Imagerie Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos Imaging Intra
Summary
Le but de ce protocole est d’injecter de la globulaire conjuguée à la rhodamine dans les embryons de Drosophila et l’assemblage intranucléaire de tige d’actine d’image suivant le stress thermique.
Abstract
Le but de ce protocole est de visualiser les tiges intranucléaires d’actine qui se réunissent dans les embryons vivants de Drosophila melanogaster suivant le stress thermique. Les tiges d’actine sont la marque d’une réponse de stress actin (ASR) conservée et inductible qui accompagne les pathologies humaines, y compris les maladies neurodégénératives. Précédemment, nous avons montré que l’ASR contribue aux échecs de morphogenèse et à la viabilité réduite des embryons en développement. Ce protocole permet d’étudier en continu les mécanismes sous-jacents à l’assemblage des tiges d’actine et à l’ASR dans un système modèle très sensible à l’imagerie, à la génétique et à la biochimie. Les embryons sont recueillis et montés sur un coverslip pour les préparer à l’injection. L’actine globulaire conjuguée à la rhodamine (G-actinRed)est diluée et chargée dans un microneedle. Une seule injection est effectuée au centre de chaque embryon. Après injection, les embryons sont incubés à haute température et les tiges d’actine intranucléaire sont ensuite visualisées par microscopie confoccale. La récupération de la fluorescence après des expériences de photobleaching (FRAP) peut être effectuée sur les tiges d’actine; et d’autres structures riches en actine dans le cytoplasme peuvent également être photographiées. Nous constatons que G-actinRed polymérise comme la G-actine endogène et n’interfère pas, à lui seul, avec le développement normal de l’embryon. Une limitation de ce protocole est que le soin doit être pris pendant l’injection pour éviter des dommages graves à l’embryon. Cependant, avec la pratique, l’injection de G-actinRouge dans les embryons de Drosophila est un moyen rapide et fiable de visualiser les tiges d’actine et peut facilement être utilisé avec des mouches de n’importe quel génotype ou avec l’introduction d’autres contraintes cellulaires, y compris l’hypoxie et le stress oxydatif.
Introduction
Ce protocole décrit comment injecter G-actinRed pour visualiser l’assemblage de tiges d’actine intranucléaires dans les embryons stressés par la chaleur qui subissent une réponse inductible au stress actin (ASR)1. Nous avons développé ce protocole pour faciliter les études de l’ASR, qui dans les embryons conduit à une morphogenèse perturbée et une viabilité réduite, et dans les types de cellules humaines adultes est associée à des pathologies, y compris l’insuffisancerénale 2, myopathies musculaires3, et la maladie d’Alzheimer et de Huntington4,5,6,7,8. Cet ASR est induit par de nombreuses contraintes cellulaires, y compris le chocthermique 9,10,11, stress oxydatif4,6, réduction de la synthèse ATP12, et anormal Huntingtin ou oligomérisation β-amyloïde4,5,6,7,9,13,14,15,16. Une caractéristique de l’ASR est l’assemblage de tiges d’actine aberrantes dans le cytoplasme ou le noyau des cellules affectées, qui est entraînée par l’hyperactivation induite par le stress d’une protéine actin interagissant, Cofilin1,5,6,10. Malheureusement, des lacunes importantes subsistent en matière de connaissances concernant le RSE. Par exemple, la fonction des tiges d’actine n’est pas connue. Nous ne comprenons pas pourquoi les tiges se forment dans le cytoplasme de certains types de cellules, mais le noyau d’autres. Il n’est pas clair non plus si l’ASR est protecteur ou inadapté pour les cellules ou les embryons soumis à un stress. Enfin, nous ne connaissons toujours pas les mécanismes détaillés sous-jacents à l’hyperactivation cofiline ou à l’assemblage de tiges d’actine. Ainsi, ce protocole fournit un essai rapide et polyvalent pour sonder l’ASR en visualisant la formation et la dynamique de tige d’actine dans le système expérimental hautement tractable de l’embryon vivant de mouche de fruit.
Le protocole de microinject G-actinRouge dans les embryons vivants de Drosophila a été initialement développé pour étudier la dynamique des structures normales d’actine cytoplasmique17 pendant des événements de construction de tissu. Dans ces études, nous avons constaté que l’injection rouge de G-actin n’a pas affecté défavorablement des processus développementaux tôt dans l’embryon, y compris la cytokinésie ou la gastrulation17,18. Nous avons ensuite modifié le protocole, en adaptant la manipulation de l’embryon etl’injection rouge de G-actine pour permettre l’imagerie des tiges d’actine dans les embryons stressés par la chaleur subissant l’ASR1. D’autres méthodes que l’injection de G-actin Red peuvent être utilisées pour visualiser l’actine chez les embryons. Ces méthodes reposent sur l’expression de protéines fluorescentes (FPs) étiquetées à l’actine ou à des domaines de protéines liant l’actine, telles que utrophine-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP, et Moesin-GFP (examinédans 19). Toutefois, l’utilisation de ces sondes FP exige de la prudence parce qu’elles peuvent stabiliser ou perturber certaines structures d’actine, ne pas étiqueter également toutes les structures d’actine20, et dans le cas de l’actin-GFP, sont fortement surexprimées – problématiques pour l’analyse de l’assemblage de tiges qui dépend non seulement du stress, mais aussi de la concentration d’actinedépendante 1. Ainsi, G-actinRed est la sonde préférée pour les études de tige dans les embryons de mouche, et la grande taille de l’embryon permet son injection facile.
Le flux de travail de ce protocole est similaire à d’autres techniques bien établies de microinjection qui ont été utilisées pour injecter des protéines, des acides nucléiques, des médicaments et des indicateurs fluorescents dans les embryons de Drosophile 21,22,23,24,25,26,27. Cependant, à la suite de la microinjection de G-actinRouge ici, les embryons sont exposés à un léger stress thermique pour induire l’ASR et l’assemblage intranucléaire de tige d’actine. Pour les laboratoires ayant accès aux mouches et une plate-forme d’injection, cette méthode devrait être facilement implémentable et adaptable pour des lignes d’étude spécifiques en ce qui concerne l’ASR, y compris son induction par différents stress ou modulation dans des milieux génétiques distincts.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’importance de cette méthode est qu’elle utilise le protocole bien établi de microinjection chez les embryons de Drosophile 21 , 22,23,24,25,26,27pour permettre de nouvelles recherches concernant l’ASR et l’assemblage de tiges d’actine qui l’accompagnent. Un avantage …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent avec gratitude le travail de Liuliu Zheng et Zenghui Xue, qui ont contribué au pionnier de cette technique dans le laboratoire Sokac, ainsi que Hasan Seede qui a aidé à l’analyse. Les travaux de cette étude sont financés par une subvention des NIH (R01 GM115111).
Materials
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24×50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4×10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
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