Caracterización macro-reológica del moco rastrillo branquial en la carpa plateada, Hypophthalmichthys molitrix
Summary
Este protocolo presenta un método para realizar la caracterización reológica del moco que reside en los rastrillos branquiales (GUR) de la carpa plateada. Las características viscoelásticas del MOG-GR, obtenidas midiendo la viscosidad, el almacenamiento y los módulos de pérdida, se evalúan para el estrés de rendimiento aparente para comprender el mecanismo de alimentación del filtro en los RR.
Abstract
La carpa plateada, Hypophthalmichthys molitrix,es un pez alimentador de filtro planctívoro invasor que infestó las vías fluviales naturales de la cuenca superior del río Mississippi debido a su mecanismo de alimentación por filtro altamente eficiente. Los órganos característicos llamados rastrillos branquiales (RDA), que se encuentran en muchos de estos alimentadores de filtro, facilitan la filtración eficiente de partículas de alimentos como el fitoplancton que son de unas pocas micras de tamaño.
La motivación para investigar la reología del moco GR proviene de nuestro deseo de comprender su papel en la ayuda al proceso de alimentación por filtro en la carpa plateada. El líquido rico en moco, en un estado “espeso y pegajoso” puede facilitar la adhesión de las partículas de los alimentos. La permeación y el transporte a través de la membrana GR se ven facilitados por la acción de fuerzas de cizallamiento externas que inducen diferentes tasas de deformación por cizallamiento. Por lo tanto, la reología del moco puede proporcionar una pista vital sobre la tremenda naturaleza de la carpa plateada dentro del grupo de peces que se alimentan por filtro. Sobre la base de esto, se postuló que el moco GR puede proporcionar una función adhesiva a las partículas de alimentos y actuar como un vehículo de transporte para ayudar en el proceso de alimentación del filtro.
El objetivo principal del protocolo es determinar la tensión de rendimiento del moco, atribuida a la tensión de cizallamiento mínima requerida para iniciar el flujo en el que se observa por primera vez una deformación plástica irreversible a través de un material viscoelástico estructurado. En consecuencia, las propiedades reológicas del moco GR, es decir, la viscosidad, el almacenamiento y los módulos de pérdida, se investigaron por su naturaleza no newtoniana, adelgazamiento por cizallamiento utilizando un reómetro rotacional.
Un protocolo presentado aquí se emplea para analizar las propiedades reológicas del moco extraído de los rastrillos branquiales de una carpa plateada, pescado en la ubicación de Hart Creek del río Missouri. El protocolo tiene como objetivo desarrollar una estrategia efectiva para las pruebas reológicas y la caracterización de materiales de moco que se supone que es un material viscoelástico estructurado.
Introduction
La carpa plateada, Hypophthalmichthys molitrix,es un alimentador de filtro planctívoro y una especie invasora que se ha infiltrado en varias vías fluviales naturales en los Estados Unidos. Esta especie se introdujo inicialmente en la cuenca alta del río Mississippi para controlar las floraciones de algas1,2,3. La carpa plateada es un alimentador extremadamente eficiente. Por lo general, sus tamaños de partículas de alimentos consumibles varían de 4 a 20 μm a zooplancton más grande que son alrededor de 80 μm3,4,5. Esta especie ha superado a otros peces nativos y potencialmente puede causar enormes daños a las vías fluviales nativas al limitar los recursos disponibles1,2,6. Por lo tanto, los peces que se alimentan por filtro como la carpa plateada y la carpa cabe cabeza grande representan una gran amenaza para los Grandes Lagos1,2,6,7,8.
Los peces que se alimentan por filtro poseen órganos especiales llamados rastrillos branquiales (RDA) con una capa delgada de moco que reside en su superficie. Estos órganos mejoran la eficiencia de filtración y agregación de pequeñas partículas del fluido entrante. El objetivo del protocolo presentado en este documento es caracterizar la propiedad no newtoniana del material de adelgazamiento por cizallamiento y la tensión de rendimiento del moco GR adquirido de la superficie interna de los rastrillos branquiales en la carpa plateada. El valor de la tensión de rendimiento del GR-moco, determinado mediante un reómetro rotacional, es de interés en este estudio. La tensión de rendimiento medida, también llamada “tensión de rendimiento aparente”, depende de los métodos de prueba, como la velocidad de cizallada constante o la deformación oscilatoria dinámica tipo9,10. El adelgazamiento por cizallamiento, ‘fluido de estrés de rendimiento’, experimenta una transición de un comportamiento sólido a un comportamiento líquido en una tensión crítica aplicada9,11. La tensión de rendimiento aparente es la tensión de cizallamiento mínima requerida para iniciar el flujo o aquella en la que se observa por primera vez una deformación plástica irreversible cuando el moco pasa de un material similar a un gel a un material similar a un fluido. Este comportamiento se puede observar en materiales viscoelásticos estructurados. La transición del comportamiento similar a un gel a un comportamiento fluido del moco GR implica dos funciones, es decir, un papel adhesivo para recolectar partículas de alimentos y un papel de vehículo de transporte para ayudar en el proceso de entrega y filtración de partículas. La función extendida del moco incluye la creación de barreras de difusión en la resistencia a las enfermedades y la respiración, proporcionando una liberación controlada de factores nutricionales, componentes tóxicos y excreción, creando vías metabólicas para la alimentación y la anidación, ayudando en la protección de los depredadores y produciendo modificaciones de la capa límite que mejoran la locomoción y la eficiencia propulsiva12,13,14.
