Makro-Rheology Karakterisering af Gill Raker Slim i Sølv Karper, Hypophthalmichthys molitrix
Summary
Denne protokol præsenterer en metode til at udføre rheologi karakterisering af slim, der er bosat på gill rakers (GRs) af sølv karper. Viskoelastic egenskaber ved GR-slim, opnået ved måling af viskositet, opbevaring og tab moduli, evalueres for den tilsyneladende udbytte stress til at forstå filter fodring mekanisme i GRs.
Abstract
Sølvkarpen, Hypophthalmichthys molitrix, er en invasiv planktivorøs filterføderfisk, der angreb de naturlige vandveje i det øvre Mississippi-flodbassin på grund af dets meget effektive filterfodringsmekanisme. De karakteristiske organer kaldet gill rakers (GRs), der findes i mange sådanne filterfødere, letter effektiv filtrering af fødevarepartikler som fytoplankton, der er af få mikron i størrelse.
Motivationen til at undersøge RHEology af GR slim stammer fra vores ønske om at forstå sin rolle i medvirken til filter fodring proces i sølv karper. Den slim-rige væske, i en ‘tyk og klæbrig’ tilstand kan lette vedhæftning af fødevarer partikler. Permeation og transport gennem GR-membranen lettes ved virkningen af eksterne forskydningskræfter, der fremkalder varierende forskydningsbelastningshastigheder. Derfor kan slim rheology give et vigtigt fingerpeg om den enorme udkonkurrerende karakter af sølvkarpen i puljen af filterfodringsfisk. På grundlag af dette blev det fremført, at GR slim kan give en klæbefunktion til fødevarepartikler og fungere som et transportkøretøj for at hjælpe med filterfodringsprocessen.
Hovedformålet med protokollen er at bestemme slimets udbyttebelastning, der tilskrives den minimale forskydningsstress, der kræves for at indlede flow, hvor irreversibel plastdeformation først observeres på tværs af et struktureret viskoelastisk materiale. Derfor blev rheologiske egenskaber af GR slim, dvs viskositet, opbevaring og tab moduli, undersøgt for sin ikke-newtonske, forskydning-udtynding karakter ved hjælp af en roterende rheometer.
En protokol præsenteret her er ansat til at analysere de rheologiske egenskaber af slim udvundet fra gill rakers af en sølv karpe, fisket på Hart Creek placering af Missouri-floden. Protokollen har til formål at udvikle en effektiv strategi for rheologisk testning og materiel karakterisering af slim, der antages at være et struktureret viskoelastict materiale.
Introduction
Sølvkarpen, Hypophthalmichthys molitrix, er en planktivorous filterføder og en invasiv art, der har infiltreret flere naturlige vandveje i USA. Denne art blev oprindeligt indført i det øvre Mississippi-flodbassin for at kontrollere algeopblomstringer1,2,3. Sølvkarpen er en ekstremt effektiv føder. Typisk varierer dens forbrugsstoffer partikelstørrelser fra 4 til 20 μm til større zooplankton, der er omkring 80 μm3,4,5. Denne art har udkonkurreret andre indfødte fisk og kan potentielt forårsage enorme skader på indfødte vandveje ved at begrænse de tilgængelige ressourcer1,2,6. Således udgør filterfodring af fisk som sølvkarpen og bighead karpen en stor trussel mod de store søer1,2,6,7,8.
