종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석
Summary
암세포의 정맥 주사는 전이 연구에서 자주 사용되지만 전이성 종양 부담은 분석하기 어려울 수 있습니다. 본명, 전이의 꼬리 정맥 주사 모델을 시연하고 결과전이성 폐 종양 부담을 분석하는 새로운 접근법을 포함한다.
Abstract
대부분의 암 환자를 위한 이환율 과 사망의 1차 원인인 전이는 마우스에서 전임상적으로 모델링하는 것이 어려울 수 있습니다. 몇 가지 자발적인 전이 모델을 사용할 수 있습니다. 따라서, 적절한 세포주의 꼬리 정맥 주입을 포함하는 실험전이 모델은 전이 연구의 주축이다. 암세포가 측면 꼬리 정맥에 주입될 때, 폐는 식민지화의 그들의 바람직한 사이트입니다. 이 기술의 잠재적 인 제한은 전이성 폐 종양 부담의 정확한 정량화입니다. 몇몇 조사자는 사전 정의된 크기의 macrometastases를 계산하고 조직의 단면 다음 micrometastases를 포함하는 동안, 그 외는 일반적인 조직 지역에 근거를 둔 전이성 병변의 지역을 결정합니다. 이 두 정량화 방법 모두 전이성 부담이 높을 때 매우 어려울 수 있습니다. 본명, 우리는 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 전이성 종양 부담을 정량화하는 고급 방법에 이어 폐 전이의 정맥 주사 모델을 시연한다. 이 프로세스를 통해 평균 전이 크기, 총 전이 수 및 총 전이 영역을 포함한 다중 엔드 포인트 매개 변수를 조사하여 포괄적인 분석을 제공할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 정확도를 보장하기 위해 미국 수의병리학자(SEK)에서 인증한 수의병리학자 위원회에 의해 검토되었습니다.
Introduction
매우 복잡하고 비효율적인 과정임에도 불구하고1, 전이는 암 환자의 이환율과 사망률에 중요한 기여이다2. 사실, 대부분의 암 관련 죽음은 질병의 전이성 퍼짐에 기인합니다3,4. 종양 세포가 성공적으로 전이되기 위하여는, 그(것)들은 1 차 적인 사이트에서 분리하고, 인접한 기질기를 통해 침략하고, 혈액 순환 또는 림프로 침입하고, 이차 사이트의 모세관 침대로 여행하고, 이차 조직으로 사치스럽게, 증식하거나 전이성 병변을 형성하기 위하여 증가하거나 성장해야 합니다. 마우스 모델의 사용은 전이성 파종 및 growth6,7을 담당하는 분자 메커니즘의 이해를 증진하는 데 매우 중요했습니다. 본명, 우리는 유방암 전이에 초점을 맞추고, 유전자 변형 마우스 모델뿐만 아니라 이식 방법이 종종 사용되는 – 장점과 한계의 자신의 세트와 각각.
유전자 조작 된 유방 종양 모델은 MMTV-LTR (마우스 유방 종양 바이러스 긴 말단 반복) 및 WAP (유청 산성 단백질)를 포함한 유방 선및 특정 프로모터를 사용하여 유방 상피8에서 트랜스 유전자의 발현을 유도합니다. 폴리마 중형 T 항원(PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 및 simian 바이러스 40(SV40)을 포함한 온코진은 이러한 방식으로 발현되었으며, 이러한 유전 적 모델은 1차 종양 개시 및 진행을 연구하는 데 유용하지만, 몇 가지 판독적으로 대사를 거친 장기에 대해 보다 쉽게 대사한다. 더욱이, 이러한 유전 마우스 모델은 종종 자발적 또는 실험 전이 모델보다 더 많은 시간과 비용이 금지된다. 전이를 연구하기 위해 대부분의 유전자 조작 된 유방 종양 모델의 한계를 감안할 때, 이식 기술은이 복잡한 과정을 연구하는 매력적인 방법이되고있다. 여기에는 직교, 꼬리 정맥, 심장 내 및 적합한 세포주의 두개 내 주입이 포함됩니다.