A diferencia de los fluidos simples, los fluidos complejos como el moco poseen propiedades que varían con las condiciones de flujo y requieren parámetros de medición adicionales para definir su comportamiento físico a gran escala. Para controlar la viscosidad y el estrés por rendimiento del moco GR, las mediciones reológicas se realizan utilizando un reómetro rotacional. El reómetro rotacional aplica una tensión o tensión de cizallamiento constante u oscilatoria por medio de un disco giratorio en contacto con la muestra de fluido y mide su respuesta. La razón detrás del uso de este instrumento y técnica es que el reómetro puede proporcionar un conjunto de mediciones para describir las propiedades materiales del moco GR de la carpa plateada, que no se pueden definir solo por la viscosidad.
El moco es un material viscoelástico y su respuesta mecánica a una deformación impuesta es entre la de un sólido puro (regido por la ley de elasticidad de Hooke) y el de un líquido puro (regido por la ley de viscosidad de Newton)15,16. La compleja red macromolecular contenida dentro del moco puede estirarse y reorientarse en respuesta a fuerzas externas o deformación. Un reómetro rotacional se compone de una geometría de cono y una placa de Peltier como se muestra en la Figura 1 y la Figura 2 (consulte la Tabla 1 para las especificaciones de instrumentación). El objetivo de este estudio fue desarrollar un protocolo para determinar las propiedades reológicas del moco GR. Una ventaja del reómetro rotacional sobre un viscosímetro es su capacidad para realizar mediciones dinámicas utilizando pequeños volúmenes de muestra. El volumen de la muestra de moco GR en este estudio fue de aproximadamente 1,4 ml. El viscosímetro, por otro lado, está limitado a velocidades de cizallamiento constantes y requiere grandes volúmenes de muestra.
Se espera que las propiedades reológicas del moco varíen mucho dentro de la anatomía de la carpa plateada. Por ejemplo, las propiedades del moco que reside en las superficies GR pueden ser diferentes del órgano epibranquial. Para tener en cuenta la variabilidad potencial de las propiedades del moco en diferentes regiones del pez, la muestra de moco GR adquirida se diluyó y se crearon y probaron soluciones de tres concentraciones utilizando el reómetro rotacional. Los datos y resultados relativos a la reología del moco informados tras la ejecución del protocolo demostraron la eficacia de la técnica de medición. Los datos ilustrativos presentados en este documento no están destinados a generalizarse en toda la población de carpa plateada. El protocolo presentado en este documento se puede extender para investigar la reología del moco en conjuntos de muestras más grandes para probar otras hipótesis.
El propósito de este estudio es demostrar la variación de las propiedades reológicas de la reología del moco GR con tres concentraciones diferentes de moco (400 mg/mL, 200 mg/mL y 100 mg/mL). La concentración de 400 mg/ml representa la muestra de moco crudo cosechada de los GRs de pescado. Se utilizó agua desionizada (DI) para diluir la muestra de moco crudo en concentraciones de 200 mg/mL y 100 mg/mL. La dilución de las muestras de moco permitió la evaluación del grado de adelgazamiento por cizallamiento y la tensión aparente del rendimiento en función de la concentración y la determinación de la concentración a la que el moco GR pasa a un comportamiento no newtoniano. Se utilizó un agitador para descomponer cualquier grupo grande de moco en las muestras para mitigar los errores en los datos reológicos debido a la no homogéneidad.
En la mayoría de los vertebrados, incluidos los peces, las macromoléculas formadoras de moco predominantes son las glicoproteínas (mucinas) que tienden a hincharse en el agua por enredos o reticulaciones químicas y crean un material similar a un gel12,13,17,18,19,20. Las macromoléculas formadoras de gel de alto peso molecular y el alto contenido de agua reflejan el deslizamiento en el moco13. Un alto grado de interacciones inter-macromoleculares conduce a la formación de gel, mientras que los niveles más bajos de interacciones inter-macromoleculares o enlaces rotos dan como resultado fluidos de alta viscosidad21.