Filterfodringsfisk har specielle organer kaldet gill rakers (GRs) med et tyndt lag slim, der er bosiddende på deres overflade. Disse organer forbedrer effektiviteten af filtrering og sammenlægning af små partikler fra den indkommende væske. Målet med protokollen præsenteres heri er at karakterisere den ikke-newtonske, forskydning udtynding materiale ejendom og udbytte stress af GR slim erhvervet fra den indre overflade af gill rakers i sølv karpe. Værdien af udbytte stress af GR-slim, konstateret ved hjælp af en roterende rheometer, er af interesse i denne undersøgelse. Den målte udbyttebelastning, der også kaldes “tilsyneladende udbyttestress”, afhænger af testmetoderne, såsom stabil forskydningshastighed eller dynamisk oscillatorisk stammetype9,10. Den forskydning-udtynding, ‘udbytte-stress væske,’ gennemgår en overgang fra fast-lignende til væske-lignende adfærd på en kritisk anvendt stress9,11. Den tilsyneladende udbytte stress er den mindste forskydning stress kræves for at indlede flow eller den, hvor irreversibel plast deformation først observeres, når slim overgange fra en gel-lignende materiale til en væske-lignende materiale. Denne adfærd kan observeres i strukturerede viskoelastiske materialer. Overgangen fra gel-lignende til væske-lignende adfærd GR slim indebærer to funktioner, dvs en klæbende rolle at samle fødevarer partikler og en transport køretøj rolle til at hjælpe med partikel levering og filtrering proces. Slimets udvidede funktion omfatter oprettelse af diffusionsbarrierer i sygdomsresistens og åndedræt, der giver kontrolleret frigivelse af ernæringsmæssige faktorer, giftige komponenter og udskillelse, skaber metaboliske veje til fodring og nesting, hjælper med rovdyrbeskyttelse og producerer grænselagsændringer, der forbedrer bevægelse og fremdriftseffektivitet12,13,14.
I modsætning til simple væsker, komplekse væsker som slim besidder egenskaber, der varierer med flow betingelser og kræver yderligere måling parametre til at definere deres bulk skala fysisk adfærd. For at overvåge gr slims viskositet og udbyttebelastning udføres rheologiske målinger ved hjælp af et rotationsrimeometer. Rotations rheometeret anvender en stabil eller oscillatorisk forskydningsbelastning eller belastning ved hjælp af en roterende disk i kontakt med væskeprøven og måler dens respons. Rationalet bag ved hjælp af dette instrument og teknik er, at rheometeret kan give et sæt målinger til at beskrive de materielle egenskaber af GR slim af sølv karper, som ikke kan defineres ved viskositet alene.
Slim er et viskoelastisk materiale, og dets mekaniske reaktion på en pålagt deformation er mellem en ren fast (styret af Hookes elasticitetslov) og en ren væske (styret af Newtons viskositetslov)15,16. Det komplekse makromolekylære netværk, der er indeholdt i slim, kan strække sig og omlægge som reaktion på eksterne kræfter eller deformation. Et rotationsrimeometer består af en keglegeometri og en Peltier-plade som vist i figur 1 og figur 2 (se tabel 1 for instrumenteringsspecifikationer). Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en protokol til bestemmelse af de rheologiske egenskaber af GR slim. En fordel ved rotationsrimetælleren i forhold til et viskometer er dets evne til at foretage dynamiske målinger ved hjælp af små prøvevolumener. GR slimprøvevolumenet i denne undersøgelse var ca. 1,4 mL. Viskometeret er derimod begrænset til konstante forskydningshastigheder og kræver store prøvemængder.
Slimets rheologiske egenskaber forventes at variere meget inden for sølvkarpeanatomien. For eksempel kan slimets egenskaber, der er bosiddende på GR-overfladerne, være forskellige fra epibranchialorganet. For at tage højde for den potentielle variation af slimegenskaber i forskellige områder af fisken blev den erhvervede GR slimprøve fortyndet, og opløsninger af tre koncentrationer blev skabt og testet ved hjælp af rotationsrometeret. De data og resultater vedrørende slim rheology rapporteret efter udførelse af protokollen demonstreret effekten af måling teknik. De illustrative data, der præsenteres i dette papir, er ikke beregnet til at blive generaliseret på tværs af hele sølvkarpepopulationen. Protokollen præsenteres heri kan udvides til at undersøge slim rheology på tværs af større prøve sæt til at teste andre hypoteser.
Formålet med denne undersøgelse er at påvise variationen af rheologiske egenskaber ved GR slim rheology med tre forskellige slimkoncentrationer (400 mg/mL, 200 mg/mL og 100 mg/mL). Koncentrationen på 400 mg/mL repræsenterer den rå slimprøve, der er høstet fra fiske-GR’erne. Deioniseret vand (DI), blev anvendt til at fortynde den rå slimprøve til 200 mg/mL og 100 mg/mL-koncentrationer. Fortynding af slimprøverne gjorde det muligt at vurdere graden af forskydningsfortyndning og tilsyneladende udbyttestress som funktion af koncentration og bestemmelse af den koncentration, hvor GR slim overgår til ikke-newtonsk adfærd. En shaker blev brugt til at nedbryde eventuelle store klumper af slim i prøverne for at afbøde fejl i de rheologiske data på grund af inhomogeneitet.
