Summary
Denne protokollen presenterer en metode for å utføre reologikarakterisering av slim som ligger på gill rakers (GRs) av sølvkarpe. Viskoelastiske egenskaper av GR-slim, oppnådd ved måling av viskositet, lagring og tap moduli, evalueres for tilsynelatende utbytte stress for å forstå filterfôringsmekanismen i GRs.
Abstract
Sølvkarpe, Hypophthalmichthys molitrix, er en invasiv planktivorøs filtermaterfisk som infiserte de naturlige vannveiene i øvre Mississippi River-bassenget på grunn av sin svært effektive filterfôringsmekanisme. De karakteristiske organene kalt gill rakers (GRs), som finnes i mange slike filtermatere, letter effektiv filtrering av matpartikler som planteplankton som er av noen få mikroner i størrelse.
Motivasjonen til å undersøke rheologien til GR-slimet stammer fra vårt ønske om å forstå sin rolle i å hjelpe filterfôringsprosessen i sølvkarpe. Den slimrike væsken, i en "tykk og klebrig" tilstand, kan lette vedheft av matpartikler. Permeasjonen og transporten gjennom GR-membranen forenkles ved virkningen av ytre skjærkrefter som induserer varierende skjærstammehastigheter. Derfor kan slimreologi gi en viktig anelse om sølvkarpeens enorme utkonkurrerende natur innenfor bassenget med filterfôring av fisk. Basert på dette ble det hevdet at GR-slim kan gi en limfunksjon til matpartikler og fungere som et transportkjøretøy for å hjelpe til med filterfôringsprosessen.
Hovedmålet med protokollen er å bestemme utbyttespenningen til slimet, tilskrevet minimumsskjærspenningen som kreves for å initiere strømning der irreversibel plastdeformasjon først observeres over et strukturert viskoelastisk materiale. Følgelig ble reologiske egenskaper til GR-slimet, det vil si viskositet, lagring og tapsmoduli, undersøkt for sin ikke-newtonske, skjærfortynnende natur ved hjelp av et rotasjonsreometer.
En protokoll presentert her brukes til å analysere de reologiske egenskapene til slim hentet fra gill rakers av en sølv karpe, fisket på Hart Creek plassering av Missouri. Protokollen tar sikte på å utvikle en effektiv strategi for reologisk testing og materialkarakterisering av slim antatt å være et strukturert viskoelastisk materiale.
Introduction
Sølvkarpe, Hypophthalmichthys molitrix, er en planktivorisk filtermater og en invasiv art som har infiltrert flere naturlige vannveier i USA. Denne arten ble opprinnelig introdusert i øvre Mississippi River-bassenget for å kontrollere algeoppblomstringer1,2,3. Sølvkarpe er en ekstremt effektiv mater. Vanligvis varierer dens forbruksvarer matpartikkelstørrelser fra 4 til 20 μm til større dyreplankton som er rundt 80 μm3,4,5. Denne arten har utkonkurrert annen innfødt fisk og kan potensielt forårsake enorm skade på innfødte vannveier ved å begrense tilgjengelige ressurser1,2,6. Dermed utgjør filterfôring av fisk som sølvkarpe og bighead karpe en stor trussel mot Great Lakes1,2,6,7,8.
Filterfôringsfisk har spesielle organer kalt gill rakers (GRs) med et tynt lag slim som bor på overflaten. Disse organene forbedrer effektiviteten av filtrering og aggregering av små partikler fra innkommende væske. Målet med protokollen som presenteres her er å karakterisere den ikke-newtonske, skjærfortynnende materialegenskapen og gi stress av GR-slimet som er anskaffet fra den indre overflaten av gill rakers i sølvkarpe. Verdien av utbyttespenningen til GR-slimet, fastslått ved hjelp av et rotasjonsreometer, er av interesse i denne studien. Det målte utbyttestresset som også kalles "tilsynelatende utbyttestress" avhenger av testmetodene som jevn skjærhastighet- eller dynamisk oscillatorisk belastningstype9,10. Skjærfortynnende, "utbyttestressvæske", gjennomgår en overgang fra solid-lignende til væskelignende oppførsel ved kritisk anvendt stress9,11. Det tilsynelatende utbyttestresset er det minste skjærstresset som kreves for å initiere strømning, eller at irreversibel plastisk deformasjon først observeres når slimet går over fra et gellignende materiale til et væskelignende materiale. Denne oppførselen kan observeres i strukturerte viskoelastiske materialer. Overgangen fra gellignende til væskelignende oppførsel av GR-slimet innebærer to funksjoner, det vil si en limrolle for å samle matpartikler og en transportkjøretøyrolle for å hjelpe til med partikkelleverings- og filtreringsprosessen. Slimets utvidede funksjon inkluderer å skape diffusjonsbarrierer i sykdomsresistens og åndedrett, gi kontrollert frigjøring av ernæringsmessige faktorer, giftige komponenter og utskillelse, skape metabolske veier for fôring og nesting, hjelpe til med rovdyrbeskyttelse og produsere grenselagmodifikasjoner som forbedrer bevegelse og fremdriftseffektivitet12,13,14.
I motsetning til enkle væsker har komplekse væsker som slimet egenskaper som varierer med strømningsforholdene og krever ytterligere måleparametere for å definere deres fysiske masseskala oppførsel. For å overvåke viskositeten og utbyttespenningen til GR-slim, utføres reologiske målinger ved hjelp av et rotasjonsreometer. Rotasjonsreometeret påfører en jevn eller oscillatorisk skjærspenning eller belastning ved hjelp av en roterende disk i kontakt med væskeprøven og måler responsen. Begrunnelsen bak bruk av dette instrumentet og teknikken er at reometeret kan gi et sett med målinger for å beskrive materialegenskapene til GR-slimet til sølvkarpe, som ikke kan defineres av viskositet alene.
Slimet er et viskoelastisk materiale, og dets mekaniske respons på en pålagt deformasjon er mellom en ren fast (styrt av Hookes elastisitetslov) og den til en ren væske (styrt av Newtons viskositetslov)15,16. Det komplekse makromolekylære nettverket i slimet kan strekke seg og reorientere som svar på ytre krefter eller deformasjon. Et rotasjonsreometer består av en kjeglegeometri og en peltierplate som vist i figur 1 og figur 2 (se tabell 1 for instrumenteringsspesifikasjoner). Hensikten med denne studien var å utvikle en protokoll for å bestemme de reologiske egenskapene til GR-slimet. En fordel med rotasjonsreometeret over et viskosimometer er dets evne til å gjøre dynamiske målinger ved hjelp av små prøvevolumer. GR slimprøvevolumet i denne studien var ca. 1,4 ml. Viskosimometeret er derimot begrenset til konstante skjærhastigheter og krever store prøvevolumer.
