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Engineering

Caractérisation macro-rhéologique du mucus gill raker chez la carpe argentée, Hypophthalmichthys molitrix

Published: July 10, 2020 doi: 10.3791/61379
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, The George Washington University

Summary

Ce protocole présente une méthode pour effectuer la caractérisation rhéologique du mucus qui réside sur les râteaux branchiaux (GR) de la carpe argentée. Les caractéristiques viscoélastiques du MUCUS GR, obtenues en mesurant la viscosité, le stockage et les modules de perte, sont évaluées pour la limite d’élasticité apparente afin de comprendre le mécanisme d’alimentation du filtre dans les GR.

Abstract

La carpe argentée, Hypophthalmichthys molitrix,est un poisson filtre planktivore envahissant qui a infesté les cours d’eau naturels du bassin supérieur du Mississippi en raison de son mécanisme d’alimentation par filtre très efficace. Les organes caractéristiques appelés râteaux branchiaux (GR), que l’on trouve dans de nombreux filtreurs de ce type, facilitent la filtration efficace des particules alimentaires telles que le phytoplancton de quelques microns.

La motivation pour étudier la rhéologie du mucus GR provient de notre désir de comprendre son rôle dans l’aide au processus d’alimentation par filtre chez la carpe argentée. Le liquide riche en mucus, dans un état « épais et collant » peut faciliter l’adhésion des particules alimentaires. La perméation et le transport à travers la membrane GR sont facilités par l’action de forces de cisaillement externes qui induisent des taux de déformation de cisaillement variables. Par conséquent, la rhéologie du mucus peut fournir un indice vital sur la nature extrêmement compensante de la carpe argentée dans le bassin de poissons filtreurs. Sur cette base, il a été postulé que le mucus GR peut fournir une fonction adhésive aux particules alimentaires et agir comme un véhicule de transport pour aider au processus d’alimentation par filtre.

L’objectif principal du protocole est de déterminer la limite d’élasticité du mucus, attribuée à la contrainte de cisaillement minimale requise pour initier l’écoulement à laquelle une déformation plastique irréversible est observée pour la première fois sur un matériau viscoélastique structuré. En conséquence, les propriétés rhéologiques du mucus GR, c’est-à-dire la viscosité, le stockage et les modules de perte, ont été étudiées pour sa nature non newtonienne, amincissante par cisaillement, à l’aide d’un rhéomètre rotatif.

Un protocole présenté ici est utilisé pour analyser les propriétés rhéologiques du mucus extrait des râteaux branchiaux d’une carpe argentée, pêchée à l’emplacement de Hart Creek de la rivière Missouri. Le protocole vise à développer une stratégie efficace pour les tests rhéologiques et la caractérisation matérielle du mucus supposé être un matériau viscoélastique structuré.

Introduction

La carpe argentée, Hypophthalmichthys molitrix,est un filtreur planctonivore et une espèce envahissante qui s’est infiltrée dans plusieurs cours d’eau naturels aux États-Unis. Cette espèce a été initialement introduite dans le bassin supérieur du Mississippi pour contrôler les proliférations d’algues1,2,3. La carpe argentée est un alimentateur extrêmement efficace. Typiquement, ses tailles de particules alimentaires consommables vont de 4 à 20 μm à un zooplancton plus grand qui est d’environ 80 μm3,4,5. Cette espèce a surpassé les autres poissons indigènes et peut potentiellement causer d’énormes dommages aux cours d’eau indigènes en limitant les ressources disponibles1,2,6. Ainsi, les poissons filtres tels que la carpe argentée et la carpe à grosse tête constituent une menace majeure pour les Grands Lacs1,2,6,7,8.

Les poissons filtreurs possèdent des organes spéciaux appelés râteaux branchiaux (GR) avec une fine couche de mucus résidant à leur surface. Ces organes améliorent l’efficacité de la filtration et de l’agrégation des petites particules du fluide entrant. L’objectif du protocole présenté ici est de caractériser la propriété non newtonienne du matériau d’amincissement par cisaillement et la contrainte d’élasticité du mucus GR acquis à partir de la surface interne des râteaux branchiaux de la carpe argentée. La valeur de la limite d’élasticité du GLaire GR, déterminée à l’aide d’un rhéomètre rotatif, est intéressante dans cette étude. La limite d’élasticité mesurée, également appelée « contrainte d’élasticité apparente », dépend des méthodes d’essai telles que la vitesse de cisaillement constante ou la déformation oscillatoire dynamique de type9,10. L’amincissement par cisaillement, « fluide de contrainte d’élasticité », subit une transition d’un comportement de type solide à un comportement de type liquide à une contrainte critique appliquée9,11. La limite d’élasticité apparente est la contrainte de cisaillement minimale requise pour initier l’écoulement ou celle à laquelle une déformation irréversible du plastique est observée pour la première fois lorsque le mucus passe d’un matériau semblable à un gel à un matériau de type fluide. Ce comportement peut être observé dans les matériaux viscoélastiques structurés. La transition du mucus gélifiant à un comportement fluide implique deux fonctions, à voir un rôle adhésif pour recueillir les particules alimentaires et un rôle de véhicule de transport pour aider au processus de livraison et de filtration des particules. La fonction étendue du mucus comprend la création de barrières de diffusion dans la résistance aux maladies et la respiration, la libération contrôlée de facteurs nutritionnels, de composants toxiques et d’excrétion, la création de voies métaboliques pour l’alimentation et la nidification, l’aide à la protection des prédateurs et la production de modifications de la couche limite qui améliorent la locomotion et l’efficacité propulsive12,13,14.

Contrairement aux fluides simples, les fluides complexes comme le mucus possèdent des propriétés qui varient en fonction des conditions d’écoulement et nécessitent des paramètres de mesure supplémentaires pour définir leur comportement physique à l’échelle de masse. Pour surveiller la viscosité et la limite d’élasticité du mucus GR, des mesures rhéologiques sont effectuées à l’aide d’un rhéomètre rotatif. Le rhéomètre rotatif applique une contrainte ou une déformation de cisaillement stable ou oscillatoire au moyen d’un disque rotatif en contact avec l’échantillon de fluide et mesure sa réponse. La raison d’être de l’utilisation de cet instrument et de cette technique est que le rhéomètre peut fournir un ensemble de mesures pour décrire les propriétés matérielles du mucus GR de la carpe argentée, qui ne peuvent pas être définies par la viscosité seule.

Le mucus est un matériau viscoélastique et sa réponse mécanique à une déformation imposée est comprise entre celle d’un solide pur (régi par la loi d’élasticité de Hooke) et celle d’un liquide pur (régi par la loi de viscosité de Newton)15,16. Le réseau macromoléculaire complexe contenu dans le mucus peut s’étirer et se réorienter en réponse à des forces externes ou à une déformation. Un rhéomètre rotatif est composé d’une géométrie de cône et d’une plaque de Peltier comme illustré à la Figure 1 et à la Figure 2 (voir le tableau 1 pour les spécifications d’instrumentation). L’objectif de cette étude était de développer un protocole pour déterminer les propriétés rhéologiques du mucus GR. Un avantage du rhéomètre rotatif par rapport à un viscosimètre est sa capacité à effectuer des mesures dynamiques en utilisant de petits volumes d’échantillons. Le volume d’échantillon de mucus GR dans cette étude était d’environ 1,4 mL. Le viscosimètre, en revanche, est limité à des taux de cisaillement constants et nécessite de grands volumes d’échantillons.

Les propriétés rhéologiques du mucus devraient varier considérablement au sein de l’anatomie de la carpe argentée. Par exemple, les propriétés du mucus résidant sur les surfaces GR peuvent être différentes de celles de l’organe épibranchial. Pour tenir compte de la variabilité potentielle des propriétés du mucus dans différentes régions du poisson, l’échantillon de mucus GR acquis a été dilué et des solutions de trois concentrations ont été créées et testées à l’aide du rhéomètre rotatif. Les données et les résultats concernant la rhéologie du mucus rapportés après l’exécution du protocole ont démontré l’efficacité de la technique de mesure. Les données illustratives présentées dans le présent document ne sont pas destinées à être généralisées à l’ensemble de la population de carpes argentées. Le protocole présenté ici peut être étendu pour étudier la rhéologie du mucus sur des ensembles d’échantillons plus grands afin de tester d’autres hypothèses.

Le but de cette étude est de démontrer la variation des propriétés rhéologiques de la rhéologie du mucus GR avec trois concentrations de mucus différentes (400 mg/mL, 200 mg/mL et 100 mg/mL). La concentration de 400 mg/mL représente l’échantillon de mucus brut prélevé dans les GR de poisson. De l’eau désionisée (ID) a été utilisée pour diluer l’échantillon de mucus brut en concentrations de 200 mg/mL et 100 mg/mL. La dilution des échantillons de mucus a permis d’évaluer le degré d’amincissement par cisaillement et la limite d’élasticité apparente en fonction de la concentration et de déterminer la concentration à laquelle le mucus GR passe à un comportement non newtonien. Un agitateur a été utilisé pour décomposer les gros amas de mucus dans les échantillons afin d’atténuer les erreurs dans les données rhéologiques dues à l’inhomogénéité.