I de fleste hvirveldyr, herunder fisk, er de fremherskende slimdannende makromolekyler glycoproteiner (muciner), der har tendens til at svulme op i vand ved sammenfiltring eller kemisk krydsbinding og skabe et gellignende materiale12,13,17,18,19,20. Det højdybste, geldannende makromolekyler og højvandsindholdet afspejler glatheden islimet 13. En høj grad af intermakromolekkulære interaktioner fører til geldannelse , mens lavere niveauer af intermakromolekylære interaktioner eller brudte bindinger resulterer i højviskositetsvæsker21.
Processerne for filtrering af fødevarepartikler i filterfodringsfisk er hjulpet af GR slim-relaterede egenskaber som samhørighed og viskositet, der bestemmer dets potentiale for vedhæftning og tack22. Styrken af slimbaseret vedhæftning afhænger af specifikke intermolekylære, elektrostatiske eller hydrofobiske interaktioner23. Sanderson et al.24 gennemførte en suspension-fodring undersøgelse i blackfish hvori de fandt beviser for slim-baseret vedhæftning. De anførte, at vedhæftningen af svævestøv med slimhindeoverflade efterfølges af transport af aggregerede klumper af partikler bundet sammen med slim ved styret vandstrøm, der virker på den24. Slim udsat for forskydning stamme satser genereret fra vand-flow letter leveringen af fødevarer partikler til fordøjelsesorganerne. Endoskopiske teknikker blev brugt til at observere filtrerede partikler24.
Litteratur om rækken af forskydning satser og praktiske grænser i den rheological test af GR slim er knappe. Derfor blev vejledning søgt fra rheologiske undersøgelser af mave-, nasal- cervikal- og lunge slim, laks hud slim, hagfish slim, og knogle-fælles overflade smøremiddel, hvori rheological karakterisering og ikke-newtonske attributter blev undersøgt11,12,25,26,27,28,29,30,31. For nylig er effekten af fiskeskind slim på bevægelse og fremdrift effektivitet blevet undersøgt ved hjælp af konstant forskydning sats viscometri. Hud slim rheologi undersøgelser (uden fortynding eller homogenisering) vedrørende havørn, havabbor og mager demonstreret ikke-newtonsk adfærd ved typisk lave forskydningshastigheder14. I en anden relateret undersøgelse, den rå hud slim prøver fra dorsale og ventrale sider af den senegalesiske sål viste sig at udvise ikke-newtonsk adfærd, hvilket indikerer en højere viskositet af ventral slim på alle forskydning satser betragtes32. Andre rheologiske protokoller vedrørende hydrogel stillads udvikling og for stærkt koncentrerede suspensioner ved hjælp af en konstant forskydning sats viskometer er også blevet rapporteret i litteraturen33,34.
I denne undersøgelse blev GR slim egenskaber undersøgt ved hjælp af en stamme sats kontrolleret, roterende rheometer, der har været meget udbredt i rheology eksperimenter på komplekse biologiske væsker25. For newtonske væsker forbliver den tilsyneladende viskositet konstant, er forskydningsdelsafhængig, og forskydningsspændingerne varierer lineært med forskydningsbelastningshastigheder (Figur 3A, B). For ikke-newtonske væsker (f.eks. forskydningsfortyndende væsker) er viskositeten forskydningsafhængig eller deformationshistorisk afhængig (figur 3A, B). Tabsmodulus (G”) repræsenterer, i hvilket omfang materialet modstår tendensen til at flyde og er repræsentativ for flydende viskositet (figur 4). Opbevaringsmodulus (G’) repræsenterer materialets tendens til at genvinde sin oprindelige form efter stressinduceret deformation og svarer til elasticitet (figur 4). Fasevinklen (δ) eller tab tangent værdi, beregnes ud fra den inverse tangent af G”/G’. Det repræsenterer balancen mellem energitab og opbevaring og er også en fælles parameter for karakterisering af viskoelastiske materialer (δ = 0° for et hookean fast stof; δ = 90° for en tyktflydende væske; δ 45° for en viskoelastic væske) (Figur 4)25. Den tilsyneladende udbytte stress (σy) i strukturerede væsker repræsenterer en ændring af tilstand, der kan observeres i rheological data fra steady state sweep og dynamisk stress-stamme fejer10. Hvis den eksterne anvendte stress er mindre end den tilsyneladende udbytte stress, materialet vil deformere elastisk. Når stressen overstiger den tilsyneladende udbyttebelastning (markeret som “gennemsnitlig stress” i figur 3B), vil materialet skifte fra elastisk til plastisk deformation og begynde at flyde i sin flydende tilstand35. Måling af opbevaringsmodulus (G’) og tabsmodulus (G”) i slimprøven under oscillatoriske belastningsforhold (eller stamme) kvantificerer ændringen i materialetilstanden fra gellignende til viskoelastic væskelignende adfærd.