Slimets reologiske egenskaper forventes å variere sterkt innenfor sølvkarpeanatomien. For eksempel kan egenskapene til slimet som bor på GR-overflatene være forskjellige fra epibranchialorganet. For å ta hensyn til potensiell variasjon av slimegenskaper i forskjellige regioner av fisken, ble den oppkjøpte GR-slimprøven fortynnet, og løsninger av tre konsentrasjoner ble opprettet og testet ved hjelp av rotasjonsreometeret.. Dataene og resultatene angående slimreologi rapportert etter utførelse av protokollen viste effekten av måleteknikken. De illustrerende dataene som presenteres i dette dokumentet er ikke ment å bli generalisert over hele sølvkarpepopulasjonen. Protokollen som presenteres her, kan utvides til å undersøke slimreologi på tvers av større prøvesett for å teste andre hypoteser.
Hensikten med denne studien er å demonstrere variasjonen av reologiske egenskaper ved GR slimreologi med tre forskjellige slimkonsentrasjoner (400 mg/ml, 200 mg/ml og 100 mg/ml). Konsentrasjonen på 400 mg/ml representerer den rå slimprøven som høstes fra fisken GRs. Deionisert vann (DI) ble brukt til å fortynne rå slimprøven i konsentrasjoner på 200 mg/ml og 100 mg/ml. Fortynning av slimprøvene tillot evaluering av graden av skjærfortynnende og tilsynelatende utbyttestress som konsentrasjonsfunksjon og bestemmelse av konsentrasjonen der GR-slimet går over til ikke-newtonsk oppførsel. En shaker ble brukt til å bryte ned store klumper av slim i prøvene for å redusere feil i reologiske data på grunn av inhomogenitet.
I de fleste vertebrater, inkludert fisk, er de dominerende slimdannende makromolekylene glykoproteiner (mucins) som har en tendens til å svulme i vann ved sammenfiltring eller kjemisk krysskobling og lage et gellignende materiale12,13,17,18,19,20. Den høymolekylære, geldannende makromolekylene og høyvannsinnholdet gjenspeiler glattheten islimet 13. En høy grad av intermakromolekylære interaksjoner fører til geldannelse, mens lavere nivåer av intermakromolekylære interaksjoner eller ødelagte bindinger resulterer i væsker med høy viskositet21.
Prosessene for matpartikkelfiltrering i filterfôring av fisk er hjulpet av GR slimrelaterte egenskaper som samhørighet og viskositet som bestemmer potensialet for vedheft og tack22. Styrken av slimbasert vedheft avhenger av spesifikke intermolekylære, elektrostatiske eller hydrofobe interaksjoner23. Sanderson et al.24 gjennomførte en suspensjonsfôringsstudie i svartfisk hvor de fant bevis for slimbasert vedheft. De uttalte at vedheft av suspendert matpartikler med en slimhinneoverflate etterfølges av transport av aggregerte klumper av partikler bundet sammen med slim ved rettet vannstrøm som virker på den24. Slimet utsatt for skjærstammehastigheter generert fra vannstrøm letter levering av matpartikler til fordøyelsesorganer. Endoskopiske teknikker ble brukt til å observere filtrerte partikler24.
Litteratur om omfanget av skjærrater og praktiske grenser i reologisk testing av GR-slim er knapp. Derfor ble det søkt veiledning fra reologiske studier på mage-, nese-, livmorhals- og lungeslim, lakseskinnsslim, hagfish slim og benledd overflatesmøremiddel der den reologiske karakteriseringen og ikke-newtonske egenskapene ble studert11,12,25,26,27,28,29,30,31. Mer nylig har effekten av fiskeskinnsslim på bevegelse og fremdriftseffektivitet blitt studert ved hjelp av konstant skjærhastighetsviscometry. Hud slim reologi studier (uten fortynning eller homogenisering) knyttet til seabream, havabbor og meagre demonstrert ikke-newtonsk oppførsel ved typisk lave skjær rater14. I en annen relatert studie ble de rå hudslimprøvene fra dorsale og ventrale sider av den senegalesiske sålen funnet å vise ikke-newtonsk oppførsel, noe som indikerer en høyere viskositet av det ventrale slimet i alle skjærhastigheter vurdert32. Andre reologiske protokoller knyttet til hydrogel stillas utvikling og for svært konsentrert suspensjoner ved hjelp av en konstant skjær rate viscometer har også blitt rapportert i litteraturen33,34.
I denne studien ble GR-slimegenskapene undersøkt ved hjelp av en strekkhastighet kontrollert, rotasjonsreometer som har blitt mye brukt i reologiforsøk på komplekse biologiske væsker25. For newtonske væsker forblir den tilsynelatende viskositeten konstant, er skjærhastighetsuavhengig og skjærspenningene varierer lineært med skjærstammehastigheter (Figur 3A, B). For ikke-newtonske væsker (for eksempel skjærfortynnende væsker) er viskositet skjærhastighetsavhengig eller deformasjonshistorikkavhengig (figur 3A, B). Tapsmodulus (G") representerer i hvilken grad materialet motstår tendensen til å strømme og er representativ for væskeviskositet (figur 4). Lagringsmodulus (G') representerer tendensen til at materialet gjenoppretter sin opprinnelige form etter stressindusert deformasjon og tilsvarer elastisitet (figur 4). Fasevinkelen (δ) eller taps tangentverdien beregnes ut fra den inverse tangens til G"/G". Det representerer balansen mellom energitap og lagring og er også en vanlig parameter for karakterisering av viskoelastiske materialer (δ = 0° for et hookean fast stoff; δ = 90° for en viskøs væske; δ < 45° for et viskoelastisk fast stoff og δ > 45° for en viskoelastisk væske) (Figur 4)25. Det tilsynelatende utbyttestresset (σy) i strukturerte væsker representerer en tilstandsendring som kan observeres i reologiske data fra steady state sweep og dynamisk stressstamme feier10. Hvis det eksterne påførte stresset er mindre enn det tilsynelatende utbyttestresset, vil materialet deformeres elastisk. Når stresset overstiger det tilsynelatende utbyttestresset (merket som "gjennomsnittlig stress" i figur 3B), vil materialet gå fra elastisk til plastisk deformasjon og begynne å strømme i flytende tilstand35. Måling av lagringsmodulus (G') og tapsmodulus (G") i slimprøven under oscillatorisk stress (eller belastning) kvantifiserer endringen i materialtilstanden fra gellignende til viskoelastisk væskelignende oppførsel.
Typer reometertester utført for å overvåke data knyttet til lagringsmodulus (G'), tapsmodulus (G") og tilsynelatende viskositet (η) er beskrevet her. De dynamiske oscillasjonstestene (strekksveip og frekvenssveip) overvåket G' og G" under kontrollert oscillasjon av kjeglegeometri. De dynamiske strekksveiptestene bestemte det lineære viskoelastiske området (LVR) i slimet ved å overvåke den iboende materialresponsen (figur 4). Stammesveiper ble brukt til å bestemme utbyttets oppførsel ved konstant oscillasjonsfrekvens og temperatur. De dynamiske frekvenssveiptestene overvåket materialresponsen på økende frekvens (deformasjonshastighet) ved en konstant amplitude (belastning eller stress) og temperatur. Stammen ble opprettholdt i det lineære viskoelastiske området (LVR) for de dynamiske frekvenssveiptestene. Steady-state skjærhastighetstester overvåket den tilsynelatende viskositeten (η) under jevn rotasjon av kjeglegeometrien. GR-slimet ble utsatt for trinnvise stresstrinn og tilsynelatende viskositet (η, Pa.s) ble overvåket for varierende skjærhastighet (ý, 1/s).
