Intravenøs injeksjon av kreftceller brukes ofte i metastaseforskning, men den metastatiske tumorbyrden kan være vanskelig å analysere. Heri demonstrerer vi en hale-vene injeksjonsmodell av metastase og inkluderer en ny tilnærming for å analysere den resulterende metastatiske lungesvulstbyrden.
Metastase, hovedårsaken til sykelighet og dødelighet for de fleste kreftpasienter, kan være utfordrende å modellere preklinisk hos mus. Få spontane metastaseringsmodeller er tilgjengelige. Dermed er den eksperimentelle metastasemodellen som involverer hale-vene injeksjon av egnede cellelinjer en bærebjelke i metastaseforskning. Når kreftceller injiseres i lateral hale-venen, er lungen deres foretrukne koloniseringssted. En potensiell begrensning av denne teknikken er nøyaktig kvantifisering av den metastatiske lungesvulstbyrden. Mens noen etterforskere teller makrometastaser av forhåndsdefinerte størrelser og/eller inkluderer mikrometastaser etter seksjonering av vev, bestemmer andre området metastatiske lesjoner i forhold til normalt vevsområde. Begge disse kvantifiseringsmetodene kan være svært vanskelige når den metastatiske byrden er høy. Heri demonstrerer vi en intravenøs injeksjonsmodell av lungemetastase etterfulgt av en avansert metode for kvantifisering av metastatisk tumorbyrde ved hjelp av bildeanalyseprogramvare. Denne prosessen gjør det mulig å undersøke flere sluttpunktparametere, inkludert gjennomsnittlig metastaseringsstørrelse, totalt antall metastaser og totalt metastaseområde, for å gi en omfattende analyse. Videre har denne metoden blitt gjennomgått av en veterinærpatolog som er sertifisert av American College of Veterinary Pathologists (SEK) for å sikre nøyaktighet.
Til tross for å være en svært kompleks og ineffektiv prosess1, er metastase en betydelig bidragsyter til sykelighet og dødelighet av kreftpasienter2. Faktisk tilskrives de fleste kreftrelaterte dødsfall metastatisk spredning av sykdom3,4. For at tumorceller skal kunne metastasere, må de løsne fra det primære stedet, invadere gjennom tilstøtende stroma, intravasere i blodsirkulasjon eller lymfatikk, reise til kapillærsengen på et sekundært sted, ekstravasere inn i sekundærvevet og spre seg eller vokse for å danne metastatiske lesjoner5. Bruken av musemodeller har vært avgjørende for å fremme forståelsen av de molekylære mekanismene som er ansvarlige for metastatisk såing og vekst6,7. Her fokuserer vi på brystkreftmetastase, som både genetisk modifiserte musemodeller samt transplantasjonsmetoder ofte brukes til – hver med sitt eget sett med fordeler og begrensninger.
Genetisk konstruerte brystsvulstmodeller benytter seg av brystkjertelspesifikke promotorer, inkludert MMTV-LTR (musepattedyr tumorvirus lang terminal repetisjon) og WAP (Whey Acidic Protein), for å drive uttrykk for transgenes i pattedyrepitelet8. Oncogenes inkludert polyoma middle T antigen (PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 og simian virus 40 (SV40) har blitt uttrykt på denne måten9,10,11,12,13, og mens disse genetiske modellene er nyttige for å studere primær tumor initiering og progresjon, få lett metastasere til fjerne organer. Videre er disse genetiske musemodellene ofte mer tids- og kostnadsoverkommelige enn spontane eller eksperimentelle metastasemodeller. Gitt begrensningen av de fleste genetisk konstruerte mammary tumor modeller for å studere metastase, har transplantasjonsteknikker blitt attraktive metoder for å studere denne komplekse prosessen. Dette inkluderer ortotopisk, hale-vene, intrakariac og intrakraniell injeksjon av egnede cellelinjer.
Selv om flere brystkreftcellelinjer lett metastaser etter ortotopisk injeksjon i brystfettputen14,15, kan konsistensen og reproduserbarheten av metastatisk tumorbyrde være en utfordring, og varigheten av slike studier kan være i rekkefølge på flere måneder. For evaluering av lungemetastase er spesielt intravenøs injeksjon i hale-venen ofte en mer reproduserbar og tidseffektiv metode med metastatisk spredning som vanligvis forekommer i løpet av noen uker. Men siden den intravenøse injeksjonsmodellen omgår de første trinnene i den metastatiske kaskaden, må det tas hensyn til å tolke resultatene av disse studiene. I denne demonstrasjonen viser vi hale-vene injeksjon av mammary tumor celler sammen med en nøyaktig og omfattende analysemetode.