De typer rheometertest, der udføres for at overvåge data vedrørende lagermodulus (G’), tabsmodulus (G”) og tilsyneladende viskositet (η), er beskrevet her. De dynamiske svingningsprøver (stamme fejer og frekvens fejer) overvåges G ‘og G” under kontrolleret svingning af kegle geometri. De dynamiske belastningsundersøgelser målte slimets lineære viskoelastiske region (LVR) ved at overvåge det iboende materialerespons (figur 4). Stamme fejer blev brugt til at bestemme den givende adfærd ved konstant svingning frekvens og temperatur. De dynamiske frekvens sweep tests overvågede materialets reaktion på stigende frekvens (deformationshastighed) ved en konstant amplitud (stamme eller stress) og temperatur. Stamme blev opretholdt i den lineære viskoelastiske region (LVR) for den dynamiske frekvens feje tests. Steady-state forskydning sats tests overvåges den tilsyneladende viskositet (η) under konstant rotation af kegle geometri. GR slim blev udsat for trinvis stress trin og tilsyneladende viskositet (η, Pa’s) blev overvåget for varierende forskydning sats (ý, 1 / s).
Protokollen præsenteres i dette papir behandler GR slim som et komplekst struktureret materiale af ukendt viskoeasticitet med en vis lineær viskoelastic respons rækkevidde. Fisken slim blev udvundet fra GRs af sølv karper under en fiskeekspedition på Hart creek placering i Missouri-floden af professor L. Patricia Hernandez (Institut for Biologiske Videnskaber, The George Washington University) 1,2,36. En række GR’er inde i munden på en sølvkarpe er vist i figur 5A, og en skematisk tegning præsenteres i figur 5B. En udskåret GR er vist i figur 5C. Udvindingen af slim fra GR af sølvkarpen præsenteres som et eksempel i de skematiske tegninger, Figur 5D, E. Alle rheometertestene blev udført under en konstant, kontrolleret temperatur på 22 ± 0,002 °C , den temperatur, der blev registreret på fiskestedet1,2,36. Hver slimprøve blev testet tre gange med rheometeret, og de gennemsnitlige resultater præsenteres sammen med de statistiske fejllinjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Et af hovedformålene med udviklingen af denne protokol er at fastslå, at den er velegnet til den teologiske karakterisering af GR slim, når der foreligger meget små prøvemængder. Vi anerkender, at flere prøver fra en skole af sølv karper er nødvendige for fuldt ud at karakterisere de rheologiske egenskaber af GR slim og de data, der præsenteres heri er ikke en generalisering på tværs af hele sølv karpe befolkning. Vores teknik er berettiget på grund af dens effektivitet med rheologisk karakterisering af sm?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender støtte og finansiering fra GW Center for Biomimetics og Bioinspired Engineering. Vi takker professor L. Patricia Hernandez fra Institut for Biologiske Videnskaber ved George Washington University for at inspirere undersøgelsen og det igangværende samarbejde, give biologisk ekspertise om sølvkarpens fysiologi og levere slimprøverne. Vi takker de studerende, Mr. David Palumbo, Ms Carly Cohen, Mr. Isaac Finberg, Mr. Dominick Petrosino, Mr. Alexis Renderos, Ms Priscilla Varghese, Mr. Carter Tegen og Mr. Raghav Pajjur for hjælp i laboratoriet og Mr. Thomas Evans og Mr. James Thomas af TA Instruments, New Castle, DE for støtte med uddannelse og vedligeholdelse af rheometer. Billeder til figur 5A, C blev taget under en dissektion udført af professor L. Patricia Hernandez fra Institut for Biologiske Videnskaber ved George Washington University.