Protokollen som presenteres i dette dokumentet behandler GR-slimet som et komplekst strukturert materiale av ukjent viskoelastisitet med et bestemt lineært viskoelastisk responsområde. Fiskeslimet ble hentet ut av GRs av sølvkarpe under en fiskeekspedisjon ved Hart creek-stedet i Missouri-elven av professor L. Patricia Hernandez (Department of Biological Sciences, The George Washington University) 1,2,36. En matrise med GR-er inne i munnen på en sølvkarpe vises i figur 5A, og en skjematisk tegning presenteres i figur 5B. En utskilt GR vises i figur 5C. Utvinning av slim fra GRs av sølvkarpe presenteres som et eksempel i skjematiske tegninger, Figur 5D, E. Alle revometertestene ble utført under en konstant, kontrollert temperatur på 22 ± 0,002 °C, temperaturen som ble registrert på fiskestedet1,2,36. Hver slimprøve ble testet tre ganger med reometeret, og de gjennomsnittlige resultatene presenteres sammen med de statistiske feilfeltene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av slimløsninger av ulike konsentrasjoner
MERK: Tre konsentrasjoner av slimoppløsningen (henholdsvis 400 mg/ml, 200 mg/ml og 100 mg/ml med omtrentlige volumer, henholdsvis 1 ml, 1 ml og 2 ml) fremstilles for dette eksperimentet.
- For å beregne massen av slimet, mål gjennomsnittsmassen av hetteglassene med (Mmed-slim ; mg) og uten slim (Mhetteglass ; mg). Trekk deretter massen av hetteglassene med slim med det uten slim (Mslim = M medslim - Mhetteglass ; mg).
- Fortynn slimet i tre konsentrasjoner (400, 200, 100, mg/ml) med deionisert (DI) vann.
- Forbered den første konsentrasjonen av slimoppløsningen, 400 mg / ml ved å tilsette 0,6 ml DI-vann til slimet ved hjelp av en mikropipette.
MERK: Siden det omtrentlige volumet av det ekstraherte slimet var 1,4 ml, vil 400 mg / ml-løsningen ha et totalt volum på ~ 2 ml. - Plasser hetteglasset med 400 mg/ml slimoppløsning på en shaker for å sikre at slimoppløsningen er tilstrekkelig homogenisert, og eventuell slimpartikkelagglomerasjon reduseres.
- Forbered den andre konsentrasjonen av slimoppløsningen, 200 mg / ml, ved å trekke halvparten av volumet av den første konsentrasjonsslimløsningen inn i et nytt hetteglass ved hjelp av en mikropipette og tilsett 1 ml DI-vann i det nye hetteglasset.
- Gjenta trinn 1.2.2 for første og andre hetteglass med slimløsninger.
- Forbered den tredje konsentrasjonen av slimoppløsningen, 100 mg/ml, ved å trekke halvparten av volumet (1 ml) av 200 mg/ml-oppløsningen inn i et nytt hetteglass ved hjelp av en mikropipette og tilsett DI-vann i det nye hetteglasset.
- Gjenta trinn 1.2.2 for alle tre konsentrasjonene av slimløsninger i sine respektive hetteglass (se Supplerende figur 1).
- Oppbevar hetteglassene med slimoppløsning i kjøleskap til reometerkalibrering og testing er utført.
- Forbered den første konsentrasjonen av slimoppløsningen, 400 mg / ml ved å tilsette 0,6 ml DI-vann til slimet ved hjelp av en mikropipette.
2. Målinger og datainnsamling ved hjelp av et reometer
MERK: Programvaren som brukes i denne protokollen for instrumentkontroll og datainnsamling med reometer er notert i materialtabellen. Denne programvaren vil bli referert til som 'rheometer instrument control software'.
- Sett opp og kalibrer reometerinstrumentet.
- Slå på trykklufttilførselen til revometeret og sørg for at det pneumatiske bordet og revometeret er nivellert ved hjelp av en boblemåler. Vri av beskyttelseshetten på reometerakselen og hold akselen stille mens du skrur av.
- Slå på reometerets hovedbrytere for å aktivere de magnetiske lagrene på reometeret.
- Slå på reometerkontrolldatamaskinen med programvaren for reometerinstrumentkontroll installert i den, og start programvaren for reometerinstrumentkontroll (se Supplerende figur 2).
- Utfør instrumentkalibrering ved å velge kategorieneKalibrering | Instrumentfra programvarevinduet. Velg 'Instrument' alternativ. Klikk på 'Kalibrer' under 'Treghet'. Registrer instrumentets treghetskalibreringsverdi i μN.m.s2 og gjenta kalibrering minst 3x for å sikre at kalibreringsverdiene er innenfor 10 % av hverandre (se Supplerende figur 3).
- Monter reometergeometrien på akselen til reometeret.
- Klikk kategorienGeometrieri programvaren for reometerinstrumentkontroll.
- Rengjør kjeglen med ønsket geometri (40 mm diameter, 1◦ 0' 11'' kjegle) og Peltierplaten med isopropanol (se tabell 1, materialbord, figur 1og figur 2).
MERK: Peltierplaten er installert på reometeret; det kan rengjøres med isopropanol mens det er direkte festet til reometeret. - Påse at Peltier platearmaturen er fri for synlig støv og rengjør om nødvendig med isopropanol. Monter peltierplaten hvis den ikke er forhåndsinstallert i reometeret og koble til varmeavledertilkoblingene.
- Trykk på 'Lås-knappen' på reometeret til låseakselen som er koblet til kjeglegeometrien. Dette arresterer akselens posisjon, men den kan rotere fritt i stillingen.
- Klikk på 'Smart Swap | Aktiverti kategorien for reometerinstrumentkontrollprogramvare for å tillate automatisk gjenkjenning av geometrien (se Supplerende figur 4).
- Vri akselen på toppen av reometeret for å skru på geometrien. Programvaren vil oppdage 40 mm diameter, 1◦ 0' 11'' kjeglevinkelgeometri på dette stadiet (se tabell 1 og materialbord).
- Gjenta trinn 2.2.5 – 2.2.6 for å sikre at geometrien oppdages.
- Velg 'Gap' under 'Kontrollpanel' av rheometer instrument kontrollprogramvare, klikk på 'Alternativer' ikon og velg 'Axial Force' alternativ. Sett aksial kraft til '1 Newton'; Dette er for å sikre at kjeglegeometrien berører Peltierplaten for nullgapinitialisering (se Supplerende figur 5).
- Utfør reometergeometrikalibreringen.
- Velg kategorienGeometrifra programvarevinduet. Klikk på 'Kalibrer' under 'Treghet'. Registrer geometriens treghetskalibreringsverdi i μN.m.s2 og gjenta dette 2-3 ganger for å sikre at kalibreringsverdiene er innenfor 10% av hverandre.
- KlikkkalibrerunderFriksjoni programvarevinduet. Registrer kalibreringsverdien for geometrifriksjon i μN.m/(rad/s) og gjenta dette 2-3 ganger for å sikre at kalibreringsverdiene er innenfor 10 % av hverandre (se Supplerende figur 6).