Chez la plupart des vertébrés, y compris les poissons, les macromolécules formant du mucus prédominants sont des glycoprotéines (mucines) qui ont tendance à gonfler dans l’eau par enchevêtrements ou réticulation chimique et à créer un matériau semblable à un gel12,13,17,18,19,20. Les macromolécules de haut poids moléculaire, formant des gels et la teneur élevée en eau reflètent la gélinance du mucus13. Un degré élevé d’interactions inter-macromoléculaires conduit à la formation de gel alors que des niveaux plus faibles d’interactions inter-macromoléculaires ou de liaisons rompues entraînent des fluides à haute viscosité21.

Les processus de filtration des particules alimentaires dans les poissons filtreurs sont aidés par des propriétés liées au mucus GR telles que la cohésion et la viscosité qui déterminent son potentiel d’adhérence et d’adhérence22. La force de l’adhérence à base de mucus dépend d’interactions intermoléculaires, électrostatiques ou hydrophobes spécifiques23. Sanderson et al.24 ont mené une étude d’alimentation en suspension chez le poisson noir dans laquelle ils ont trouvé des preuves d’une adhésion à base de mucus. Ils ont déclaré que l’adhésion des particules alimentaires en suspension avec une surface muqueuse est suivie du transport d’amas agrégés de particules liées ensemble au mucus par un écoulement d’eau dirigé agissant sur celui-ci24. Le mucus exposé aux taux de déformation de cisaillement générés par l’écoulement de l’eau facilite l’administration de particules alimentaires aux organes digestifs. Des techniques endoscopiques ont été utilisées pour observer les particules filtrées24.

La littérature sur la gamme des taux de cisaillement et les limites pratiques dans les tests rhéologiques du mucus GR est rare. Par conséquent, des conseils ont été recherchés à partir d’études rhéologiques sur la glaire gastrique, nasale, cervicale et pulmonaire, le mucus de la peau de saumon, la boue de poisson et le lubrifiant de surface des articulations osseuses dans lesquelles la caractérisation rhéologique et les attributs non newtoniens ont été étudiés11,12,25,26,27, 28,29,30,31. Plus récemment, l’effet du mucus de la peau de poisson sur la locomotion et l’efficacité propulsive a été étudié en utilisant la viscométrie à taux de cisaillement constant. Les études de rhéologie du mucus cutané (sans aucune dilution ni homogénéisation) concernant la daurade, le bar et le maigre comportement non newtonien ont démontré un comportement non newtonien à des taux de cisaillement généralement faibles14.  Dans une autre étude connexe, les échantillons de mucus cutané brut des côtés dorsal et ventral de la sole sénégalaise se sont avérés présenter un comportement non newtonien, indiquant une viscosité plus élevée du mucus ventral à tous les taux de cisaillement considérés32. D’autres protocoles rhéologiques relatifs au développement de l’échafaudage d’hydrogel et pour les suspensions hautement concentrées utilisant un viscosimètre à vitesse de cisaillement constante ont également été rapportés dans la littérature33,34.

Dans cette étude, les propriétés du mucus GR ont été étudiées à l’aide d’un rhéomètre rotatif contrôlé par taux de déformation qui a été largement utilisé dans des expériences de rhéologie sur des fluides biologiques complexes25. Pour les fluides newtoniens, la viscosité apparente reste constante, est indépendante de la vitesse de cisaillement et les contraintes de cisaillement varient linéairement avec les taux de déformation de cisaillement (Figure 3A, B). Pour les fluides non newtoniens (tels que les fluides d’amincissement par cisaillement), la viscosité dépend du taux de cisaillement ou de l’historique de déformation (Figure 3A, B). Le module de perte (G ») représente la mesure dans laquelle le matériau résiste à la tendance à l’écoulement et est représentatif de la viscosité du fluide(Figure 4). Le module de stockage (G') représente la tendance du matériau à retrouver sa forme d’origine après une déformation induite par les contraintes et est équivalent à l’élasticité (Figure 4). L’angle de phase (δ) ou la valeur de la tangente de perte, est calculé à partir de la tangente inverse de G"/G'. Il représente l’équilibre entre perte d’énergie et stockage et est également un paramètre commun pour caractériser les matériaux viscoélastiques (δ = 0° pour un solide hookéen; δ = 90° pour un liquide visqueux; δ < 45° pour un solide viscoélastique et δ > 45° pour un liquide viscoélastique)(Figure 4)25. La limite d’élasticité apparente (σy)dans les fluides structurés représente un changement d’état qui peut être observé dans les données rhéologiques à partir du balayage à l’état d’équilibre et des balayages dynamiques contrainte-déformation10. Si la contrainte externe appliquée est inférieure à la limite d’élasticité apparente, le matériau se déformera élastiquement. Lorsque la contrainte dépasse la limite d’élasticité apparente (marquée comme « contrainte moyenne » à la figure 3B), le matériau passe de la déformation élastique à la déformation plastique et commence à s’écouler à l’état liquide35. La mesure du module de stockage (G') et du module de perte (G ») dans l’échantillon de mucus dans des conditions de contrainte oscillatoire (ou de déformation) quantifie le changement de l’état du matériau d’un comportement semblable à un gel à un comportement viscoélastique de type liquide.

Les types d’essais de rhéomètre effectués pour surveiller les données relatives au module de stockage (G'), au module de perte (G ») et à la viscosité apparente (η) sont décrits ici. Les essais d’oscillation dynamique (balayages de déformation et balayages de fréquence) ont surveillé G' et G » sous oscillation contrôlée de la géométrie du cône. Les essais de balayage de déformation dynamique ont déterminé la région viscoélastique linéaire (LVR) du mucus en surveillant la réponse intrinsèque du matériau(Figure 4). Des balayages de déformation ont été utilisés pour déterminer le comportement de rendement à une fréquence d’oscillation et une température constantes. Les essais de balayage dynamique de fréquence ont surveillé la réponse du matériau à l’augmentation de la fréquence (taux de déformation) à une amplitude (déformation ou contrainte) et à une température constantes. La déformation a été maintenue dans la région viscoélastique linéaire (LVR) pour les essais de balayage dynamique de fréquence. Les essais de vitesse de cisaillement à l’état d’équilibre ont surveillé la viscosité apparente (η) sous rotation constante de la géométrie du cône. Le mucus GR a été soumis à des étapes de contrainte incrémentielles et la viscosité apparente (η, Pa.s) a été surveillée pour une vitesse de cisaillement variable (ý, 1/s).

Le protocole présenté dans cet article traite le mucus GR comme un matériau structuré complexe de viscoélasticité inconnue avec une certaine gamme de réponse viscoélastique linéaire. Le mucus de poisson a été extrait des RON de la carpe argentée lors d’une expédition de pêche à l’emplacement du ruisseau Hart dans la rivière Missouri par le professeur L. Patricia Hernandez (Département des sciences biologiques, Université George Washington) 1,2,36.  Un tableau de GO à l’intérieur de l’embouchure d’une carpe argentée est représenté à la figure 5A et un dessin schématique est présenté à la figure 5B. Un GR excisé est représenté à la figure 5C.  L’extraction du mucus des GN de la carpe argentée est présentée à titre d’exemple dans les dessins schématiques, Figure 5D, E. Tous les essais rhéométriques ont été effectués sous une température constante et contrôlée de 22 ± 0,002 °C, la température enregistrée sur le site de pêche1,2,36.  Chaque échantillon de mucus a été testé trois fois avec le rhéomètre, et les résultats moyens sont présentés avec les barres d’erreur statistiques.

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Protocol

1. Préparation des solutions de mucus de différentes concentrations

REMARQUE: Trois concentrations de la solution de mucus (400 mg/mL, 200 mg/mL et 100 mg/mL avec des volumes approximatifs, 1 mL, 1 mL et 2 mL, respectivement) sont préparées pour cette expérience.

  1. Pour calculer la masse du mucus, mesurer la masse moyenne des flacons avec (Mavec-mucus ; mg) et sans mucus (flacons M ; mg). Soustrayez ensuite la masse des flacons avec du mucus avec celle sans mucus (Mmucus = Mavec-mucus - Mflacons ; mg).
  2. Diluer le mucus en trois concentrations (400, 200, 100, mg/mL) avec de l’eau désionisée (DI).
    1. Préparer la première concentration de la solution de mucus, 400 mg/mL en ajoutant 0,6 mL d’eau DI au mucus à l’aide d’une micropipette.
      REMARQUE: Étant donné que le volume approximatif du mucus extrait était de 1,4 mL, la solution de 400 mg / mL aura un volume total d’environ 2 mL.
    2. Placez le flacon de solution de mucus de 400 mg / mL sur un agitateur pour vous assurer que la solution de mucus est correctement homogénéisée et que toute agglomération de particules de mucus est atténuée.
    3. Préparer la deuxième concentration de la solution de mucus, 200 mg/mL, en tirant la moitié du volume de la solution de mucus à première concentration dans un nouveau flacon à l’aide d’une micropipette et en ajoutant 1 mL d’eau DI dans le nouveau flacon.
    4. Répétez l’étape 1.2.2 pour les premier et deuxième flacons avec des solutions de mucus.
    5. Préparer la troisième concentration de la solution de mucus, 100 mg/mL, en tirant la moitié du volume (1 mL) de la solution de 200 mg/mL dans un nouveau flacon à l’aide d’une micropipette et ajouter de l’eau DI dans le nouveau flacon.
    6. Répétez l’étape 1.2.2 pour les trois concentrations de solutions de mucus dans leurs flacons respectifs (voir la figure supplémentaire 1).
    7. Conservez les flacons de solution de mucus dans un réfrigérateur jusqu’à ce que l’étalonnage et les tests du rhéomètre aient été effectués.