Los procesos de filtración de partículas de alimentos en peces que se alimentan por filtro son ayudados por propiedades relacionadas con el moco GR, como la cohesión y la viscosidad, que determinan su potencial de adhesión yadherencia 22. La fuerza de la adhesión basada en moco depende de interacciones intermoleculares, electrostáticas o hidrofóbicas específicas23. Sanderson et al.24 realizaron un estudio de alimentación en suspensión en peces negros en el que encontraron la evidencia de adhesión basada en moco. Afirmaron que la adhesión de partículas de alimentos en suspensión con una superficie mucosa es seguida por el transporte de grupos agregados de partículas unidas con el moco por el flujo de agua dirigido que actúa sobre él24. El moco expuesto a las tasas de tensión de cizalla generadas por el flujo de agua facilita la entrega de partículas de alimentos a los órganos digestivos. Se utilizaron técnicas endoscópicas para observar partículas filtradas24.
La literatura sobre el rango de las tasas de cizallamiento y los límites prácticos en las pruebas reológicas del moco GR es escasa. Por lo tanto, se buscó orientación de estudios reológicos sobre moco gástrico, nasal, cervical y pulmonar, moco de piel de salmón, limo de pez bruja y lubricante de superficie de articulación ósea en los que se estudió la caracterización reológica y los atributos no newtonianos11,12, 25,26, 27,28,29,30,31. Más recientemente, el efecto del moco de la piel de los peces en la locomoción y la eficiencia propulsiva se ha estudiado utilizando viscometría de velocidad de cizallamiento constante. Los estudios de reología del moco cutánico (sin ninguna dilución u homogeneización) relacionados con la dorada, la lubina y la exigua demostraron un comportamiento no newtoniano a tasas de cizallamiento típicamente bajas14. En otro estudio relacionado, se encontró que las muestras de moco cutángeo crudo de los lados dorsal y ventral del lenguado senegalés exhiben un comportamiento no newtoniano, lo que indica una mayor viscosidad del moco ventral a todas las tasas de cizallamiento consideradas32. Otros protocolos reológicos relacionados con el desarrollo del andamio de hidrogel y para suspensiones altamente concentradas utilizando un viscosímetro de velocidad de cizallamiento constante también han sido reportados en la literatura33,34.
En este estudio, las propiedades del moco GR se investigaron utilizando un reómetro rotacional controlado por la velocidad de deformación que ha sido ampliamente utilizado en experimentos de reología en fluidos biológicos complejos25. Para los fluidos newtonianos, la viscosidad aparente permanece constante, es independiente de la velocidad de cizallamiento y las tensiones de cizallamiento varían linealmente con las tasas de deformación de cizallamiento(Figura 3A,B). Para fluidos no newtonianos (como los fluidos de adelgazamiento por cizallamiento) la viscosidad depende de la velocidad de cizallamiento o de la historia de la deformación(Figura 3A,B). El módulo de pérdida (G”) representa la medida en que el material resiste la tendencia a fluir y es representativo de la viscosidad del fluido(Figura 4). El módulo de almacenamiento (G’) representa la tendencia del material a recuperar su forma original después de la deformación inducida por tensión y es equivalente a la elasticidad (Figura 4). El ángulo de fase (δ) o valor tangente de pérdida, se calcula a partir de la tangente inversa de G”/G’. Representa el equilibrio entre la pérdida de energía y el almacenamiento y también es un parámetro común para caracterizar materiales viscoelásticos (δ = 0° para un sólido hookeo; δ = 90° para un líquido viscoso; δ 45° para un líquido viscoelástico) (Figura 4)25. La tensión de rendimiento aparente (σy) en fluidos estructurados representa un cambio de estado que se puede observar en los datos reológicos de barrido en estado estacionario y barridos dinámicos de tensión-deformación10. Si la tensión externa aplicada es menor que la tensión de rendimiento aparente, el material se deformará elásticamente. Cuando la tensión excede la tensión de rendimiento aparente (marcada como “tensión promedio” en la Figura 3B),el material pasará de la deformación elástica a la plástica y comenzará a fluir en su estado líquido35. La medición del módulo de almacenamiento (G’) y el módulo de pérdida (G”) en la muestra de moco en condiciones de tensión oscilatoria (o deformación) cuantifica el cambio en el estado del material de un comportamiento similar al gel al viscoelástico similar al líquido.