- Utføre nullgapinitialiseringen
MERK: Siden geometrien ikke kan heves nøyaktig over Peltierplaten for å utføre målinger uten referanse "null" -posisjon, utføres nullgapinitialisering. For målingsformål har geometrien et innebygd geometrigap på 24 μm og et trimgap på 28 μm. Trimgapet er satt til å effektivt rense overflødig væske som kan søle utenfor geometriens overflateareal. Disse hullene er avgjørende for nøyaktig måling av data ved hjelp av prøven og reometeret. Trinnet 2.4.1 er absolutt nødvendig for å sikre at geometrien er satt til null gap for å oppnå henholdsvis geometri og trimhull på henholdsvis 24 μm og 28 μm.- Klikk ikonet 'Null mellomrom' under 'Gap' kategorien i 'Kontrollpanel' i programvarevinduet. Initialiseringen er fullført når den aksiale kraften som geometrien har opplevd, er større enn eller lik 1 N, da den berører Peltierplaten. Påse at reometergapet nullstilles slik at referanseposisjonen er nøyaktig (se Tilleggs figur 7 og Tilleggs figur 8).
- Trykk 'opp og pil ned' kontroller på reometer instrumentet eller 'geometri heve og lavere' ikoner under 'Gap' kategorien i rheometer instrument kontroll programvare for å heve geometrien til en vilkårlig høyde. Kontrollskjermen på reometerinstrumentet og kontrollpanelet til reometerinstrumentets kontrollprogramvare vil vise (samme) gaphøyde.
- Sett opp den eksperimentelle prosedyren i programvaren for reometerinstrumentkontroll. Utfør karakteriseringen av reologiske egenskaper ved hjelp av en kjegle-på-peltier plategeometri ved 22 °C.
MERK: Nettstedet US Geological Survey ble brukt til å fastslå elvevanntemperaturen den20. Temperaturen på slimet kan påvirke de reologiske egenskapene. Betydningen av å justere verdiene til elvetemperatur er å omtrent matche temperaturen som slimegenskapene kan estimeres realistisk under.- Velg kategorienEksperimenteri programvaren for reometerinstrumentkontroll, og fyll ut relevant informasjon som 'Navn', 'Operatør', 'Prosjekt' osv. (se Supplerende figur 9)
- Velg kategorienGeometri, og kontroller at informasjonen stemmer overens med trinn 2.2.5. - 2.2.7. (se Supplerende figur 10).
- Velg kategorienProsedyre, og bruk piltastene satt opp '1: Oscillation Amplitude' prosedyre. (se Supplerende figur 11).
- Initialiser 'Miljøkontroll' innstillinger som følgende: 'Temperatur = 22 °C'; 'Bløtlegg tid = 120 s' og merk av i boksen 'Vent på temperatur' (se supplerende figur 11).
- Initialiser innstillingene fortestparameteresom følgende: Frekvens = 1 Hz. sett 'Logaritmisk feie'; 'Dreiemoment = 10 til 10000 μN.m'; 'Poeng per tiår = 5' (se Tilleggs figur 11).
- Sett opp eksperimentet for å bestemme det lineære viskoelastiske området (LVR) av slimet av kjent konsentrasjon (100 mg / ml)
- Bruk en passende mikropipette- og pipettespiss til å trekke ca. 0,3 ml fiskeslimoppløsning av konsentrasjon 100 mg/ml (se trinn 1.2, Materialtabell).
- Introduser slimoppløsningen på Peltierplaten ved hjelp av mikropipetten (se figur 2).
- Trykk'Trim Gap' knappen på reometeret for å senke geometrien på Peltier-platen. Alternativt kan du klikke på 'Trim Gap' ikon under 'Gap' kategorien i 'Kontrollpanel' alternativet i rheometer instrument control software (se Supplerende figur 12).
- Bruk mikropipetten med pipettespissen for å fjerne overflødig slimløsning og sørg for at væsken er under geometrien uten søl i nærheten av geometriens periferi.
MERK: Feil lasting av væsken vil føre til feil i målingene. Under fylt prøve vil lavere dreiemomentfordeling og overfylt prøve føre feilaktige spenningsfordelinger på grunn av søling langs kantene. - Velg kategorieneMotor' og 'Hastighet' til 5 rad/s og 0 rad/s vekselvis, til det er minimal treghet og hastighet i prøven under geometrien. Kontrollskjermen på reometerinstrumentet og kontrollpanelet til styringsprogramvaren for reometerinstrumentet vil vise hastigheten (se Supplerende figur 13).
- Trykk på 'Geometry Gap' -knappen på reometeret for å senke geometrien til det forhåndsinnstilte passende gapet per bestemt geometri. Alternativt kan du klikke på 'Geometry Gap' ikon under 'Gap' kategorien i 'Kontrollpanel' alternativet i rheometer instrument control software (se Supplerende figur 14).
- Kjør eksperimentet for å bestemme det lineære viskoelastiske området (LVR) av slimet i den kjente konsentrasjonen (100 mg /ml).
- Klikkstartikonetpå programvaren for reometerinstrumentkontroll (se Tilleggsfigur 15).
MERK: Reometeret utfører automatiske målinger; når du trykker påstartknappen,tar det omtrent 20 minutter å fullføre testen. Innstillingen "Poeng per tiår" i trinn 2.5.5 bestemmer hvor mye tid reometeret må fullføre målinger. - Kjør eksperimentet ved å klikkeJai popup-boksen som vises, og foreslår at geometrigapet senkes til riktig avstand for å starte eksperimentet, hvis det ikke allerede er senket.
- Vær oppmerksom på sanntidsplottet generert av reometeret som rapporterer lagringen (G') og tapsmoduli (G'').
MERK: G' og G" er henholdsvis lagrings- og tapsmoduli. Lagringsmodulus representerer tendensen til at materialet gjenoppretter sin opprinnelige form etter stressindusert deformasjon og tilsvarer elastisitet. Tapsmodulusen representerer i hvilken grad materialet motstår tendensen til å strømme og er representativ for væskeviskositet (se figur 4). - Sett X-aksen for plottet til 'Oscillation strain percentage'. Dette gjør du ved å høyreklikke grafen som vises, og velgekategorien Diagramvariabler (se Tilleggs figur 16).
- Registrer oscillasjonsstammeprosenten fra plottet før materialet kommer inn i det ikke-lineære viskoelastiske området, når testen er fullført.
- Trykk 'opp og ned pil' kontroller på reometer instrumentet eller 'geometri heve og lavere' ikoner under 'Gap' kategorien i rheometer instrument kontroll programvare for å heve geometrien til enhver vilkårlig høyde over Peltier plate.
- Lagre filen som inneholder både eksperimentell prosedyre og resulterer i det opprinnelige filformatet til rheometer instrument kontroll programvare for å fastslå den lineære viskoelastiske regionen (LVR) av slimprøven.
MERK: Dette kan gjøres ved å sette X-aksen på plottet til strekkamplitude (%) og/eller oscillasjonsspenning
før dataene kommer inn i det ikke-lineære viskoelastiske området (NLVR) (se Supplerende figur 16).
- Klikkstartikonetpå programvaren for reometerinstrumentkontroll (se Tilleggsfigur 15).