2. Mesures et acquisition de données à l’aide d’un rhéomètre

REMARQUE: Les logiciels utilisés dans ce protocole pour le contrôle des instruments et l’acquisition de données avec rhéomètre sont notés dans la table des matériaux. Ce logiciel sera appelé « logiciel de contrôle de l’instrument rhéomètre ».

  1. Installez et étalonnez l’instrument rhéomètre.
    1. Allumez l’alimentation en air comprimé du rhéomètre et assurez-vous que la table pneumatique et le rhéomètre sont niveler à l’aide d’une jauge à bulles. Dérissez le capuchon de protection de l’arbre du rhéomètre et maintenez l’arbre immobile pendant le dévissage.
    2. Allumez les interrupteurs principaux du rhéomètre pour activer les paliers magnétiques du rhéomètre.
    3. Allumez l’ordinateur de commande du rhéomètre avec le logiciel de contrôle de l’instrument rhéomètre installé et lancez le logiciel de contrôle de l’instrument rhéomètre (voir la figure supplémentaire 2).
    4. Effectuez l’étalonnage de l’instrument en sélectionnant les onglets , 'Calibration | Instrument' à partir de la fenêtre du logiciel. Choisissez l’option 'Instrument'. Cliquez sur 'Calibrer' sous 'Inertie'. Enregistrez la valeur d’étalonnage de l’inertie de l’instrument en μN.m.s2 et répétez l’étalonnage au moins 3x pour vous assurer que les valeurs d’étalonnage sont à moins de 10 % les unes des autres (voir la figure supplémentaire 3).
  2. Installez la géométrie du rhéomètre sur l’arbre du rhéomètre.
    1. Cliquez sur l’onglet 'Géométries' dans le logiciel de contrôle de l’instrument rhéomètre.
    2. Nettoyez le cône avec la géométrie souhaitée (diamètre 40 mm, cône 1◦ 0' 11'') et la plaque Peltier avec de l’isopropanol (voir Tableau 1, Tableau des matériaux, Figure 1et Figure 2).
      REMARQUE: La plaque Peltier est installée sur le rhéomètre; il peut être nettoyé avec de l’isopropanol alors qu’il est directement fixé au rhéomètre.
    3. Assurez-vous que le luminaire à plaque Peltier est exempt de toute poussière visible et nettoyez, si nécessaire, avec de l’isopropanol. Installez la plaque Peltier si elle n’est pas préinstallée dans le rhéomètre et connectez les connexions du dissipateur de chaleur.
    4. Appuyez sur le bouton deverrouillagedu rhéomètre jusqu’à l’arbre de verrouillage connecté à la géométrie du cône. Cela arrête la position de l’arbre, mais il peut tourner librement à la position.
    5. Cliquez sur 'Smart Swap | Activé' dans l’onglet du logiciel de contrôle de l’instrument rhéomètre pour permettre la détection automatique de la géométrie (voir figure supplémentaire 4).
    6. Tournez l’arbre sur le dessus du rhéomètre pour visser la géométrie. Le logiciel détectera la géométrie de l’angle du cône de 40 mm de diamètre, 1◦ 0' 11'' à ce stade (voir tableau 1 et tableau des matériaux).
    7. Répétez les étapes 2.2.5 à 2.2.6 pour vous assurer que la géométrie est détectée.
    8. Sélectionnez 'Gap' sous le 'Panneaude commande ' du logiciel de contrôle de l’instrument du rhéomètre, cliquez sur l’icône 'Options' et choisissez l’option 'Force axiale'. Définir la force axiale sur '1 Newton'; il s’agit de s’assurer que la géométrie du cône touche la plaque de Peltier pour l’initialisation de l’écart zéro (voir la figure supplémentaire 5).
  3. Effectuez l’étalonnage de la géométrie du rhéomètre.
    1. Sélectionnez l’onglet 'Géométrie' dans la fenêtre du logiciel. Cliquez sur 'Calibrer' sous 'Inertie'. Enregistrez la valeur d’étalonnage de l’inertie géométrique en μN.m.s2 et répétez-la 2 à 3 fois pour vous assurer que les valeurs d’étalonnage sont à moins de 10 % les unes des autres.
    2. Cliquez sur 'Calibrer' sous 'Friction' dans la fenêtre du logiciel. Enregistrez la valeur d’étalonnage du frottement géométrique en μN.m/(rad/s) et répétez-la 2 à 3 fois pour vous assurer que les valeurs d’étalonnage sont à moins de 10 % les unes des autres (voir la figure supplémentaire 6).
  4. Effectuer l’initialisation à intervalle zéro
    REMARQUE: Étant donné que la géométrie ne peut pas être élevée avec précision au-dessus de la plaque Peltier pour effectuer des mesures sans position de référence « zéro », l’initialisation de l’écart zéro est effectuée. Aux fins de la mesure, la géométrie a un écart géométrique intégré de 24 μm et un écart d’assiette de 28 μm. L’espace de coupe est réglé pour nettoyer efficacement l’excès de liquide qui peut se déverser en dehors de la surface de la géométrie. Ces lacunes sont impératives pour mesurer avec précision les données à l’aide de l’échantillon et du rhéomètre. L’étape 2.4.1 est absolument nécessaire pour s’assurer que la géométrie est réglée sur un écart nul pour atteindre la géométrie et des écarts de coupe de 24 μm et 28 μm, respectivement.
    1. Cliquez sur l’icône 'Zéro écart' sous l’onglet 'Écart' dans le ' Panneaude configuration' dans la fenêtre du logiciel. L’initialisation est complète lorsque la force axiale subie par la géométrie est supérieure ou égale à 1 N, car elle touche la plaque de Peltier. Assurez-vous que l’écart du rhéomètre est mis à zéro afin que sa position de référence soit exacte (voir la figure supplémentaire 7 et la figure supplémentaire 8).
    2. Appuyez sur les commandes 'flèche haut et bas' sur l’instrument rhéomètre ou ' géométrie haut etbas' icônes sous l’onglet 'Espace' dans le logiciel de contrôle de l’instrument rhéomètre pour élever la géométrie à n’importe quelle hauteur arbitraire. L’écran de commande de l’instrument rhéomètre et le panneau de commande du logiciel de commande de l’instrument rhéomètre afficheront la (même) hauteur d’écart.
  5. Configurez la procédure expérimentale dans le logiciel de contrôle de l’instrument rhéomètre. Effectuer la caractérisation des propriétés rhéologiques en utilisant une géométrie de plaque cône sur Peltier à 22 °C.
    REMARQUE: Le site Web de l’US Geological Survey a été utilisé pour déterminer la température de l’eau de la rivière le 20 septembre 2018, lorsque la carpe argentée utilisée pour les expériences sur le mucus GR a été pêchée à l’emplacement36de Hart Creek. La température du mucus peut affecter les propriétés rhéologiques. L’importance de l’ajustement des valeurs à la température de la rivière est de correspondre approximativement à la température sous laquelle les propriétés du mucus peuvent être estimées de manière réaliste.
    1. Sélectionnez l’onglet 'Expériences' dans le logiciel de contrôle de l’instrument rhéomètre et remplissez les informations pertinentes telles que 'Nom', 'Opérateur', 'Projet', etc.  (voir la figure supplémentaire 9)
    2. Sélectionnez l’onglet 'Géométrie' et assurez-vous que les informations concordent avec les étapes 2.2.5. - 2.2.7. (voir la figure supplémentaire 10).
    3. Sélectionnez l’onglet 'Procédure', et utilisez les touches fléchées configurées '1: Amplitude d’oscillation' procédure. (voir la figure supplémentaire 11).
    4. Initialisez les paramètres 'Contrôle de l’environnement' comme suit: 'Température = 22 °C'; 'Temps de trempage = 120 s’et cochez la case 'Attendre la température' (voir figure supplémentaire 11).
    5. Initialisez les paramètres 'Paramètres de test' comme suit: 'Fréquence = 1 Hz'; définir 'Balayage logarithmique'; « Couple = 10 à 10000 μN.m »; « Points par décennie = 5 » (voir figure supplémentaire 11).
  6. Mettre en place l’expérience pour déterminer la gamme viscoélastique linéaire (LVR) du mucus de concentration connue (100 mg / mL)
    1. À l’aide d’une micropipette et d’une pointe de pipette appropriées, prélever environ 0,3 mL de solution de mucus de poisson à une concentration de 100 mg/mL (voir l’étape 1.2, Tableau des matériaux).
    2. Introduire la solution de mucus sur la plaque Peltier à l’aide de la micropipette (voir Figure 2).
    3. Appuyez sur le bouton 'Trim Gap' du rhéomètre pour abaisser la géométrie sur la plaque Peltier. Vous pouvez également cliquer sur l’icône 'Trim Gap' sous l’onglet 'Gap' dans l’option ' Panneaude configuration' dans le logiciel de contrôle de l’instrument du rhéomètre (voir la figure supplémentaire 12).
    4. Utilisez la micropipette avec la pointe de la pipette pour éliminer tout excès de solution de mucus et vous assurer que le fluide se trouve sous la géométrie sans déversement près de la périphérie de la géométrie.
      REMARQUE: Un chargement incorrect du fluide entraînera des erreurs dans les mesures. Un échantillon sous rempli réduira la distribution du couple et un échantillon trop rempli entraînera des distributions de contraintes erronées en raison d’un déversement le long des bords.
    5. Sélectionnez les onglets 'Moteur' et 'Vitesse' à 5 rad/s et 0 rad/s alternativement, jusqu’à ce qu’il y ait une inertie et une vitesse minimales dans l’échantillon sous la géométrie. L’écran de commande de l’instrument rhéomètre et le panneau de commande du logiciel de commande de l’instrument rhéomètre affichent la vitesse (voir la figure supplémentaire 13).
    6. Appuyez sur le bouton 'Geometry Gap' du rhéomètre pour abaisser la géométrie à l’écart approprié prédéfini par géométrie spécifique. Vous pouvez également cliquer sur l’icône «Écart géométrique» sous l’onglet «Écart» dans l’option « Panneaude configuration» du logiciel de commande de l’instrument du rhéomètre (voir la figure supplémentaire 14).
  7. Exécutez l’expérience pour déterminer la gamme viscoélastique linéaire (LVR) du mucus de la concentration connue (100 mg / mL).
    1. Cliquez sur l’icône 'Démarrer' sur le logiciel de contrôle de l’instrument rhéomètre (voir figure supplémentaire 15).
      REMARQUE: Le rhéomètre effectue des mesures automatiques; une fois que le bouton 'Démarrer' est enfoncé, le rhéomètre prendra environ 20 minutes pour terminer le test. Le paramètre « Points par décennie » de l’étape 2.5.5 détermine le temps dont le rhéomètre aura besoin pour effectuer les mesures.
    2. Exécutez l’expérience en cliquant sur 'Oui' dans la fenêtre contextuelle qui apparaît et suggère que l’écart géométrique soit abaissé à la bonne distance pour démarrer l’expérience, si ce n’est déjà fait.
    3. Observez le tracé en temps réel généré par le rhéomètre qui signale les modules de stockage (G') et de perte (G'').
      REMARQUE: Le G' et le G » sont les modules de stockage et de perte, respectivement. Le module de stockage représente la tendance du matériau à retrouver sa forme d’origine après une déformation induite par les contraintes et équivaut à l’élasticité. Le module de perte représente la mesure dans laquelle le matériau résiste à la tendance à l’écoulement et est représentatif de la viscosité du fluide (voir figure 4).
    4. Définissez l’axe X du tracé sur 'Pourcentage de déformation d’oscillation'. Pour ce faire, faites un clic droit sur le graphique présenté et choisissez l’onglet 'Variables graphiques' (voir Figure supplémentaire 16).
    5. Enregistrez la plage de pourcentage de déformation d’oscillation à partir du graphique avant que le matériau n’entre dans la plage viscoélastique non linéaire, une fois le test terminé.
    6. Appuyez sur les commandes 'flèche haut et bas' de l’instrument rhéomètre ou sur les icônes ' géométriemontante et inférieure' sous l’onglet 'Gap' du logiciel de contrôle de l’instrument rhéomètre pour élever la géométrie à n’importe quelle hauteur arbitraire au-dessus de la plaque Peltier.
    7. Enregistrez le fichier qui contient à la fois la procédure expérimentale et les résultats dans le format de fichier natif du logiciel de contrôle de l’instrument rhéomètre pour déterminer la région viscoélastique linéaire (LVR) de l’échantillon de mucus.
      REMARQUE: Cela peut être fait en réglant l’axe X du graphique sur l’amplitude de déformation (%) et / ou la contrainte d’oscillation Equation omega avant que les données n’entrent dans la région viscoélastique non linéaire (NLVR) (voir la figure supplémentaire 16).
  8. Exécutez les balayages dynamiques et les expériences d’essai de débit de taux de cisaillement à l’état d’équilibre dans la gamme viscoélastique linéaire (LVR) pour le mucus de concentration connue 100, mg / mL afin de générer des résultats à partir de trois échantillons de mucus indépendants de 100 mg / mL. Effectuez ces étapes sur les échantillons de concentration de mucus disponibles individuellement.
    1. Répétez les étapes 2.5.1 à 2.5.4.
    2. Initialisez les paramètres 'Paramètres de test' comme suit: 'Fréquence = 1 Hz'; définir 'Balayage logarithmique'; « % de déformation = 100 à 10000 %; 'Points par décennie = 10'.
    3. Sélectionnez l’onglet 'Procédure' et utilisez les touches fléchées configurées pour la procédure '2: Fréquence d’oscillation'.
    4. Initialisez les paramètres 'Contrôle de l’environnement' comme suit: 'Température = 22 °C'; 'Temps de trempage = 0,0 s'.
    5. Initialisez les paramètres 'Paramètres de test' comme suit: 'Strain % = 1 %'; définir 'Balayage logarithmique'; « Fréquence = 20 à 1 Hz »; 'Points par décennie = 10'.
    6. Sélectionnez l’onglet 'Procédure' et utilisez les touches fléchées configurées pour la procédure '3: Flow Sweep'.
    7. Initialisez les paramètres 'Contrôle de l’environnement' comme suit: 'Température = 22 °C'; 'Temps de trempage = 0,0 s'.
    8. Initialisez les paramètres 'Paramètresde test ' comme suit: 'Taux de cisaillement = 1 à 10000 1/s'; « Points par décennie = 10 »; case à cocher 'Détection à l’état d’équilibre'.
    9. Répétez les étapes 2.7.1 à 2.7.2 et attendez que l’expérience soit terminée, environ 45 minutes.
    10. Appuyez sur les commandes 'flèche haut et bas' sur l’instrument rhéomètre ou sur les icônes 'géométrie haut et bas' sous l’onglet 'Gap' dans le logiciel de contrôle de l’instrument rhéomètre pour élever la géométrie à n’importe quelle hauteur arbitraire.
    11. Utilisez des lingettes et des gants jetables pour enlever et nettoyer le mucus sur la plaque Peltier avec une solution d’isopropanol (voir tableau des matériaux).
    12. Enregistrez le fichier qui contient à la fois la procédure expérimentale et les résultats dans le format de fichier natif du logiciel de contrôle de l’instrument de rhéomètre.

