Patologisk analys av lungmetastasering efter lateral svansveninjektion av tumörceller

Summary

Intravenös injektion av cancerceller används ofta i metastaseringsforskning, men den metastaserande tumörbördan kan vara svår att analysera. Häri visar vi en tail-vein injektion modell av metastasering och inkluderar en ny metod för att analysera den resulterande ögonbevarande lung tumör bördan.

Abstract

Metastasering, den främsta orsaken till sjuklighet och dödlighet för de flesta cancerpatienter, kan vara utmanande att modellera prekliniskt hos möss. Få spontana metastaseringsmodeller finns tillgängliga. Således är den experimentella metastaseringsmodellen som involverar svansvenininjektion av lämpliga cellinjer en stöttepelare i metastaseringsforskning. När cancerceller injiceras i den laterala svansvenen är lungan deras föredragna plats för kolonisering. En potentiell begränsning av denna teknik är den exakta kvantifieringen av den ögonbevarande lungtumörbördan. Medan vissa utredare räknar makrometastaser av en fördefinierad storlek och/eller inkluderar mikrometastaser efter vävnadssektion, bestämmer andra området för ögonbevarande lesioner i förhållande till normalt vävnadsområde. Båda dessa kvantifieringsmetoder kan vara mycket svåra när den metastaserande bördan är hög. Häri visar vi en intravenös injektion modell av lung metastasering följt av en avancerad metod för att kvantifiera ögonbevarande tumör börda med hjälp av bild analys programvara. Denna process möjliggör undersökning av flera slutpunktsparametrar, inklusive genomsnittlig metastaseringsstorlek, totalt antal metastaser och totalt metastaseringsområde, för att ge en omfattande analys. Dessutom har denna metod granskats av en veterinärpatolog som certifierats av American College of Veterinary Pathologists (SEK) för att säkerställa noggrannhet.

Introduction

Trots att det är en mycket komplex och ineffektiv ^process1, är metastasering en betydande bidragande orsak till sjuklighet och dödlighet hos ^{cancerpatienter2}. Faktum är att de flesta cancerrelaterade dödsfall tillskrivs metastaserad spridning av ^sjukdom3,4. För att tumörceller framgångsrikt ska kunna metastasera måste de lossna från den primära platsen, invadera genom angränsande stroma, intravasate in i blodcirkulationen eller lymfatiska, resa till kapillärbädden på en sekundär plats, extravasate in i den sekundära vävnaden och föröka sig eller växa till att bilda ögonbevarande ^lesioner5. Användningen av musmodeller har varit avgörande för att främja förståelsen av de molekylära mekanismer som ansvarar för metastaserad sådd och ^tillväxt6,7. Häri fokuserar vi på bröstcancermetastasering, för vilka både genetiskt modifierade musmodeller och transplantationsmetoder ofta används – var och en med sin egen uppsättning fördelar och begränsningar.

Genetiskt konstruerade brösttumörmodeller använder sig av bröstkörtelspecifika promotorer, inklusive MMTV-LTR (musäggstumörvirus lång terminal upprepning) och WAP (Whey Acidic Protein), för att driva uttryck av transgener i bröst epitelium8. Onkogener inklusive polyom mellersta T antigen (PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 och simian virus 40 (SV40) har uttryckts på detta sätt9,10,11,12,13, och medan dessa genetiska modeller är användbara för att studera primära tumör initiering och progression, är det få lätt metastasize till avlägsna organ. Dessutom är dessa genetiska musmodeller ofta mer tids- och kostnadsöverkomliga än spontana eller experimentella metastaseringsmodeller. Med tanke på begränsningen av de flesta genetiskt konstruerade brösttumörmodeller för att studera metastasering har transplantationstekniker blivit attraktiva metoder för att studera denna komplexa process. Detta inkluderar ortopisk, svansven, intrakarkiac och intrakraniell injektion av lämpliga cellinjer.

Även om flera bröstcancer cellinjer lätt metastasize efter orthotopic injektion i bröst fett ^pad14,15, konsistensen och reproducerbarheten av ögonbevarande tumör börda kan vara en utmaning, och varaktigheten av sådana studier kan vara i storleksordningen flera månader. För utvärdering av lungmetastasering är i synnerhet intravenös injektion i svansvenen ofta en mer reproducerbar och tidseffektiv metod med metastaserad spridning som vanligtvis förekommer inom loppet av några veckor. Eftersom den intravenösa injektionsmodellen kringgår de första stegen i den metastaserade kaskaden måste dock man vara försiktig med att tolka resultaten av dessa studier. I denna demonstration visar vi tail-vein injektion av bröst tumör celler tillsammans med en exakt och omfattande metod för analys.