- Kjør de dynamiske feiene og steady state skjærhastighetsstrømningstesteksperimentene i Linear Viscoelastic Range (LVR) for slimet i kjent konsentrasjon 100, mg / ml for å generere resultater fra tre uavhengige slimprøver på 100 mg / ml. Utfør disse trinnene på de tilgjengelige slimkonsentrasjonsprøvene individuelt.
- Gjenta trinn 2.5.1 – 2.5.4.
- Initialiser innstillingene fortestparameteresom følgende: Frekvens = 1 Hz. sett 'Logaritmisk feie'; 'Belastningsprosent = 100 til 10000 %; 'Poeng per tiår = 10'.
- Velg kategorienProsedyre, og bruk piltastene til å konfigurere prosedyren 2: Oscillasjonsfrekvens.
- Initialiser 'Miljøkontroll' innstillinger som følgende: 'Temperatur = 22 °C'; 'Bløtlegg tid = 0,0 s'.
- Initialiser innstillingene fortestparameteresom følgende: Belastningsprosent = 1 %. sett 'Logaritmisk feie'; 'Frekvens = 20 til 1 Hz'; 'Poeng per tiår = 10'.
- Velg kategorienProsedyre, og bruk piltastene som er satt opp prosedyren 3: Flow Sweep.
- Initialiser 'Miljøkontroll' innstillinger som følgende: 'Temperatur = 22 °C'; 'Bløtlegg tid = 0,0 s'.
- Initialiser innstillingene fortestparameteresom følgende: Skråstillingshastighet = 1 til 10 000 1/s. 'Poeng per tiår = 10'; avkrysningsboksen "Steady state sensing".
- Gjenta trinn 2.7.1 – 2.7.2 og vent til eksperimentet er fullført, ca. 45 minutter.
- Trykk 'opp og ned pil' kontroller på reometer instrumentet eller 'geometri heve og lavere' ikoner under 'Gap' tab i rheometer instrument kontroll programvare for å heve geometrien til enhver vilkårlig høyde.
- Bruk engangsservietter og hansker til å fjerne og rengjøre slimet på peltierplaten med isopropanoloppløsning (se Materialbord).
- Lagre filen som inneholder både eksperimentell prosedyre og resulterer i det opprinnelige filformatet til rheometer instrument kontroll programvare.
3. Gjenta protokollen for andre konsentrasjoner av slimløsninger på 200 mg/ml og 400 mg/ml.
- Utfør trinn 2.5 - 2.8 inkludert alle undertrinnene som er oppført der for de resterende to konsentrasjonene av slimløsninger, 200 mg / ml og 400 mg / ml.
4. Grafisk representasjon og dataanalyse
MERK: Koden i den ekstra kodefilen utfører datagjennomsnitt og genererer repeterbarhetsfeil, overlapper dataene fra alle eksperimenter. Beregningsfunksjonene for standardavvik er ikke tilgjengelige i programvaren for reometerinstrumentkontroll. Koden er skrevet på et programmeringsspråk for dataanalyse, etterbehandling og grafisk representasjon (se Materialfortegnelse for detaljer).
- Eksporter data generert fra trinn 2.8 knyttet til 100 mg / ml GR slimkonsentrasjon og trinn 3.1 knyttet til 200mg/ml og 400 mg/ml GR slimkonsentrasjoner i regnearkformat ved å klikke på fanen 'Fil | Eksportere | excel' i programvaren for reometerinstrumentkontroll (se Tilleggsfigur 17).
- Kjør tilleggskoder for å generere plott av tilsynelatende viskositet (η) for varierende skjærstammehastigheter (
) og tapsmodulus (G"), lagringsmodulus (G') og fasevinkel (δ) for varierende svingningsspenning ( ) og generer representative resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne delen presenterer vi resultatene av forsøkene på GR-slim ved hjelp av et rotasjonsreometer med kjeglegeometri (40 mm diameter, 1° 0' 11'') og en Peltier plate. Forsøkene bidro til å karakterisere den ikke-newtonske, skjærfortynnende oppførselen til GR-slimet og det tilsynelatende utbyttestresset som skildrer slimovergangen fra et gellignende materiale til et væskelignende materiale. De representative resultatene innebærer kvantitative beskrivelser av lavmomentgrenser og sekundære strømningseffekter av rotasjonsreometerinstrumentering. Instrumenteringsgrensene og steady-state og dynamiske belastningshastighetsmålinger bidro til å nøyaktig fastslå de viskoelastiske atferdstrendene og tilsynelatende utbyttestress av GR-slim. De tilsynelatende avkastningsspenningsmålingene ga et middel til å observere minimumsspenningen som kreves for irreversibel plastdeformasjon av GR-slimet og for å initiere strømmen. Strømningsinitieringstendensen til GR-slimet kan tilskrives matpartikkeladhesjons- og transportfunksjonene. Vedhefts- og transportfunksjonene til GR-slim var makroskopiske materialattributter som ble informert av de reologiske målingene i protokolleksperimentene. Derfor ble makro-reologi karakterisering av GR-slimet utført med denne protokollen.
Slimet som ble brukt i forsøket ble anskaffet fra flere gill rakere på opptil tre sølvkarpe og hadde ingen synlige spor av blod1,2. Den oppkjøpte prøven ble fortynnet i to ekstra prøver, som beskrevet i protokollen. Alle målinger ble gjort ved kontrollert temperatur på 22 ± 0,002 °C36. Denne temperaturen ble opprettholdt på peltierplaten på reometeret. Kjeglegeometrien ble valgt for sin allsidighet i å måle et bredt spekter av viskositeter i biologiske materialer som GR-slimet. Minimumsmomentet under steady state skjærforhold (10 x 10-9 Nm), minimumsmoment under oscillatoriske forhold (2 x 10-9 Nm) sammen med kjeglevinkelen (1° 0' 11") og sammendraget av reometerspesifikasjoner som kreves for å vurdere lavmoment og sekundære strømningsregimer er presentert i tabell 1. Vi rapporterer replikeringer av de tre siste prøvene for karakterisering og sammenligning av ikke-newtonsk og skjærfortynnende oppførsel.
Brede slutninger etter vellykket kjøring av protokollen
Den vellykkede utførelsen av protokollen og analysen resulterte i karakterisering av (makro) reologiske egenskaper som medfører ikke-newtonsk, skjærfortynnende oppførsel av slim ekstrahert fra gill rakers av sølvkarpe, Hypophthalmichthys molitrix. Spesielt ble avkastningsfenomenet løst og et tilsynelatende utbyttestress av slimet (400 mg / ml konsentrasjon, nærmest den faktiske ekstraherte slimkonsistensen) ble fastslått (σy = 0,2736 Pa). Protokollen var velegnet til målinger som involverte svært lite prøvevolum (ca. 1,4 ml) slim. På grunn av knapphet på litteratur knyttet til GR slimkarakterisering, vil disse dataene bidra til analytisk modellering og utvidede reometriske studier.