3. Répétez le protocole pour d’autres concentrations de solutions de mucus de 200 mg/mL et 400 mg/mL.

  1. Effectuer les étapes 2.5 à 2.8, y compris toutes les sous-étapes qui y sont énumérées pour les deux concentrations restantes de solutions de mucus, 200 mg/mL et 400 mg/mL.

4. Représentation graphique et analyse des données

REMARQUE : Le code fourni dans le fichier de code supplémentaire effectue la moyenne des données et génère des erreurs de répétabilité, superpose les données de toutes les expériences. Les fonctions de calcul de l’écart type ne sont pas disponibles dans le logiciel de contrôle de l’instrument rhéomètre. Le code est écrit dans un langage de programmation pour l’analyse des données, le post-traitement et la représentation graphique (voir Table des matériaux pour plus de détails).

  1. Exportez les données générées à partir de l’étape 2.8 concernant la concentration de mucus GR de 100 mg/mL et de l’étape 3.1 concernant les concentrations de mucus GR de 200 mg/mL et 400 mg/mL dans un format de feuille de calcul en cliquant sur l’onglet 'Fichier | | d’exportation Excel' dans le logiciel de contrôle de l’instrument rhéomètre (voir figure supplémentaire 17).
  2. Exécuter des codes supplémentaires pour générer des diagrammes de viscosité apparente (η) pour les taux de déformation de cisaillement ( Equation y ) variables et le module de perte (G »), le module de stockage (G') et l’angle de phase (δ) pour la variation de la contrainte d’oscillation ( ) et générer des résultats Equation omega représentatifs.