Materials
| Materials | |||
| Kim Wipes | VWR | 470224-038 | To clean Sample from plate |
| Gloves | VWR | 89428-750 | To prevent contamination of sample |
| Pipette | VWR | 89079-974 | To transport sample from vial to rheometer |
| Pipette Tips | Thermo Scientific | 72830-042 | To transport sample from vial to rheometer |
| Shaker | VWR | 89032-094 | To homogenously mix sample of mucus |
| Vials | VWR | 66008-710 | Contains measured sample volumes |
| Weigh Scale | Ohaus | Scout –SPX Balances | To weigh mass of mucus samples |
| Chemical Reagents | |||
| De-Ionized Water (H20) | – | – | Liquid |
| Sterile 70% Isopropanol (C3H8O) | VWR | 89108-162 | Liquid |
| GR Mucus | |||
| 100 mg/mL concentration, 2mL | – | – | Viscoelastic Material |
| 400 mg/mL concentration, 1mL | – | – | Viscoelastic Material |
| 200 mg/mL concentration, 1mL | – | – | Viscoelastic Material |
| Software | |||
| MATLAB | Mathworks | R2017a | Data analysis, post-processing and graphical representation |
| Trios | TA Instruments | v4.5.042498 | Rheometer instrument control and analysis software |
References
- Cohen, K. E., Hernandez, L. P. The complex trophic anatomy of silver carp, Hypophthalmichthys molitrix, highlighting a novel type of epibranchial organ. Journal of Morphology. 279, 1615-1628 (2018).
- Cohen, K. E., Hernandez, L. P. Making a master filterer: Ontogeny of specialized filtering plates in silver carp (Hypophthalmichthys molitrix). Journal of Morphology. 279, 925-935 (2018).
- Cremer, M., Smitherman, R. Food habits and growth of silver and bighead carp in cages and ponds. Aquaculture. 20 (1), 57-64 (1980).
- Battonyai, I., et al. Relationship between gill raker morphology and feeding habits of hybrid bigheaded carps (Hypophthalmichthys spp.). Knowledge and Management of Aquatic Ecosystems. 416, 36 (2015).
- Zhou, Q., Xie, P., Xu, J., Ke, Z., Guo, L. Growth and food availability of silver and bighead carps: Evidence from stable isotope and gut content analysis. Aquaculture Research. 40 (14), 1616-1625 (2009).
- Freedman, J. A., Butler, S. E., Wahl, D. H. . Impacts of invasive Asian carps on native food webs (Final Report). , (2012).
- Nico, L., Fuller, P., Li, J. . Silver carp (Hypophthalmichthys molitrix)-FactSheet. , (2017).
- Walleser, L., Howard, D., Sandheinrich, M., Gaikowski, M., Amberg, J. Confocal microscopy as a useful approach to describe gill rakers of Asian species of carp and native filter-feeding fishes of the upper Mississippi River system. Journal of Fish Biology. 85 (5), 1777-1784 (2014).
- Nelson, A. Z., Ewoldt, R. H. Design of yield-stress fluids: a rheology-to-structure inverse problem. Soft Matter. 13, 7578-7594 (2017).
- Chen, T. Rheological Techniques for Yield Stress Analysis. TA Instruments Applications Note, RH025. , (2020).
- Ewoldt, R. H., Johnston, M. T., Caretta, L. M., Spagnolie, S. Experimental challenges of shear rheology: how to avoid bad data. Complex Fluids in Biological Systems. , (2015).
- Thornton, D. J., Sheehan, J. K. From Mucins to Mucus: Toward a more coherent understanding of this essential barrier. Proceedings of the American Thoracic Society. 1, 54-61 (2004).