Resultater av dynamiske feieeksperimenter
Resultatene av de dynamiske frekvens- og amplitude feieeksperimentene presenteres i denne delen. Dette er resultatene av prosedyrene som er opprettet i trinn 2.8.2 - 2.8.5. Lavmomentgrensene for oscillatorisk frekvenssveip og amplitudesveip av GR-slimet med 400 mg/ml-konsentrasjon er merket i figur 6A, B.
Frekvensundersøkelsesdataene (figur 6A) ble innhentet for et vinkelfrekvensområde, 6,28 ≤ ω ≤ 125,66 rad s-1 ved en konstant oscillatorisk belastningsamplitude på 0,01. Vinkelfrekvensverdien, 6,28 rad/s (1 Hz), ble valgt som en omtrentlig bevegelsesfrekvens for palatale folder i interstices av gill rakers og merket i figur 6A. Valget av belastningsamplitudeverdien ble avledet fra det lineære viskoelastiske området som er fastslått i protokolltrinn 2.7. I figur 6Able to potensielle nedre grenser for lavmomentregimet beregnet ved hjelp av strekkamplituder på henholdsvis 0,01 og 0,001 (γ0) og minimumsmomenter på henholdsvis 2x10-9 Nm og 10 x10 -9 Nm (Tmin, Se tabell 1.). Dataene som presenteres i figur 6A starter med den omtrentlige frekvensen av palatal foldbevegelse (1 Hz eller 6,28 rad/s) og øker til høyere vinkelfrekvenser som er utenfor rammen for fysisk tolkning i denne studien. Derfor ble disse dataene ikke analysert videre, da de krever en mer detaljert parametrisk undersøkelse av belastningsamplitude og palatal fold bevegelsesfrekvens.
Amplitude-sveipedataene (figur 6B) ble innhentet med en fast vinkelfrekvens (ω) på 6,28 rad/s (1 Hz). Det skal bemerkes at amplitude-feiedataene ikke ble påvirket av instrumenteringsregimets lavmomentregime (figur 6B). Derfor ble disse dataene ytterligere analysert for alle tre slimkonsentrasjonene (100 mg / ml, 200 mg / ml og 400 mg / ml) for å bestemme omfanget av viskoelastisitet og gi atferd.
Den grafiske representasjonen vist i figur 4 ble brukt som en retningslinje for utvidet analyse av amplitude feieeksperimentene. Resultatene av tre slimløsninger med konsentrasjoner 100 mg/ml, 200 mg/ml og 400 mg/ml er omtalt nedenfor.
Resultatet for 100 mg/ml slimkonsentrasjon (figur 7A), viser at ved lave oscillasjonsspenninger (0,01 ≤ 
≤ 0,1 Pa) overlappet lagrings- og tapsmoduli (G' og G") betydelig. Ved oscillasjonsspenninger større enn 0,1 Pa, avtar lagringsmodulusen, noe som indikerer lavere elastisitet. Tapsmodulusen, som er representativ for viskositet, forblir konstant i hele spekteret av oscillasjonsstress (0,01 ≤ ≤ 0,5 Pa). Dette fenomenet kan tilskrives en newtonsk væskelignende oppførsel og er i samsvar med den konstante tilsynelatende viskositeten til slimkonsentrasjonen på 100 mg /ml (figur 7A og figur 8A,B). De tilsvarende fasevinkeldataene (δ) viser at ved moderate og høye svingningsspenninger (0,05 ≤ ≤ 0,3 Pa), varierer verdiene mellom 55° og 70° (Figur 7D). Det kan derfor antydes at 100 mg/ ml slimoppløsningen demonstrerer væskelignende oppførsel, med ubetydelig tilsynelatende utbyttestress.
Som observert i figur 7B,200 mg/ml konsentrasjon ved lave oscillasjonsspenninger (0,02 ≤ ≤ 0,04 Pa), reduseres lagringsmodulus (G') men forblir fortsatt større enn tapsmodulus (G"). Innenfor oscillasjonsstressområdet (0,04 ≤ ≤ 0,07 Pa), var det et "crossover" -område der G' og G-verdiene forblir omtrent like. Denne regionen er merket i figur 7B med stiplede linjer og tilsvarende oscillasjonsspenningsverdier ble notert (0,04193 ≤ ≤ 0,06467 Pa). Utover denne regionen oppnådde G" en høyere verdi enn G' som antyder en overgang til en væskelignende oppførsel. G" (som representerer viskositet) forble imidlertid konstant innenfor hele spekteret av oscillasjonsstress (0,01 ≤ ≤ 0,5 Pa). Fasevinkeldataene som presenteres i figur 7E, viser en høyere grad av varians, spesielt i oscillasjonsstressområdet (0,04193 ≤ ≤ 0,06467 Pa). Fra figur 7B,E kan man antyde at det var overgangsadferd av væsken fra lineær viskoelastisk til ikke-lineær viskoelastisk region. Videre representerte slimkonsentrasjonen på 200 mg/ml ikke-newtonske egenskaper og tilbøyelighet til å gi etter i oscillasjonsstressområdet (0,04193 ≤ ≤ 0,06467 Pa). Den ikke-newtonske, skjærfortynnende væskelignende oppførselen var enig med de tilsynelatende viskositetsdataene som presenteres i figur 8A og tilsvarende spenningsvariasjoner i figur 8B.
Konsentrasjonsdataene på 400 mg/ml slim er presentert i figur 7C,F. G' og G"-trendene i figur 7C viser tydelig et avkastningsfenomen med et krysningspunkt mellom G" og G'. Den tilsynelatende avkastningsspenningsverdien (σy) ble registrert som 0,2736 Pa som indikerer en klar endring i slimets tilstand fra gellignende til en ikke-newtonsk væskelignende tilstand. Fasevinkeldataene som presenteres i figur 7F, viser en kraftig økning ved det tilsynelatende utbyttespenningen (σy = 0,2736 Pa) fra ca. 20° til 65°. En så kraftig økning i fasevinkelen kan oppstå når materialet gjennomgår å gi og begynner å strømme som en væske. Den ikke-newtonske væskelignende oppførselen kan støttes ytterligere med resultatene av steady state skjærtester rapportert i figur 8A,8B. Den tilsynelatende avkastningsspenningen som rapportert i steady state skjær tester var 0.2272 Pa (Figur 8B).
Resultater av steady state skjær rate eksperimenter
Resultatene av steady state skjærhastighetseksperimentene presenteres for tre slimløsninger med konsentrasjoner 100 mg/ml, 200 mg/ml og 400 mg/ml i denne delen ved hjelp av grafiske representasjoner som retningslinje (Figur 3A,B). Disse resultatene tilsvarer prosedyren som er initialisert i protokolltrinnene 2.8.6-2.8.8.