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Representative Results

Dans cette section, nous présentons les résultats des expériences sur le mucus GR à l’aide d’un rhéomètre rotatif avec une géométrie de cône (40 mm de diamètre, 1° 0' 11'') et une plaque de Peltier. Les expériences ont aidé à caractériser le comportement non newtonien d’amincissement par cisaillement du mucus GR et la contrainte d’élasticité apparente représentant la transition du mucus d’un matériau semblable à un gel à un matériau de type fluide. Les résultats représentatifs comprennent des descriptions quantitatives des limites de faible couple et des effets d’écoulement secondaire de l’instrumentation du rhéomètre rotatif. Les limites d’instrumentation et les mesures de la vitesse de déformation dynamique et à l’état d’équilibre ont permis de déterminer avec précision les tendances comportementales viscoélastiques et la contrainte de rendement apparente du mucus GR. Les mesures de la limite d’élasticité apparente ont permis d’observer la contrainte minimale requise pour la déformation plastique irréversible du mucus GR et d’initier l’écoulement. La tendance à l’amorçage de l’écoulement du mucus GR pourrait être attribuée aux fonctions d’adhésion et de transport des particules alimentaires. Les fonctions d’adhésion et de transport du mucus GR étaient des attributs macroscopiques du matériau qui ont été éclairés par les mesures rhéologiques dans les expériences de protocole. Par conséquent, la caractérisation macro-rhéologique du mucus GR a été réalisée avec ce protocole.

Le mucus utilisé dans l’expérience a été acquis à partir de plusieurs râteaux branchiaux de jusqu’à trois carpes argentées et n’avait aucune trace visible de sang1,2. L’échantillon acquis a été dilué en deux échantillons supplémentaires, comme décrit dans le protocole. Toutes les mesures ont été effectuées à la température contrôlée de 22 ± 0,002 °C36. Cette température a été maintenue sur la plaque Peltier du rhéomètre. La géométrie du cône a été choisie pour sa polyvalence dans la mesure d’une large gamme de viscosités dans des matériaux biologiques tels que le mucus GR. Le couple minimal dans des conditions de cisaillement à l’état d’équilibre (10 x10 -9 Nm),le couple minimal dans des conditions oscillatoires (2 x 10-9 Nm) ainsi que l’angle du cône (1° 0' 11 ») et le résumé des spécifications du rhéomètre requis pour évaluer les régimes de couple faible et de débit secondaire sont présentés dans le tableau 1. Nous rapportons des répliques des trois derniers échantillons pour la caractérisation et la comparaison du comportement d’amincissement non newtonien et de cisaillement.

Inférences générales après l’exécution réussie du protocole
L’exécution réussie du protocole et de l’analyse a abouti à la caractérisation des propriétés (macro) rhéologiques impliquant un comportement d’amincissement par cisaillement non newtonien du mucus extrait des râteaux branchiaux de la carpe argentée, Hypophthalmichthys molitrix. En particulier, le phénomène de rendement a été résolu et une contrainte d’élasticité apparente du mucus (concentration de 400 mg / mL, la plus proche de la consistance réelle du mucus extrait) a été déterminée (σy = 0,2736 Pa). Le protocole était bien adapté aux mesures impliquant un très petit volume d’échantillon (environ 1,4 mL) de mucus. En raison de la rareté de la littérature relative à la caractérisation du mucus GR, ces données aideront à la modélisation analytique et aux études rhéométriques étendues.

Résultats des expériences de balayage dynamique
Les résultats des expériences de balayage dynamique de fréquence et d’amplitude sont présentés dans cette section. Ce sont les résultats des procédures créées aux étapes 2.8.2 - 2.8.5. Les limites de faible couple pour le balayage de fréquence oscillatoire et le balayage d’amplitude du mucus GR avec une concentration de 400 mg/mL sont indiquées à la figure 6A, B.

Les données de balayage de fréquence(Figure 6A)ont été acquises pour une gamme de fréquences angulaires, 6,28 ≤ ω ≤ 125,66 rad s-1 à une amplitude de déformation oscillatoire constante de 0,01. La valeur de fréquence angulaire, 6,28 rad/s (1 Hz) a été choisie comme fréquence approximative de mouvement des plis palataux dans les interstices des râteaux branchiaux et marquée à la figure 6A. Le choix de la valeur d’amplitude de déformation a été dérivé de la région viscoélastique linéaire déterminée à l’étape 2.7 du protocole. Dans la figure 6A, deux limites inférieures potentielles du régime de faible couple ont été calculées en utilisant des amplitudes de déformation de 0,01 et 0,001 (γ0), et des couples minimaux de 2x10-9 Nm et 10 x10 -9 Nm (Tmin, voir tableau 1.), respectivement. Les données présentées à la figure 6A commencent à la fréquence approximative du mouvement du pli palatal (1 Hz ou 6,28 rad/s) et augmentent jusqu’à des fréquences angulaires plus élevées qui dépassent la portée de l’interprétation physique dans cette étude. Par conséquent, ces données n’ont pas été analysées plus avant, car elles nécessitent une étude paramétrique plus détaillée de l’amplitude de la déformation et de la fréquence de mouvement du pli palatal.

Les données de balayage d’amplitude(figure 6B)ont été acquises à une fréquence angulaire fixe (ω) de 6,28 rad/s (1 Hz). Il convient de noter que les données de balayage d’amplitude n’ont pas été affectées par le régime de faible couple de l’instrumentation(Figure 6B). Par conséquent, ces données ont été analysées plus en détail pour les trois concentrations de mucus (100 mg / mL, 200 mg / mL et 400 mg / mL) afin de déterminer l’étendue de la viscoélasticité et le comportement de rendement.

La représentation graphique illustrée à la figure 4 a été utilisée comme ligne directrice pour l’analyse étendue des expériences de balayage d’amplitude. Les résultats de trois solutions de mucus avec des concentrations de 100 mg/mL, 200 mg/mL et 400 mg/mL sont discutés ci-dessous.

Le résultat pour une concentration de mucus de 100 mg/mL (Figure 7A), montre qu’à de faibles contraintes d’oscillation (0,01 ≤ Equation omega ≤ 0,1 Pa), les modules de stockage et de perte (G' et G ») se chevauchaient de manière significative. À des contraintes d’oscillation supérieures à 0,1 Pa, le module de stockage diminue, ce qui indique une élasticité plus faible. Le module de perte, représentatif de la viscosité, reste constant dans toute la gamme des contraintes d’oscillation (0,01 ≤ Equation omega ≤ 0,5 Pa). Ce phénomène peut être attribué à un comportement de type fluide newtonien et est en accord avec la viscosité apparente constante de la concentration de mucus de 100 mg/mL(Figure 7A et Figure 8A,B). Les données correspondantes sur l’angle de phase (δ) montrent qu’à des contraintes d’oscillation modérées et élevées (0,05 Equation omega ≤ ≤ 0,3 Pa),les valeurs varient entre 55° et 70°(Figure 7D). On peut donc en déduire que la solution de mucus à 100 mg/mL présente un comportement fluide, avec une contrainte de rendement apparente négligeable.

Comme on l’observe à la figure 7B,concentration de 200 mg/mL à de faibles contraintes d’oscillation (0,02 Equation omega ≤ ≤ 0,04 Pa),le module de stockage (G') diminue mais reste supérieur au module de perte (G).  Dans la plage de contraintes d’oscillation (0,04 ≤ Equation omega ≤ 0,07 Pa),il y avait une région de « croisement » dans laquelle les valeurs G' et G » restent approximativement égales. Cette région est marquée à la figure 7B avec des lignes pointillées et les valeurs de contrainte d’oscillation correspondantes ont été notées (0,04193 Equation omega ≤ ≤ 0,06467 Pa).  Au-delà de cette région, G » a atteint une valeur plus élevée que G' suggérant une transition vers un comportement fluide. Cependant, G » (représentant la viscosité) est resté constant dans toute la plage de contrainte d’oscillation (0,01 ≤ Equation omega ≤ 0,5 Pa). Les données d’angle de phase présentées à la figure 7E montrent un degré de variance plus élevé, en particulier dans la plage de contraintes d’oscillation (0,04193 Equation omega ≤ ≤ 0,06467 Pa).  À partir des figures 7B,E, on peut déduire qu’il y avait un comportement de transition du fluide de la région viscoélastique linéaire à la région viscoélastique non linéaire. En outre, la concentration de mucus de 200 mg/mL représentait des caractéristiques non newtoniennes et une propension à céder avec dans la plage de contrainte d’oscillation (0,04193 ≤ Equation omega ≤ 0,06467 Pa). Le comportement non newtonien, semblable à un fluide d’amincissement par cisaillement, concordait avec les données de viscosité apparente présentées à la figure 8A et les variations de contrainte correspondantes de la figure 8B.

Les données sur la concentration de mucus de 400 mg/mL sont présentées à la figure 7C,F. Les tendances G' et G' de la figure 7C démontrent clairement un phénomène de rendement avec un point de croisement entre G' et G'. La valeur de la limite d’élasticité apparente (σy)a été enregistrée à 0,2736 Pa, ce qui indique un changement clair de l’état du mucus de l’état gélifiant à un état de fluide non newtonien. Les données sur l’angle de phase présentées à la figure 7F montrent une forte augmentation de la limite d’élasticité apparente (σy = 0,2736 Pa)d’environ 20° à 65°. Une telle augmentation de l’angle de phase peut se produire lorsque le matériau subit un cédage et commence à s’écouler comme un fluide. Le comportement de fluide non newtonien peut être renforcé par les résultats des essais de cisaillement à l’état d’équilibre rapportés à la figure 8A,8B. La limite d’élasticité apparente rapportée dans les essais de cisaillement à l’état d’équilibre était de 0,2272 Pa(figure 8B).