Selv om forskersamfunnet har gjort betydelige fremskritt i å forstå den komplekse prosessen med brystkreftmetastase, anslås det at over 150.000 kvinner for tiden har metastatisk brystkreft16. Av de med stadium IV brystkreft har >36% av pasientene lungemetastase17; Det stedsspesifikke mønsteret og forekomsten av metastaser kan imidlertid variere basert på molekylær undertype18,19,20,21. Pasienter med brystkreft-assosierte lungemetastaser har en median overlevelse på bare 21 måneder som fremhever behovet for å identifisere effektive behandlinger og nye biomarkører for denne sykdommen17. Bruken av eksperimentelle metastasemodeller, inkludert intravenøs injeksjon av tumorceller, vil fortsette å fremme vår kunnskap om denne viktige kliniske utfordringen. Kombinert med digital avbildningspatologi og metoden for metastatisk lungesvulstbyrdeanalyse beskrevet i denne protokollen, er hale-vene injeksjoner et verdifullt verktøy for brystkreftmetastaseforskning.
Etter hvert som forskere fortsetter å bruke intravenøs injeksjon av tumorceller som en eksperimentell modell for metastase, mangler standard praksis for å analysere den resulterende metastatiske tumorbyrden. I noen tilfeller kan signifikante forskjeller i metastatisk tumorbyrde ved manipulering av bestemte cellelinjer og/eller bruk av kjemiske forbindelser observeres makroskopisk. Men i andre tilfeller kan subtile forskjeller i metastatisk såing og vekst overses eller feiltolkes uten grundig patologisk analyse. Denne…
The authors have nothing to disclose.
Representative data ble finansiert gjennom National Cancer Institute (K22CA218549 til S.T.S). I tillegg til deres hjelp til å utvikle den omfattende analysemetoden som rapporteres her, takker vi Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Direktør – Krista La Perle, DVM, PhD) for histologi- og immunhiistokjemitjenester og Patologiavbildningskjernen for algoritmeutvikling og analyse.
alcohol prep pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | for cleaning tail prior to injection |
dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | for mouse dissection and lung tissue inflation |
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013CV | cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Fisher Scientific | MT21030CV | used for resuspending tumor cells for injection |
ethanol (70 % solution) | OSU | used to minimize mouse's fur during dissection; use caution – flammable | |
Evan's blue dye | Millipore Sigma | E2129 | used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution – dangerous reagent |
Fetal Bovine Serum | Millipore Sigma | F4135 | cell culture media additive; used at 10% in DMEM |
forceps | Fisher Scientific | 10-270 | for dissection and lung tissue inflation |
FVB/NJ mice | The Jackson Laboratory | 001800 | syngeneic mouse strain for MVT1 cells |
hemacytometer (Bright-Line) | Millipore Sigma | Z359629 | for use in cell culture to obtain cell counts |
insulin syringe (28 G) | Fisher Scientific | 14-829-1B | for tail-vein injections (BD 329424) |
MDA-MB-231 cells | ATCC | human breast cancer cell line | |
MVT1 cells | mouse mammary tumor cells | ||
needles (26 G) | Fisher Scientific | 14-826-15 | used to inflate the mouse's lungs |
neutral buffered formalin (10%) | Fisher Scientific | 245685 | used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution – dangerous reagent |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource |
Penicillin Streptomycin 100x | ThermoFisher | 15140163 | cell culture media additive |
sterile gauze | Fisher Scientific | NC9379092 | for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs |
syringe (5 mL) | Fisher Scientific | 14-955-458 | used to inflate mouse lung tissue |
tail-vein restrainer | Braintree Scientific, Inc. | TV-150 STD | used to restrain mouse for tail-vein injections |
Trypan blue (0.4 %) | ThermoFisher | 15250061 | used in cell culture to assess viability |
Trypsin-EDTA 0.25 % | ThermoFisher | 25200-114 | used in cell culture to detach tumor cells from plate |