Även om forskarsamhället har gjort betydande framsteg när det gäller att förstå den komplexa processen med bröstcancermetastasering, uppskattas det att över 150 000 kvinnor för närvarande har metastaserad ^{bröstcancer16}. Av dem med stadium IV bröstcancer har >36% av patienterna lungmetastasering17; Det platsspecifika mönstret och incidensen av metastaser kan dock variera beroende på molekylär subtyp18,19,20,21. Patienter med bröstcancerassocierade lungmetastaser har en medianöverlevnad på endast 21 månader vilket belyser behovet av att identifiera effektiva behandlingar och nya biomarkörer för denna ^sjukdom17. Användningen av experimentella metastasering modeller, inklusive intravenös injektion av tumörceller, kommer att fortsätta att öka vår kunskap om denna viktiga kliniska utmaning. I kombination med digital bildbehandling patologi och metoden för metastaserad lung tumör börda analys beskrivs i detta protokoll, tail-vein injektioner är ett värdefullt verktyg för bröstcancer metastasering forskning.

Protocol

Djuranvändning följde ULAR-förordningar (University Laboratory Animal Resources) enligt OSU Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) -godkänt protokoll 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore). 1. Svansveninjektion av bröstcancerceller Beredning av celler och spruta för injektion Plätera ett lämpligt antal celler baserat på antalet möss och cellkoncentrationer som ska användas.OBS: Antalet celler som injiceras och tiden till utvecklingen av metastaser be…

Representative Results

Om du använder omärkta celler för injektion med svansven kan det vara svårt att bekräfta lungkolonisering förrän (1) tidpunkten för obduktionen om makrometastaser kan observeras eller (2) efter histologisk analys om mikroskopiska metastaser finns. Med omfattande metastaserad lungtumörbörda kommer möss att ha ansträngd andning. Som med alla tumörstudier bör möss övervakas noggrant under hela studiens varaktighet. Användningen av märkta celler är ett enkelt sätt att bekräfta framgångsrik svansveninjek…

Discussion

Eftersom forskare fortsätter att använda intravenös injektion av tumörceller som en experimentell modell för metastasering saknas standardpraxis för att analysera den resulterande metastaserande tumörbördan. I vissa fall kan betydande skillnader i metastaserande tumör börda vid manipulering av vissa cellinjer och/eller användning av kemiska föreningar observeras makroskopiskt. I andra fall kan dock subtila skillnader i metastaserad sådd och tillväxt förbises eller misstolkas utan grundlig patologisk analys…

Materials

alcohol prep pads	Fisher Scientific	22-363-750	for cleaning tail prior to injection
dissection scissors	Fisher Scientific	08-951-5	for mouse dissection and lung tissue inflation
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Fisher Scientific	MT10013CV	cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x	Fisher Scientific	MT21030CV	used for resuspending tumor cells for injection
ethanol (70 % solution)	OSU		used to minimize mouse's fur during dissection; use caution – flammable
Evan's blue dye	Millipore Sigma	E2129	used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution – dangerous reagent
Fetal Bovine Serum	Millipore Sigma	F4135	cell culture media additive; used at 10% in DMEM
forceps	Fisher Scientific	10-270	for dissection and lung tissue inflation
FVB/NJ mice	The Jackson Laboratory	001800	syngeneic mouse strain for MVT1 cells
hemacytometer (Bright-Line)	Millipore Sigma	Z359629	for use in cell culture to obtain cell counts
insulin syringe (28 G)	Fisher Scientific	14-829-1B	for tail-vein injections (BD 329424)
MDA-MB-231 cells	ATCC		human breast cancer cell line
MVT1 cells			mouse mammary tumor cells
needles (26 G)	Fisher Scientific	14-826-15	used to inflate the mouse's lungs
neutral buffered formalin (10%)	Fisher Scientific	245685	used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution – dangerous reagent
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	The Jackson Laboratory	005557	maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource
Penicillin Streptomycin 100x	ThermoFisher	15140163	cell culture media additive
sterile gauze	Fisher Scientific	NC9379092	for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs
syringe (5 mL)	Fisher Scientific	14-955-458	used to inflate mouse lung tissue
tail-vein restrainer	Braintree Scientific, Inc.	TV-150 STD	used to restrain mouse for tail-vein injections
Trypan blue (0.4 %)	ThermoFisher	15250061	used in cell culture to assess viability
Trypsin-EDTA 0.25 %	ThermoFisher	25200-114	used in cell culture to detach tumor cells from plate