Résultats des expériences de taux de cisaillement à l’état d’équilibre
Les résultats des expériences de taux de cisaillement à l’état d’équilibre sont présentés pour trois solutions de mucus avec des concentrations de 100 mg/mL, 200 mg/mL et 400 mg/mL dans cette section en utilisant des représentations graphiques comme ligne directrice (Figures 3A,B). Ces résultats correspondent à la procédure initialisée dans les étapes de protocole 2.8.6-2.8.8.

Dans la figure 8A pour la concentration de mucus de 100 mg/mL, les données de viscosité apparente avec une variance élevée à des taux de cisaillement faibles (1 ≤ Equation y ≤ 4 s-1) sont montrées avec la pente, -1,4. L’emplacement du régime à faible couple est également marqué. La variance élevée des données de 100 mg/mL dans cette plage (1 ≤ Equation y ≤ 4 s-1), est supposée être un effet du régime de faible couple (ombragé). Dans la figure 8B, la variation de contrainte correspondante avec les données de taux de cisaillement indiquait une petite plage de vitesses de cisaillement lorsque l’échantillon atteignait un « plateau de contrainte » (ou la région plate). Cette région est négligée pour l’estimation de la limite d’élasticité car les données de viscosité correspondantes sont soumises à des effets de faible couple.  Dans la plage de vitesse de cisaillement élevée (2500 ≤ Equation y ≤ 10000 s-1),les données de viscosité apparentes ont été affectées par le régime d’écoulement secondaire. La solution de mucus à 100 mg/mL se comporte donc comme un fluide newtonien indépendant du taux de cisaillement en dehors des régimes de faible couple et d’écoulement secondaire, et avec une viscosité apparente constante de 0,00088 Pa s (±1,656 x10-5 Pa s).

Comme on l’observe à la figure 8A,la concentration de 200 mg/mL de mucus n’a pas été affectée par les limites de faible couple et a démontré un effet d’amincissement par cisaillement dans la plage de vitesse de cisaillement, 1 Equation y ≤ ≤ 15 s-1. La viscosité du taux de déformation de cisaillement zéro (ηo) a été notée comme 0,032 Pa s (±0,024 Pa s) et la viscosité du taux de déformation de cisaillement infini(η ∞) à la vitesse de cisaillement ( ), Equation y 1995 s-1, a été notée comme 0,00085 Pa s (±2,495 x 10-5Pa s). L’effet d’amincissement par cisaillement du fluide a été démontré avec une pente de -1,8 dans la plage de vitesse de cisaillement, 1 ≤ Equation y ≤ 4 s-1. La variation de contrainte correspondante à la figure 8B, montre un « plateau de contrainte » qui représente un phénomène de rendement avec la contrainte d’élasticité moyenne de 0,1446 Pa (±0,0037 Pa).

La concentration de 400 mg/mL de mucus est la moins diluée et, par conséquent, la plus proche en consistance matérielle du mucus GR extrait réel. À la figure 8A,notez que la caractéristique d’amincissement par cisaillement est bien définie pour la concentration de mucus de 400 mg/mL par rapport à la concentration de mucus de 200 mg/mL. Les viscosités de cisaillement zéro (ηo) et de vitesse de déformation de cisaillement infini(η ∞) à la vitesse de cisaillement ( Equation y ), 1995 s-1, étaient respectivement de 0,137 Pa s(±0,032 Pa s ) et 0,00099 Pa s (±9,323 x 10-5Pa s). En outre, la pente de la région d’amincissement du cisaillement a été établie à -0,91 dans la plage de vitesse de cisaillement, 1 ≤ Equation y ≤ 32 s-1. Le « plateau de contrainte » correspondant aux variations de contrainte avec la vitesse de cisaillement observée à la figure 8B, représente une limite d’élasticité apparente de 0,2272 Pa (±0,0948 Pa).

Composant Modèle/Numéro de pièce/Version Description du paramètre Spécifications
Rhéomètre DHR-2 Gamme de fréquences 1 x 10−7 - 100 Hz
Vitesse angulaire maximale 300 rad/s
Couple minimal sous cisaillement stable 10 nN.m
Couple minimal sous oscillation 2 nN.m
Couple maximal 200 μN *m
Résolution du couple 0,1 nN.m
Plage de taux de cisaillement 5,73 x 10−6 à 1,72 x 104 [1/s]
Force normale maximale 50 N
Résolution de force normale 0,5 mN
Géométrie 513404.905 Taille 40 mm de diamètre
1° 0' 11 » Angle du cône
Plaque Peltier 533210.901 Plage de température -40°C à 200°C ± 0,1°C

Tableau 1 : Spécifications du rhéomètre

Figure 1
Figure 1 : Rendu CAO des composants du rhéomètre. (A) 40 mm 1° géométrie du cône, (B) Fixation de la plaque Peltier. La géométrie du cône doit être fixée à l’arbre du rhéomètre et la plaque Peltier doit être connectée à la base du rhéomètre rotatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Placement du fluide sur la plaque Peltier. L’échantillon de fluide doit être placé au centre de la plaque Peltier pour assurer une répartition uniforme du fluide dans toute la plaque lorsque la géométrie est abaissée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Représentation graphique des propriétés rhéologiques stables. Variation de (A) Viscosité apparente (η) et (B) Contrainte de cisaillement ( Equation y ) avec taux de déformation de cisaillement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Représentation graphique des propriétés rhéologiques dynamiques. Variation des modules de stockage (G') et de perte (G ») et de l’angle de phase (δ) avec contrainte d’oscillation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Images représentatives et dessins schématiques de râteaux branchiaux (GR). (A) Vue du réseau de râteaux branchiaux et des plis palataux (B) Dessin schématique du réseau de râteaux branchiaux et des plis palataux (C) Râteau branchial excisé (D) Dessin schématique du râteau branchial avec caractéristiques saillantes (E) Emplacement de l’extraction du mucus dans le râteau branchial. Les images 5A et 5C ont été prises lors d’une dissection effectuée par le professeur L. Patricia Hernandez du Département des sciences biologiques de l’Université George Washington. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Effets de faible couple. Variation du module de stockage et de perte pour 400 mg/mL, concentration de mucus avec (A) Balayages de fréquence à amplitude de déformation = 0,01 et (B) Balayages d’amplitude à fréquence d’oscillation = 1 Hz (ou 6,28 rad/s). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Balayage d’amplitude pour trois concentrations de mucus de carpe argentée. Les essais ont été effectués à f = 1 Hz ou ω = 6,28 rad/s (A) Variation du module de stockage et de perte pour la concentration de mucus, 100 mg/mL (B) Variation du module de stockage et de perte pour la concentration de mucus, 200 mg/mL (C) Variation du module de stockage et de perte pour la concentration de mucus GR, 400 mg/mL (D) Variation de l’angle de phase pour la concentration de mucus GR, 100 mg/mL (E) Variation de l’angle de phase pour la concentration de mucus, 200 mg/mL (F) Variation de l’angle de phase pour la concentration de mucus, 400 mg/mL. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8: Variation de la viscosité apparente (η) et de la contrainte (σ) avec taux de cisaillement ( Equation y ) pour les trois concentrations de mucus de poisson. (A) Variation apparente de viscosité avec taux de cisaillement pour les concentrations de mucus, 400 mg/mL, 200 mg/mL et 100 mg/mL ainsi que régimes d’effets de faible couple et d’effets d’écoulement secondaires (B) Variation de contrainte avec taux de cisaillement pour les concentrations de mucus GR, 400 mg/mL, 200 mg/mL et 100 mg/mL, marquant les « plateaux de contrainte » (ou région plate) avec des lignes pointillées. Les lignes pointillées représentent les valeurs moyennes apparentes de la limite d’élasticité pour les trois concentrations de mucus GR. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Trois concentrations de mucus GR de carpe argentée. De gauche à droite : 400 mg/mL, 200 mg/mL, 100 mg/mL. La concentration initiale de 400 mg/mL a été choisie en fonction des critères suivants : une fois dilué, l’échantillon contiendrait une quantité raisonnable de mucus de poisson tout en fournissant un volume suffisamment important pour effectuer plusieurs tests. Les deux concentrations suivantes ont été diluées par 50 % d’eau DI en volume. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Lancement du logiciel de contrôle des instruments rhéométriques. Ce logiciel ne doit être lancé qu’après la mise sous-allumée de la machine. Sinon, l’instrument risque de ne pas être étalonné correctement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Étalonnage de l’instrument. L’étalonnage inertiel est le seul étalonnage nécessaire pour l’instrument. D’autres étalonnages sont effectués après l’installation de la géométrie. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : bascule d’échange intelligent. Cette option permet d’activer ou de désactiver l’échange intelligent. Smart swap est une fonction logicielle de contrôle d’instrument de rhéomètre qui détecte automatiquement une géométrie une fois qu’elle est installée sur l’arbre du rhéomètre. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 5 : Options d’écart de mesure Les options de l’onglet "Gap » ont été accédées pour définir les conditions du mode zero-gap et la vitesse de traversée de la tête de mesure. Une force de contact axiale entre la géométrie et la plaque de Peltier a été réglée sur 1 N pour assurer la référence d’écart zéro, c’est-à-dire le contact entre la géométrie du cône et la surface de la plaque de Peltier. La tête de mesure a ensuite été faite pour traverser avec précision jusqu’à l’écart de mesure de 24 μm entre la géométrie du cône de 40 mm 1° et la plaque Peltier. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 6 : Étalonnage de la fixation géométrique. Lors de l’installation de la géométrie du cône de 40 mm 1° et de sa détection par le logiciel de contrôle de l’instrument rhéomètre, la géométrie a été calibrée de la même manière que l’étalonnage de l’instrument pour assurer des mesures précises au cours d’une expérience. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 7 : Icône Zero Gap. L’initialisation à intervalle zéro est effectuée à l’aide de cette icône. Une fois l’initialisation à écart zéro terminée, le rhéomètre peut référencer avec précision la position de l’arbre, avec la géométrie qui y est attachée, lorsqu’il est soulevé ou abaissé. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 8 : Rendu CAO de la géométrie du cône et de la plaque Peltier après l’établissement de la référence à écart zéro. La géométrie est définie pour établir l’écart zéro lorsqu’une force de contact axiale de 1 N est générée lorsqu’elle entre en contact avec la plaque peltier. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 9 : Étape 2.5.1 du protocole. La figure représente la façon dont la dénomination de l’exemple et la sortie de fichier et de données sont définies. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 10 : Étape 2.5.2 du protocole. La figure représente la façon dont les paramètres de géométrie, tels que le volume de l’échantillon, l’écart géométrique et l’écart d’ajustement, peuvent être définis. Pour certaines géométries, à savoir le cône utilisé dans cette expérience, ces paramètres sont immuables et définis en fonction de la géométrie. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 11 : Étape 2.5.3 du protocole. La figure représente la façon dont le réglage et le conditionnement du test sont définis dans cette étape procédurale. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 12 : Icône d’ajustement de l’espace. L’écart de coupe a été réglé de manière à ce que la géométrie puisse être suffisamment abaissée pour couper l’excès de liquide qui s’échappe de la zone située entre la plaque Peltier et la géométrie du cône. L’écart dépend de la géométrie utilisée. Pour la géométrie du cône de 40 mm et 1° utilisée dans le protocole, l’écart de coupe était de 28 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 13 : Icône de vitesse du moteur. Les réglages du moteur ont été utilisés pour ajuster la vitesse de rotation de l’arbre et minimiser l’inertie géométrique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 14 : Icône d’écart géométrique. L’écart géométrique abaisse la géométrie à une distance spécifique au-dessus de la plaque peltier, comme spécifié par la géométrie de la plaque conique. Pour la géométrie du cône de 40 mm et 1° utilisée dans le protocole, l’écart géométrique est de 24 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 15 : icône De démarrage. Le bouton Démarrer lance toute la séquence de procédures configurées précédemment. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 16 : Modification des variables du graphique. La figure représente les variables qui peuvent être définies pour la présentation des données lors de l’exécution des procédures. En particulier, la déformation d’oscillation et la contrainte d’oscillation sont importantes lors des expériences de balayage dynamique du protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 17 : Exportation des fichiers du logiciel de contrôle de l’instrument rhéomètre vers un tableur. Une fois les fichiers exportés sous forme de feuilles de calcul, l’analyse des données a été rendue possible à l’aide d’autres logiciels de programmation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de code supplémentaire : Post-traitement des fichiers de données à l’aide d’un programme d’analyse de données. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