여러 유방암 세포주가 유방 지방 패드14,15로 직교 주입에 따라 쉽게 전이되지만, 전이성 종양 부담의 일관성과 재현성은 도전이 될 수 있으며, 이러한 연구의 기간은 몇 달의 순서에 있을 수 있습니다. 폐 전이를 평가하기 위해, 특히, 꼬리 정맥내의 정맥 주사는 종종 전이성 확산이 일반적으로 몇 주 내에 발생하는 보다 재현 가능하고 시간 효율적인 방법입니다. 그러나, 정맥 주사 모델은 전이성 캐스케이드의 초기 단계를 우회하기 때문에, 이러한 연구의 결과를 해석에주의를 기울여야한다. 이 데모에서는 정확하고 포괄적인 분석 방법과 함께 유방 종양 세포의 꼬리 정맥 주입을 보여줍니다.
연구 공동체가 유방암 전이의 복잡한 과정을 이해하는 데 상당한 진전을 이루었음에도 불구하고 현재 150,000명 이상의 여성이 전이성 유방암16을 가지고 있는 것으로 추정됩니다. 단계 IV 유방암을 가진 사람들의, >36% 환자의 폐 전이17이 있습니다; 그러나, 전이의 부위 별 패턴 및 발생률은 분자 하위타입18,19,20,21에 따라 달라질 수 있다. 유방암 관련 폐 전이를 가진 환자는 이 질병을 위한 효과적인 처리 및 새로운 biomarkers를 확인하는 필요를 강조하는 단지 21 달의 중앙 생존이 17. 종양 세포의 정맥 주사를 포함하여 실험적인 전이 모형의 사용은, 이 중요한 임상 도전의 우리의 지식을 계속 전진할 것입니다. 디지털 이미징 병리학 및 이 프로토콜 내에서 설명된 전이성 폐 종양 부담 분석 방법과 결합될 때, 꼬리 정맥 주사는 유방암 전이 연구를 위한 귀중한 도구입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
연구원이 전이를 위한 실험 모형으로 종양 세포의 정맥 주사를 계속 사용함에 따라, 결과전이성 종양 부담을 분석하는 표준 사례는 부족합니다. 경우에 따라 특정 세포주를 조작하거나 화학 화합물을 사용하는 경우 전이성 종양 부담의 현저한 차이를 거시적으로 관찰할 수 있다. 그러나, 다른 경우에, 전이성 파종 및 성장에 있는 미묘한 다름은 철저한 병리학 적인 분석 없이 간과되거나 잘못 해?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
대표적인 데이터는 국립암연구소(K22CA218549~S.T.S.S)를 통해 지원되었다. 본 원에 보고된 포괄적인 분석 방법 개발에 도움을 주는 것 외에도, 오하이오 주립대학 종합암 센터 비교 병리학 및 마우스 Phenotyping 공유 리소스(디렉터 – 크리스타 라 펄, DVM, 박사)에게 조직학 및 면역 조직화학 서비스 및 알고리즘 개발 및 분석을 위한 병리학 이미징 코어에 감사드립니다.
Materials
| alcohol prep pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | for cleaning tail prior to injection |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | for mouse dissection and lung tissue inflation |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013CV | cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Fisher Scientific | MT21030CV | used for resuspending tumor cells for injection |
| ethanol (70 % solution) | OSU | used to minimize mouse's fur during dissection; use caution – flammable | |
| Evan's blue dye | Millipore Sigma | E2129 | used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution – dangerous reagent |
| Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | F4135 | cell culture media additive; used at 10% in DMEM |
| forceps | Fisher Scientific | 10-270 | for dissection and lung tissue inflation |
| FVB/NJ mice | The Jackson Laboratory | 001800 | syngeneic mouse strain for MVT1 cells |
| hemacytometer (Bright-Line) | Millipore Sigma | Z359629 | for use in cell culture to obtain cell counts |
| insulin syringe (28 G) | Fisher Scientific | 14-829-1B | for tail-vein injections (BD 329424) |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | human breast cancer cell line | |
| MVT1 cells | mouse mammary tumor cells | ||
| needles (26 G) | Fisher Scientific | 14-826-15 | used to inflate the mouse's lungs |
| neutral buffered formalin (10%) | Fisher Scientific | 245685 | used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution – dangerous reagent |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource |
| Penicillin Streptomycin 100x | ThermoFisher | 15140163 | cell culture media additive |
| sterile gauze | Fisher Scientific | NC9379092 | for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs |
| syringe (5 mL) | Fisher Scientific | 14-955-458 | used to inflate mouse lung tissue |
| tail-vein restrainer | Braintree Scientific, Inc. | TV-150 STD | used to restrain mouse for tail-vein injections |
| Trypan blue (0.4 %) | ThermoFisher | 15250061 | used in cell culture to assess viability |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | ThermoFisher | 25200-114 | used in cell culture to detach tumor cells from plate |
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