रभावी उपचार और उपन्यास बायोमार्कर की पहचान करने की आवश्यकता पर प्रकाश डालता है। ट्यूमर कोशिकाओं के अंतःशिरा इंजेक्शन सहित प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस मॉडल का उपयोग, इस महत्वपूर्ण नैदानिक चुनौती के हमारे ज्ञान को आगे बढ़ाना जारी रखेगा। जब डिजिटल इमेजिंग पैथोलॉजी और इस प्रोटोकॉल के भीतर वर्णित मेटास्टैटिक फेफड़ों के ट्यूमर के बोझ विश्लेषण की विधि के साथ संयुक्त किया जाता है, तो पूंछ-शिरा इंजेक्शन स्तन कैंसर मेटास्टेसिस अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान उपकरण हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
जैसा कि शोधकर्ता मेटास्टेसिस के लिए एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में ट्यूमर कोशिकाओं के अंतःशिरा इंजेक्शन का उपयोग करना जारी रखते हैं, परिणामी मेटास्टैटिक ट्यूमर बोझ का विश्लेषण करने के लिए मानक प्रथा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
प्रतिनिधि डेटा को राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (K22CA218549 से S.T.S. के लिए) के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था। यहां रिपोर्ट की गई व्यापक विश्लेषण विधि को विकसित करने में उनकी सहायता के अलावा, हम ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर तुलनात्मक पैथोलॉजी और माउस फेनोटाइपिंग साझा संसाधन (निदेशक – Krista La Perle, DVM, PhD) को हिस्टोलॉजी और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री सेवाओं के लिए धन्यवाद देते हैं और एल्गोरिथ्म विकास और विश्लेषण के लिए पैथोलॉजी इमेजिंग कोर।
Materials
| alcohol prep pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | for cleaning tail prior to injection |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | for mouse dissection and lung tissue inflation |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013CV | cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Fisher Scientific | MT21030CV | used for resuspending tumor cells for injection |
| ethanol (70 % solution) | OSU | used to minimize mouse's fur during dissection; use caution – flammable | |
| Evan's blue dye | Millipore Sigma | E2129 | used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution – dangerous reagent |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | F4135 | cell culture media additive; used at 10% in DMEM |
| forceps | Fisher Scientific | 10-270 | for dissection and lung tissue inflation |
| FVB/NJ mice | The Jackson Laboratory | 001800 | syngeneic mouse strain for MVT1 cells |
| hemacytometer (Bright-Line) | Millipore Sigma | Z359629 | for use in cell culture to obtain cell counts |
| insulin syringe (28 G) | Fisher Scientific | 14-829-1B | for tail-vein injections (BD 329424) |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | human breast cancer cell line | |
| MVT1 cells | mouse mammary tumor cells | ||
| needles (26 G) | Fisher Scientific | 14-826-15 | used to inflate the mouse's lungs |
| neutral buffered formalin (10%) | Fisher Scientific | 245685 | used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution – dangerous reagent |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource |
| Penicillin Streptomycin 100x | ThermoFisher | 15140163 | cell culture media additive |
| sterile gauze | Fisher Scientific | NC9379092 | for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs |
| syringe (5 mL) | Fisher Scientific | 14-955-458 | used to inflate mouse lung tissue |
| tail-vein restrainer | Braintree Scientific, Inc. | TV-150 STD | used to restrain mouse for tail-vein injections |
| Trypan blue (0.4 %) | ThermoFisher | 15250061 | used in cell culture to assess viability |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | ThermoFisher | 25200-114 | used in cell culture to detach tumor cells from plate |
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