- Shepard, K. L. Functions for fish mucus. Reviews in Fish Biology and Fisheries. 4, 401-429 (1994).
- Fernández-Alacid, L., et al. Skin mucus metabolites in response to physiological challenges: A valuable non-invasive method to study teleost marine species. Science of the Total Environment. 644, 1323-1335 (2018).
- Wagner, C. E., Wheeler, K. M., Ribbeck, K. Mucins and Their Role in Shaping the Functions of Mucus Barriers. Annual Reviews in Cell and Developmental Biology. 34, 189-215 (2018).
- Bird, R. B., Armstrong, R. C., Hassager, O. . Dynamics of Polymeric Liquids, Volume 1: Fluid Mechanics. , 1255-1284 (1987).
- Mantle, M., Allen, A. Isolation and characterisation of the native glycoprotein from pig small intestinal mucus. Biochemical Journal. 195, 267-275 (1981).
- Allen, A., Hutton, D. A., Pearson, J. P., Sellers, L. A., Nugent, J., O’Conner, M. Mucus glycoprotein structure, gel formation and gastrointestinal mucus function. Mucus and Mucosa (Ciba Foundation Symposium). , 137-156 (1984).
- Asakawa, M. Histochemical studies of the mucus on the epidermis of eel, Anguillajaponica. Bulletin of Japanese Society of Scientific Fisheries. 36, 83-87 (1970).
- Fletcher, T. C., Jones, R., Reid, L. Identification of glycoproteins in goblet cells of epidermis and gill of plaice (Pleuroneces platessa L.), flounder (Platichthys flesus (L.)) and rainbow trout (Salmo gairdneri Richardson). Histochemical Journal. 8, 597-608 (1976).
- Silberberg, A. Mucus glycoprotein, its biophysical and gel forming properties. Symposia of the Society for Experimental Biology. 43, 43-64 (1989).
- Hills, B. . The Biology of Surfactants. , 408 (1988).
- Aubert, H., Brook, A. J., Shephard, K. L. Measurement of the adhesion of a desmid to a substrate. British Phycology Journal. 24, 293-295 (1989).
- Sanderson, S. L., Cech, J. J., Patterson, M. R. Fluid dynamics in suspension feeding black fish. Science. 251, 1346-1348 (1991).
- Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (2), 86-100 (2009).
- Chaudhary, G., Ewoldt, R. H., Thiffeault, J. L. Unravelling hagfish slime. Journal of Royal Society Interface. 16 (150), 20180710 (2019).
- Downing, S., Salo, W., Spitzer, R., Koch, E. The hagfish slime gland: a model system for studying the biology of mucus. Science. 214, 1143-1145 (1981).
- Hwang, S. H., Litt, M., Forsman, W. C. Rheological properties of mucus. Rheologica Acta. 8, 438-448 (1969).
- Litt, M. Mucus rheology. Archives of Internal Medicine. 126, 417-423 (1970).
- Quarishi, M. S., Jones, N. S., Mason, J. The rheology of nasal mucus: a review. Clinical Otolaryngology. 23, 403-413 (1998).
- Nordgård, C. T., Draget, K. I., Seternes, T. Rheology of salmon skin mucus. Annual Transactions – The Nordic Rheology Society. 23, 175-179 (2015).
- Fernández-Alacid, L., et al. Comparison between properties of dorsal and ventral skin mucus in Senegalese sole: Response to an acute stress. Aquaculture. 513, 734410 (2019).
- Yüce, C., Willenbacher, N. Challenges in Rheological Characterization of Highly Concentrated Suspensions – Case Study for Screen-printing Silver Pastes. Journal of Visualized Experiments. (122), e55377 (2017).
- Sultan, S., Mathew, A. P. 3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds. J. Vis. Exp. (146), (2019).
- Barnes, H. A., Hutton, J. F., Walters, K. . An Introduction to Rheology. , (1989).
- USGS Current Conditions for USGS 06910450 Missouri River at Jefferson City, MO. U.S. Geological Survey Available from: https://nwis.waterdata.usgs.gov/usa/nwis/uv/?cb_00010=on&cb_00060=on&cb_00065=on&format=gif_default&site_no=0691045&p09-19&end_date=2018-09-21 (2020)