L’un des principaux objectifs de l’élaboration de ce protocole est d’établir qu’il est bien adapté à la caractérisation rhéologique du mucus GR lorsque de très petits volumes d’échantillons sont disponibles. Nous reconnaissons que davantage d’échantillons provenant d’un groupe de carpes argentées sont nécessaires pour caractériser pleinement les propriétés rhéologiques du mucus GR et les données présentées ici ne sont pas une généralisation à l’ensemble de la population de carpes argentées. Notre technique est justifiée par son efficacité avec la caractérisation rhéologique de petits volumes d’échantillons et avec des investigations étendues impliquant de plus grands ensembles d’échantillons de mucus.

Les étapes critiques du protocole sont la préparation de solutions de mucus de diverses concentrations, les mesures et l’acquisition de données à l’aide d’un rhéomètre rotatif, ainsi que la représentation graphique et l’analyse des données pour des informations physiques.

Les informations physiques sur les données sur le mucus GR sont tirées des représentations graphiques illustrées à la figure 3 et à la figure 4,qui sont annotées avec les attributs du comportement attendu du matériau. Les valeurs de viscosité (ηo)de la vitesse de déformation à cisaillement nul peuvent être observées à des vitesses de déformation à faible cisaillement où la mobilité des molécules du matériau domine(figure 3A et figure 8A). Les valeurs de viscosité de déformation à cisaillement infini(η ∞)dans les fluides non newtoniens sont inférieures d’un ordre de grandeur à la viscosité du taux de déformation à cisaillement nul. Ces données peuvent être remarquées à des taux de cisaillement élevés où il y a peu ou pas de dépendance aux interactions intermoléculaires(Figure 3A et Figure 8A). Pour les fluides non newtoniens, les viscosités apparentes diminuent progressivement à mesure que les taux de cisaillement augmentent et atteignent une valeur faible constante(figure 3A et figure 8A). Le comportement de rendement dans le mucus GR sous des mesures à l’état d’équilibre peut être représenté avec la pente comme indiqué à la figure 3A et présenté dans l’équation 1., où ηa représente la viscosité apparente, σy est la contrainte d’élasticité (constante) et est le taux de déformation Equation y de cisaillement.

Equation 1

La figure 3A et la figure 8B sont présentées sur une échelle log-logarithme et, par conséquent, l’équation 1 atteint la forme suivante :

Equation 2

où k – représente la limite d’élasticité apparente. Sur une échelle log-log, la viscosité apparente diminue avec une pente de '-1' indique le rendement en matière comme le montre la figure 3A10.  Les concentrations de mucus de 200 mg/mL et 400 mg/mL possédaient des pentes de -1,8 et -0,91, respectivement, et démontrent le comportement de rendement(Figure 8A). Dans les mesures d’oscillation dynamique, les caractéristiques viscoélastiques sont indépendantes de l’amplitude de déformation dans la région viscoélastique linéaire (LVR)(Figure 4). Le comportement de rendement dans le mucus GR sous des mesures d’oscillation dynamique peut être observé lorsque le matériau viscoélastique (mucus GR) pénètre dans la région viscoélastique non linéaire (NLVR) à mesure que le module de stockage (G') diminue(Figure 4). Dans le régime NLVR, le matériau viscoélastique démontrera un comportement de type gel solide si le module de stockage est supérieur au module de perte (G' > G »). Lorsque le module de perte dépasse le module de stockage (G' < G »), un « croisement » entre G' et G » se produit. Comme le montre la figure 7B,C,les concentrations de mucus GR de 200 mg/mL et 400 mg/mL de GR ont démontré un comportement semblable à celui d’un fluide marqué par le « croisement » entre G' et G ». La limite d’élasticité apparente sous les mesures à l’état d’équilibre est représentée comme la valeur moyenne de la contrainte jusqu’à ce qu’un point d’inflexion soit atteint (Figure 3B). Par la suite, la contrainte commence à augmenter fortement avec une augmentation de la vitesse de déformation de cisaillement comme le montrent les figures 3B et 8B. Les données sur le mucus GR (concentrations de 200 mg/mL et 400 mg/mL) ont montré un comportement du fluide d’amincissement par cisaillement jusqu’à ce que le matériau commence à céder (Figure 8A,B). La limite d’élasticité apparente a été clairement observée dans les concentrations de mucus de 200 mg/mL et de 400 mg/mL en raison de leurs caractéristiques non newtoniennes (Figure 8B). La limite d’élasticité apparente sous les mesures d’oscillation dynamique est représentée à la figure 4 et à la figure 7B,C, comme la région de croisement entre les données G et G, suivie des valeurs G dépassant G. Les données de 400 mg / mL de mucus GR ont montré un comportement non newtonien d’amincissement par cisaillement. Le point d’apparition du rendement du matériau a été observé avec une limite d’élasticité apparente d’environ 0,2736 Pa(figure 7C). Les changements de type hydrogel-fluide avec angle de phase (δ = tan-1 (G"/G')) sont présentés dans les figures 4 et 7D-F. L’extréma dans l’angle de phase est associé à un solide hookéen à 0° et à un fluide visqueux à 90° comme le montre la figure 4. Les valeurs d’angle de phase autour de 45° ont été attribuées à la transition du comportement gélifiant du matériau vers un comportement fluide. La concentration de mucus de 400 mg/mL a clairement montré un changement dans la caractéristique du matériau de l’hydrogel à un comportement semblable à un fluide par le processus de rendement avec une contrainte d’élasticité apparente de ~ 0,2736 Pa(Figure 7F).