Los tipos de pruebas de reómetro realizadas para monitorear datos relacionados con el módulo de almacenamiento (G’), el módulo de pérdida (G”) y la viscosidad aparente (η) se describen aquí. Las pruebas de oscilación dinámica (barridos de deformación y barridos de frecuencia) monitorearon G’ y G” bajo oscilación controlada de la geometría del cono. Las pruebas de barrido de deformación dinámica determinaron la región viscoelástica lineal (LVR) del moco mediante el monitoreo de la respuesta intrínseca del material(Figura 4). Se utilizaron barridos de deformación para determinar el comportamiento de rendimiento a una frecuencia y temperatura de oscilación constantes. Las pruebas de barrido de frecuencia dinámica monitorearon la respuesta del material al aumento de la frecuencia (tasa de deformación) a una amplitud y temperatura constantes (tensión o tensión). La deformación se mantuvo en la región viscoelástica lineal (LVR) para las pruebas de barrido de frecuencia dinámica. Las pruebas de velocidad de cizallado en estado estacionario monitorearon la viscosidad aparente (η) bajo rotación constante de la geometría del cono. El moco GR se sometió a pasos de tensión incrementales y la viscosidad aparente (η, Pa.s) se monitoreó para variar la velocidad de cizallamiento (ý, 1/s).
El protocolo presentado en este trabajo trata el moco GR como un material estructurado complejo de viscoelasticidad desconocida con un cierto rango de respuesta viscoelástica lineal. El moco de pescado fue extraído de los RR de la carpa plateada durante una expedición de pesca en la ubicación de Hart Creek en el río Missouri por la profesora L. Patricia Hernández (Departamento de Ciencias Biológicas, The George Washington University) 1,2,36. Una matriz de RDA dentro de la boca de una carpa plateada se muestra en la Figura 5A y un dibujo esquemático se presenta en la Figura 5B. Un GR extirpado se muestra en la Figura 5C. La extracción de moco de los ER de la carpa plateada se presenta como ejemplo en los dibujos esquemáticos, Figura 5D,E. Todas las pruebas del reómetro se realizaron bajo una temperatura constante y controlada de 22 ± 0.002 ° C, la temperatura registrada en el sitio de pesca1,2,36. Cada muestra de moco se probó tres veces con el reómetro, y los resultados promediados se presentan junto con las barras de error estadístico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uno de los principales objetivos del desarrollo de este protocolo es establecer que es adecuado para la caracterización reológica del moco GR cuando se dispone de volúmenes de muestra muy pequeños. Reconocemos que se necesitan más muestras de una escuela de carpa plateada para caracterizar completamente las propiedades reológicas del moco GR y los datos presentados aquí no son una generalización en toda la población de carpa plateada. Nuestra técnica se justifica por su eficacia con la caracterización reológi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen el apoyo y la financiación del GW Center for Biomimetics and Bioinspired Engineering. Agradecemos a la profesora L. Patricia Hernández del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad George Washington por inspirar la investigación y la colaboración continua, proporcionar experiencia biológica en la fisiología de la carpa plateada y proporcionar las muestras de moco. Agradecemos a los estudiantes, el Sr. David Palumbo, la Sra. Carly Cohen, el Sr. Isaac Finberg, el Sr. Dominick Petrosino, el Sr. Alexis Renderos, la Sra. Priscilla Varghese, el Sr. Carter Tegen y el Sr. Raghav Pajjur por su ayuda en el laboratorio y al Sr. Thomas Evans y el Sr. James Thomas de TA Instruments, New Castle, DE por su apoyo con la capacitación y el mantenimiento del reómetro. Las imágenes para las Figuras 5A, C fueron tomadas durante una disección realizada por la profesora L. Patricia Hernández del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad George Washington.
Materials
| Materials | |||
| Kim Wipes | VWR | 470224-038 | To clean Sample from plate |
| Gloves | VWR | 89428-750 | To prevent contamination of sample |
| Pipette | VWR | 89079-974 | To transport sample from vial to rheometer |
| Pipette Tips | Thermo Scientific | 72830-042 | To transport sample from vial to rheometer |
| Shaker | VWR | 89032-094 | To homogenously mix sample of mucus |
| Vials | VWR | 66008-710 | Contains measured sample volumes |
| Weigh Scale | Ohaus | Scout –SPX Balances | To weigh mass of mucus samples |
| Chemical Reagents | |||
| De-Ionized Water (H20) | – | – | Liquid |
| Sterile 70% Isopropanol (C3H8O) | VWR | 89108-162 | Liquid |
| GR Mucus | |||
| 100 mg/mL concentration, 2mL | – | – | Viscoelastic Material |
| 400 mg/mL concentration, 1mL | – | – | Viscoelastic Material |
| 200 mg/mL concentration, 1mL | – | – | Viscoelastic Material |
| Software | |||
| MATLAB | Mathworks | R2017a | Data analysis, post-processing and graphical representation |
| Trios | TA Instruments | v4.5.042498 | Rheometer instrument control and analysis software |
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