살아있는 열에 있는 화상 진찰 내 핵 액틴 막대는 Drosophila 배아를 강조했습니다
Summary
이 프로토콜의 목표는 열 응력에 따라 드로소필라 배아및 이미지 내 핵 액틴 로드 어셈블리에 로다민-컨쥬게이드 구형 액틴을 주입하는 것입니다.
Abstract
이 프로토콜의 목적은 열 응력에 따라 살아있는 Drosophila 멜라노가스터 배아에서 조립되는 핵 액틴 막대를 시각화하는 것입니다. 액틴 로드는 신경 퇴행성 질환을 포함한 인간의 병리학과 함께 제공되는 보존되고 유도할 수 없는 액틴 스트레스 반응(ASR)의 특징입니다. 이전에, 우리는 ASR이 태아 발달의 형태 발생 실패 및 감소된 생존에 기여한다는 것을 보여주었습니다. 이 프로토콜은 이미징, 유전학 및 생화학에 매우 순종하는 모델 시스템에서 근본적인 actin 막대 조립 및 ASR 메커니즘의 지속적인 연구를 허용합니다. 배아는 주사를 준비하기 위해 커버슬립에 수집되고 장착됩니다. 로다민-컨쥬게이드 구형 액틴(G-actinRed)은희석되어 마이크로니들로 적재된다. 단일 주사는 각 태아의 중심으로 이루어집니다. 주사 후, 배아는 높은 온도에서 배양되고 핵 내 액틴 막대는 공초점 현미경 검사법에 의해 시각화됩니다. 광표백 후형화 회복(FRAP) 실험은 액틴 봉상에서 수행될 수 있다; 및 세포질에 있는 그밖 액틴이 풍부한 구조물은 또한 심상일 수 있습니다. 우리는 G-actin빨간 내인성 G-actin 같이 중합하고, 그 자체로, 일반적인 배아 발달을 방해하지 않는다는 것을 것을을 발견합니다. 이 프로토콜의 한 가지 제한은 태아에 심각한 부상을 피하기 위해 주입 중에주의를 기울여야한다는 것입니다. 그러나, 연습으로, Drosophila 배아에 G-액틴레드를 주입하는 것은 actin 막대를 시각화하는 빠르고 신뢰할 수있는 방법이며, 쉽게 어떤 유전자형의 파리또는 저산소증과 산화 스트레스를 포함한 다른 세포 스트레스의 도입과 함께 사용할 수 있습니다.
Introduction
이 프로토콜은 유도할 수 없는 액틴 응력 반응(ASR)1을겪고 있는 열 응력 배아에서 핵액틴 봉의 조립을 시각화하기 위해 G-actinRed를 주입하는 방법을 설명합니다. 우리는 배아에서 성기능 장애를 일으키고 생존력을 감소시키는 ASR의 연구를 돕기 위해 이 프로토콜을 개발했으며, 성인 인간 세포 유형은 신부전2,근육 근병증3,알츠하이머 및 헌팅턴병4,5,6,7,8을포함한 병리와 관련이 있다. 이러한 ASR은 열 충격9,10,11,산화 스트레스4,6,감소된 ATP 합성12,비정상적인 헌팅틴 또는 β-아밀로이드 올리고머화4,5,6,7,9,13,14, 15,16을포함한 수많은 세포응력에의해 유도된다. ASR의 특징은 반응하는 세포의 세포질 또는 핵에서 비정상적인 액틴 봉의 조립으로, 이는 작용 단백질, 코필린1,5,6,10의스트레스 유발 과잉 활성화에 의해 구동된다. 안타깝게도 ASR에 대한 주요 지식 격차는 여전히 남아 있습니다. 예를 들어 액틴 로드의 기능은 알려져 있지 않습니다. 우리는 왜 막대가 몇몇 세포 모형의 세포질에서 형성하는지 이해하지 않습니다, 그러나 그 외의 핵. ASR이 스트레스를 받고 있는 세포 또는 배아에 대한 보호또는 적응력이 있는지도 분명하지 않습니다. 마지막으로, 우리는 여전히 Cofilin 하이퍼 활성화 또는 액틴 로드 어셈블리의 기본 상세한 메커니즘을 모른다. 따라서, 이러한 프로토콜은 살아있는 과일 플라이 배아의 고도로 인가가능한 실험 시스템에서 액틴 로드 형성 및 역학을 시각화하여 ASR을 조사하는 신속하고 다재다능한 분석법을 제공한다.
살아있는 Drosophila 배아로 G-actinRed를 마이크로젝트하는 프로토콜은 조직 건물 이벤트 도중17의 일반적인 세포질 액틴 구조물의 역학을 연구하기 위하여 처음에 개발되었습니다. 그 연구 결과에서, 우리는 G-actin적부분이 세포동체증 또는 위화17,18을포함하여 태아의 초기 발달 과정에 부정적인 영향을 미치지 않았다는 것을 것을을 발견했습니다. 그런 다음 프로토콜을 수정하여 ASR1을겪고 있는 열 스트레스 배아에서 액틴 봉의 이미징을 허용하기 위해 배아 처리 및 G-actin적주입을 조정한다. G-actin빨간 주입 외에 다른 방법은 배아에서 액틴을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 방법은 유트로핀-mCherry, Lifeact, F-로틴-GFP 및 모에신-GFP(19에서 검토됨)와 같은 액틴 결합 단백질의 영역또는 액틴 결합 단백질의도메인에 태그된 형광 단백질(FPs)을 발현하는 데 의존합니다. 그러나, 이러한 FP 프로브를 사용하면 일부 액틴 구조를 안정화하거나 방해할 수 있기 때문에 주의가 필요하며, 모든 액틴구조(20)를동등하게 라벨화하지 않으며, 액틴-GFP의 경우 스트레스 의존일뿐만 아니라 액틴 농도의존도 1인로드 어셈블리의 분석에 문제가 된다. 따라서, G-actinRed는 플라이 배아에서 막대 연구를 선호하는 프로브이며, 배아의 큰 크기는 쉽게 주입할 수 있다.
이 프로토콜의 워크플로우는 단백질, 핵산, 약물 및 형광 지표를 Drosophila 배아21,22,23,24,25,26,27에주입하는 데 사용되어 온 다른 잘 확립된 미세 주입 기술과 유사합니다. 그러나, 여기서 G-actinRed의 미세 주입에 이어, 배아는 ASR 및 핵내 액틴 로드 조립을 유도하기 위해 온화한 열 응력에 노출된다. 파리와 사출 장비에 접근할 수 있는 실험실의 경우, 이 방법은 ASR과 관련하여 특정 연구 라인에 대해 쉽게 구현가능하고 적응할 수 있어야 하며, 여기에는 다른 스트레스 또는 뚜렷한 유전 적 배경의 변조에 의한 유도가 포함됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법의중요성은 드로소필라 배아21,22, 23,24,25,26, 27에서 미세 주입의 잘 확립 된 프로토콜을 활용하여 ASR 및 동반 액틴 로드 조립에 관한 새로운 연구를 가능하게한다는 것입니다. 살아있는 배아에 G-actinRed를</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 소카크 연구소에서 이 기술을 개척하는 데 도움을 준 류류 정과 젠기이 쉬의 작품과 분석을 도운 하산 시데의 작품을 감사하게 인정합니다. 이 연구를 위한 일은 NIH (R01 GM15111)의 보조금에 의해 투자됩니다.
Materials
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24×50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4×10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
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