Comprendre les limites de mesure et éviter les données impropres à l’interprétation physique est un défi avec les fluides biologiques complexes et mous, en particulier dans les études impliquant de petits volumes d’échantillons11. Les données générées sous des effets de faible couple et d’écoulement secondaire ne conviennent pas à l’interprétation physique et dépendent de la géométrie utilisée dans le rhéomètre (comme le cône et la plaque dans cette étude). Ces régimes ont été identifiés pour éviter toute fausse représentation des données expérimentales souffrant de la résolution de l’instrument et des artefacts de mesure en raison de la diffusion de l’élan. Les limites de couple faible(Figure 6A et Figure 8A)sont des fonctions de géométrie et de couple minimal générées par l’instrument (Tableau 1). Dans des conditions de mesure de cisaillement stable, le critère de rejet des données affectées par la limite de faible couple pour une géométrie de cône de rayon (R) avec couple minimal (Tmin = 10 x 10-9 Nm, tableau 1) a été discuté par Ewoldt et al. et est présenté ci-dessous11:

Equation 3

où Equation y est le taux de déformation de cisaillement.  Contrairement aux concentrations de mucus GR de 100 mg/mL, les concentrations de mucus GR de 200 mg/ml et 400 mg/mL de mucus GR n’ont pas été affectées par des effets de faible couple démontrant clairement un comportement d’amincissement au cisaillement non newtonien avec des viscosités élevées à taux de déformation de cisaillement nul élevé à de faibles taux de déformation de cisaillement. Le critère des modules viscoélastiques minimaux mesurables sous les mesures d’oscillation dynamique a été discuté par Ewoldt et al. et présenté ci-dessous (Équation 4)11. Dans l’équation 4, pour une géométrie de plaque conique de rayon (R), le couple minimal sous cisaillement oscillatoire (Tmin = 2 x 10-9 Nm, tableau 1).

Equation 4

où Gmin est le module de stockage (G') ou le module de perte (G ») et est le taux de déformation de cisaillement. Les régimes de limitation de l’instrumentation régis par les effets de faible couple sont indiqués aux figures 6A et 6B. Le régime d’écoulement secondaire sous mesure à l’état d’équilibre est régi par une diffusion vers l’intérieur du fluide au moyen d’un tourbillon résidant dans la géométrie du cône et de la plaque de rotation11. Le schéma d’écoulement secondaire augmente le couple de manière incorrecte, ce qui fait que le fluide semble épaissir par cisaillement(figure 8A). La limite de débit secondaire, proposée par Ewoldt et al. dans la figure 8A, a été tracée en utilisant la relation suivante11:

Equation 5

où L = βR, β est l’angle du cône, R est le rayon du cône, ρ = 1000 kg m-3, Recrit = 4 et Equation y est le taux de cisaillement. Ce régime a aidé à estimer les valeurs de viscosité de la déformation de cisaillement infini (η∞)dans les échantillons de mucus GR.

Une modification du protocole peut être effectuée en utilisant une géométrie de plaque plate au lieu de la géométrie de plaque conique comme indiqué dans le protocole présenté ici. Les essais sur plaque plate doivent être effectués avec une variation paramétrique de l’écart de mesure dans le rhéomètre rotatif pour révéler la dépendance de la limite d’élasticité apparente sur l’écart de mesure et la géométrie. Les améliorations suggérées du protocole présentées dans le présent document sont décrites ci-dessous. Une variation paramétrique de l’amplitude de la déformation dans le régime viscoélastique linéaire (LVR) et de la fréquence d’oscillation doit être effectuée. Des tests de rhéologie « Tack and Peel » doivent être effectués pour développer une compréhension complète de l’adhérence du mucus GR. Les caractéristiques rhéologiques du mucus GR doivent être effectuées sur des ensembles de plus grand volume d’échantillons ainsi que des études visant à mesurer toute trace de cellules sanguines afin de tenir compte de son effet sur les propriétés rhéologiques globales de gr.

Les limites du protocole sont décrites ci-dessous. Les subtilités des procédures d’extraction du mucus GR et la présence de cellules sanguines ou de fragments de tissus dans les échantillons de mucus peuvent influencer la rhéologie du mucus. Cependant, il convient de noter que le mucus utilisé dans le protocole n’avait aucune trace visible de sang. L’échantillon de mucus GR est un matériau hétérogène et peut posséder différentes propriétés rhéologiques en raison de la variance de l’emplacement et des conditions post-extraction. Cette limitation a été corrigée en homogénéisant suffisamment le mucus GR à l’aide d’un agitateur pour décomposer les gros amas de mucus et la présence de tissus. Une autre limitation importante est le très faible volume d’échantillons de mucus GR (environ 1,4 mL), récolté pour des analyses qui limitent une généralisation des propriétés du mucus GR.

L’importance de ce protocole est qu’il permet une caractérisation rhéologique précise des fluides biologiques non newtoniens tels que le mucus. Le protocole présenté ici ouvre la voie à l’étude d’autres fluides biologiques similaires associés aux sécrétions humaines, animales et végétales. En outre, des fluides synthétiques ou des solutions à base de polymères analogues de fluides biologiques peuvent être testés à l’aide de ce protocole pour comprendre les propriétés des matériaux sous des contraintes, des fréquences d’oscillation et des températures variables. Le protocole est bien adapté à la caractérisation rhéologique des fluides biologiques lorsque de très petits volumes d’échantillons sont mis àdisposition.

Le résultat étendu du protocole est que la viscosité apparente et la contrainte d’élasticité apparente du mucus GR faciliteront la création de modèles analytiques pour interpréter les résultats de l’étude hydrodynamique fondamentale de l’alimentation des filtres et des technologies avancées nécessitant et impliquant un écoulement croisé et une filtration membranaire.

L’étude macro-rhéologique postule que le mucus en contact avec les particules alimentaires est initialement, dans un état gélifiant qui sert d’adhésif. Lors de l’initiation des forces d’écoulement et de cisaillement, le mucus atteint une contrainte d’élasticité apparente et subit une déformation plastique. L’exécution du protocole à l’aide d’un rhéomètre rotatif a aidé à caractériser la transition du mucus d’un comportement gélifiant à un comportement fluide. Cette transition a été observée expérimentalement et la limite d’élasticité apparente a été enregistrée à 0,2736 Pa dans des expériences de rhéomètre rotatif. Lorsque les contraintes externes sur le mucus sont inférieures à la contrainte de rendement apparente, le mucus démontrera un comportement semblable à celui d’un gel pour faciliter l’adhésion des particules alimentaires. Lorsque les contraintes externes dépassent la contrainte d’élasticité apparente, le mucus démontrera un comportement d’amincissement par cisaillement qui facilitera le transport des particules alimentaires agglomérées vers les organes digestifs de la carpe argentée.

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Disclosures

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Acknowledgments

Les auteurs reconnaissent le soutien et le financement du GW Center for Biomimetics and Bioinspired Engineering. Nous remercions le professeur L. Patricia Hernandez du Département des sciences biologiques de l’Université George Washington d’avoir inspiré l’enquête et la collaboration continue, d’avoir fourni une expertise biologique sur la physiologie de la carpe argentée et d’avoir fourni les échantillons de mucus. Nous remercions les étudiants, M. David Palumbo, Mme Carly Cohen, M. Isaac Finberg, M. Dominick Petrosino, M. Alexis Renderos, Mme Priscilla Varghese, M. Carter Tegen et M. Raghav Pajjur pour leur aide dans le laboratoire et M. Thomas Evans et M. James Thomas de TA Instruments, New Castle, DE pour leur soutien à la formation et à l’entretien du rhéomètre. Les images des figures 5A,C ont été prises lors d’une dissection effectuée par le professeur L. Patricia Hernandez du Département des sciences biologiques de l’Université George Washington.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Kim Wipes VWR 470224-038 To clean Sample from plate
Gloves VWR 89428-750 To prevent contamination of sample
Pipette VWR 89079-974 To transport sample from vial to rheometer
Pipette Tips Thermo Scientific 72830-042 To transport sample from vial to rheometer
Shaker VWR 89032-094 To homogenously mix sample of mucus
Vials VWR 66008-710 Contains measured sample volumes
Weigh Scale Ohaus Scout –SPX Balances To weigh mass of mucus samples
Chemical Reagents
De-Ionized Water (H20) - - Liquid
Sterile 70% Isopropanol (C3H8O) VWR 89108-162 Liquid
GR Mucus
100 mg/mL concentration, 2mL - - Viscoelastic Material
400 mg/mL concentration, 1mL - - Viscoelastic Material
200 mg/mL concentration, 1mL - - Viscoelastic Material
Software
MATLAB Mathworks R2017a Data analysis, post-processing and graphical representation
Trios TA Instruments v4.5.042498 Rheometer instrument control and analysis software

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Ingénierie Numéro 161 carpe argentée mucus rhéologie alimentation par filtre rhéométrie fluides biologiques hydrogels
Caractérisation macro-rhéologique du mucus gill raker chez la carpe argentée, <em>Hypophthalmichthys molitrix</em>
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Bulusu, K. V., Racan, S., Plesniak, M. W. Macro-Rheology Characterization of Gill Raker Mucus in the Silver Carp, Hypophthalmichthys molitrix. J. Vis. Exp. (161), e61379, doi:10.3791/61379 (2020).

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