I figur 8A for slimkonsentrasjonen på 100 mg/ml vises de tilsynelatende viskositetsdataene med høy varians ved lave skjærhastigheter (1 ≤ 
≤ 4 s-1) sammen med hellingen , -1,4. Plasseringen av lavmomentregimet er også merket. Den høye variansen på 100 mg/ml-data innenfor dette området (1 ≤ ≤ 4 s-1), antas å være en effekt av det (skyggelagte) lavmomentregimet. I figur 8Bindikerte den tilsvarende stressvariasjonen med skjærhastighetsdata et lite utvalg av skjærhastigheter der prøven oppnådde et "stressplatå" (eller den flate regionen). Denne regionen er forsømt for avkastning stress estimering som tilsvarende viskositet data er gjenstand for lav-dreiemoment effekter. Innenfor høysakshastighetsområdet (2500 ≤ ≤ 10000 s-1) ble de tilsynelatende viskositetsdataene påvirket av det sekundære strømningsregimet. Den 100 mg / ml slimoppløsningen oppfører seg derfor som en newtonsk væske som er uavhengig av skjærhastigheten utenfor lavmomentet og sekundære strømningsregimer, og med en konstant tilsynelatende viskositetpå 0,00088 Pa s (±1.656 x10-5 Pa s ).
Som observert i figur 8Aforble 200 mg/ml-konsentrasjonen av slim upåvirket av lavmomentgrenser og viste en skjærfortynnende effekt i skjærhastighetsområdet, 1 ≤ ≤ 15 s-1. Null-skjær belastning rate viskositet (ηo) ble notert som 0.032 Pa s (±0.024 Pa s) og uendelig-skjær belastning rate viskositet (η∞) med skråstilling ( ), 1995 s-1, ble notert som 0,00085 Pa s (±2,495 x 10-5Pas). Skjæringsfortynnende effekt av væsken ble demonstrert med en skråning på -1,8 innenfor skjærhastighetsområdet, 1 ≤ ≤ 4 s-1. Den tilsvarende stressvariasjonen i figur 8Bviser et "stressplatå" som representerer et avkastningsfenomen med gjennomsnittlig avkastningsspenning på 0,1446 Pa (±0,0037 Pa).
Konsentrasjonen på 400 mg/ml av slim er minst fortynnet og følgelig den nærmeste i materialkonsistens til det faktiske ekstraherte GR-slimet. I figur 8Amerker du at skjærfortynnende karakteristikk er veldefinert for slimkonsentrasjonen på 400 mg/ml sammenlignet med slimkonsentrasjonen på 200 mg/ml. Nullskjær (ηo) og uendelig-skjær belastningshastighet viskositeter (η∞) ved skjærhastighet ( ), 1995 s-1, var 0.137 Pa s (±0.032 Pa s) og 0.00099 Pa s (±9.323 x 10-5Pa s. I tillegg ble skråningen av skjærfortynnende region etablert som -0,91 innenfor skjærhastighetsområdet, 1 ≤ ≤ 32 s-1. Det tilsvarende "stressplatået" fra spenningsvariasjonene med skjærhastighet observert i figur 8B, representerer et tilsynelatende avkastningsstress på 0,2272 Pa (±0,0948 Pa).
| Komponent | Modell-/delenr./versjon | Beskrivelse av parameter | Spesifikasjoner |
| Reometer | DHR-2 | Frekvensområdet | 1 x 10−7 - 100 Hz |
| Maksimal vinkelhastighet | 300 rad/s | ||
| Minimum dreiemoment under jevn skjær | 10 nN.m | ||
| Minimum dreiemoment under oscillasjon | 2 nN.m | ||
| Maksimalt dreiemoment | 200 μN *m | ||
| Dreiemoment oppløsning | 0,1 nN.m | ||
| Skråstillingshastighetsområde | 5,73 x 10−6 til 1,72 x 104 [1/s] | ||
| Maksimal normal kraft | 50 N | ||
| Normal kraftoppløsning | 0,5 mN | ||
| Geometri | 513404.905 | Dimensjoner | 40 mm diameter |
| 1° 0' 11" kjeglevinkel | |||
| Peltier Plate | 533210.901 | Temperaturområde | -40 °C til 200 °C ± 0,1 °C |
Tabell 1: Spesifikasjoner for reometer
Figur 1: CAD-gjengivelse av reometerkomponenter. (A) 40 mm 1° kjeglegeometri, (B) Peltier Platefeste. Kjeglegeometrien skal festes til rheometerets aksel, og peltierplaten skal kobles til bunnen av rotasjonsreometeret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Plassering av væske på Peltierplaten. Væskeprøven skal plasseres i midten av Peltierplaten for å sikre jevn spredning av væske gjennom platen når geometrien senkes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Grafisk fremstilling av stabile reologiske egenskaper. Variasjon av (A) Tilsynelatende viskositet (η) og (B) Skjærspenning ( ) med skjærstammehastighet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Grafisk fremstilling av dynamiske reologiske egenskaper. Variasjon av lagring (G') og tap (G") Modulii og fasevinkel (δ) med oscillasjonsstress. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representative bilder og skjematiske tegninger av gjelle rakere (GR). (A) Visning av gill raker array og palatal folder (B) Skjematisk tegning av gill raker array og palatal folder (C) Utskilt gill raker (D) Skjematisk tegning av gill raker med fremtredende funksjoner (E) Plassering av slim ekstraksjon i gill raker. Bilder 5A og 5C ble tatt under en disseksjon utført av professor L. Patricia Hernandez ved Institutt for biovitenskap ved George Washington University. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Effekter med lavt dreiemoment. Lagrings- og tapsmodulvariasjon for 400 mg/ml, slimkonsentrasjon med (A) Frekvens feier ved strekkamplitude = 0,01 og (B) Amplitude feier ved oscillasjonsfrekvens = 1 Hz (eller 6,28 rad/s). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Amplitude feier etter tre konsentrasjoner av sølvkarpeslim. Testene ble fullført ved f = 1 Hz eller ω = 6,28 rad/s (A) Lagring og tap modulus variasjon for slimkonsentrasjon, 100 mg/ml (B) Lagring og tap modulus variasjon for slimkonsentrasjon, 200 mg/ml (C) Lagring og tap modulus variasjon for GR slim konsentrasjon, 400 mg /ml ( D ) Fasevinkel variasjon for GR slim konsentrasjon, 400 mg /ml ( D ) Fasevinkel variasjon for GR slim konsentrasjon, 400 mg /ml ( D ) Fasevinkel variasjon for GR slim konsentrasjon, 400 mg /ml ( D ) Fasevinkelvariasjon for GR slimkonsentrasjon, 400 mg/ml ( D ) Fasevinkelvariasjon for GR slimkonsentrasjon, 400 mg/ml ( D ) Fasevinkelvariasjon for GR slimkonsentrasjon, 400 mg/ml ( D ) Fasevinkelvariasjon for GR slimkonsentrasjon, 400 mg/ml ( D ) Fasevinkelvariasjon for GR slimkonsentrasjon, 400 mg/ml ( D ) Fasevinkelvariasjon for GR slimkonsentrasjon, 400 mg/ml ( D ) Fasevinkelvariasjon for GR slimkonsentrasjon, 400 mg/ml (D) Fasevinkelvariasjon for GR slimkonsent 100 mg/ml (E) Fasevinkelvariasjon for slimkonsentrasjon, 200 mg/ml (F) Fasevinkelvariasjon for slimkonsentrasjon, 400 mg/ml. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Variasjon av tilsynelatende viskositet (η) og stress (σ) med skjærhastighet ( ) for alle tre konsentrasjonene av fiskeslim. (A) Tilsynelatende viskositetsvariasjon med skjærhastighet for slimkonsentrasjoner, 400 mg/ml, 200 mg/ml og 100 mg/ml sammen med regimer med lavmomenteffekter og sekundære strømningseffekter (B) Spenningsvariasjon med skjærfrekvens for GR-slimkonsentrasjoner, 400 mg/ml, 200 mg/ml og 100 mg/ml, som markerer "stressplatåer" (eller flat region) med stiplede linjer. Stiplede linjer representerer de gjennomsnittlige verdiene for tilsynelatende avkastningsspenning for de tre GR-slimkonsentrasjonene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Tre konsentrasjoner av sølvkarpe GR-slim. Fra venstre til høyre: 400 mg/ml, 200 mg/ml, 100 mg/ml. Den første konsentrasjonen på 400 mg/ml ble valgt med kriteriene som en gang fortynnet prøven ville inneholde en rimelig mengde fiskeslim, samtidig som den ga et stort nok volum til å kjøre flere tester. De to påfølgende konsentrasjonene ble fortynnet med 50% DI vann etter volum. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Lansering av programvare for reometerinstrumentkontroll. Denne programvaren må bare startes etter at maskinen er slått på. Ellers kan det hende at instrumentet ikke kalibreres riktig. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 3: Kalibrering av instrument. Inertial kalibrering er den eneste kalibreringen som trengs for instrumentet. Det utføres andre kalibreringer etter at geometrien er installert. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 4: Veksle mellom smart swap. Dette alternativet er for aktivering eller deaktivering av smartbytte. Smart swap er en programvarefunksjon for reometerinstrumentkontroll som automatisk oppdager en geometri når den er installert på reometerakselen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 5: Alternativer for målegap Du får tilgang til kategorialternativene "Gap"for å angi betingelsene for nullgapmodus og traverseringshastigheten til målehodet. En aksial kontaktkraft mellom geometrien og Peltierplaten ble satt til 1 N for å sikre nullgapreferansen, det vil si kontakten mellom kjeglegeometri og overflaten på Peltierplaten. Målehodet ble deretter laget for å krysse nøyaktig til målegapet på 24 μm mellom 40 mm 1° kjeglegeometri og Peltierplaten. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 6: Kalibrering av geometritilbehør. Ved installasjon av 40 mm 1° kjeglegeometri og dens deteksjon av rheometer instrumentkontrollprogramvaren ble geometrien kalibrert på samme måte som instrumentkalibreringen for å sikre nøyaktige målinger under et eksperiment. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 7: Zero Gap-ikon. Nullgapinitialisering utføres ved hjelp av dette ikonet. Når nullgapinitialiseringen er fullført, kan reometeret nøyaktig referere til akselens posisjon, med geometrien festet til den, da den heves eller senkes. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 8: CAD-gjengivelse av kjeglegeometri og Peltierplaten etter null-gap-referanse er etablert. Geometrien er satt til å etablere null-gapet når en aksial kontaktkraft på 1 N genereres som det gjør kontakt med Peltier plate. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 9: Trinn 2.5.1 i protokollen. Figuren representerer måten navngiving og fil- og datautdata angis på. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggs figur 10: Trinn 2.5.2 i protokollen. Figuren representerer hvordan geometriinnstillinger, for eksempel prøvevolum, geometrigap og trimgap, kan angis. For noen geometrier, nemlig kjeglen som brukes i dette eksperimentet, er disse innstillingene uforanderlige og definert basert på geometrien. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggs figur 11: Trinn 2.5.3 i protokollen. Figuren representerer hvordan testinnstilling og kondisjonering angis i dette prosedyretrinnet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 12: Trim gap-ikon. Trimgapet ble satt slik at geometrien kunne senkes nok til å trimme overflødig væske som lekker ut av området mellom Peltier-platen og kjeglegeometrien. Gapet avhenger av geometrien som er i bruk. For 40mm, 1 ° kjeglegeometri som brukes i protokollen, var trimgapet 28 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 13: Ikon for motorhastighet. Motorinnstillingene ble brukt til å justere akselens rotasjonshastighet og minimere geometriens treghet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 14: Ikon for geometrigap. Geometrigapet senker geometrien til en bestemt avstand over Peltierplaten som spesifisert av kjegleplategeometrien. For geometrien på 40 mm, 1° kjegle som brukes i protokollen, er geometrigapet 24 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 15: Start-ikon. Startknappen starter hele sekvensen med prosedyrer som ble definert tidligere. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 16: Endre grafvariablene. Figuren representerer variablene som kan defineres for datapresentasjon ved kjøring av prosedyrene. Spesielt er oscillasjonsstamme og oscillasjonsstress av betydning under de dynamiske feieeksperimentene i protokollen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 17: Eksport av programvarefiler for reometerinstrumentkontroll til en regnearkprogramvare. Etter at filene er eksportert som regneark, ble dataanalysen gjort mulig ved hjelp av annen programmeringsprogramvare. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil: Etterbehandling av datafiler ved hjelp av dataanalyseprogram. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et av hovedmålene med å utvikle denne protokollen er å fastslå at den er godt egnet for reologisk karakterisering av GR-slim når svært små prøvevolumer er tilgjengelige. Vi erkjenner at flere prøver fra en skole med sølvkarpe er nødvendig for å karakterisere de reologiske egenskapene til GR-slimet fullt ut, og dataene som presenteres her er ikke en generalisering over hele sølvkarpepopulasjonen. Vår teknikk er berettiget på grunn av dens effekt med reologisk karakterisering av små prøvevolumer og med utvidede undersøkelser som involverer større ensembler av slimprøver.
De kritiske trinnene i protokollen er utarbeidelse av slimløsninger av ulike konsentrasjoner, målinger og datainnsamling ved hjelp av et rotasjonsreometer, og grafisk representasjon og dataanalyse for fysisk innsikt.
Fysisk innsikt i GR-slimdata hentes fra grafiske representasjoner som vises i figur 3 og figur 4, som er kommentert med attributter for forventet materialvirkemåte. Null-skjær belastningshastighet viskositet (ηo) verdier kan observeres ved lavskjær belastningshastigheter der mobiliteten til materialmolekylene dominerer (Figur 3A og Figur 8A). Infinite-shear stamme viskositet (η∞) verdier i ikke-newtonske væsker er størrelsesordener lavere enn null-skjær belastning rate viskositet. Disse dataene kan bli lagt merke til ved høye skjærhastigheter der det er liten eller ingen avhengighet av intermolekylære interaksjoner (Figur 3A og Figur 8A). For ikke-newtonske væsker reduseres tilsynelatende viskositeter gradvis etter hvert som skjærhastighetene øker og oppnår en konstant lav verdi (figur 3A og figur 8A). Å gi atferd i GR-slimet under steady state-målinger kan representeres med helling som vist i figur 3A og presenteres i ligning 1., hvor ηa representerer den tilsynelatende viskositeten, σy er det (konstante) utbyttestresset og er skjærstammen.
Figur 3A og figur 8B presenteres på en loggskala, og derfor oppnår Formel 1 følgende form:
der k – representerer det tilsynelatende utbyttestresset. På en loggloggskala reduseres den tilsynelatende viskositeten med en helling på '-1' angir materialutbyttet som vist i figur 3A10. Mukuskonsentrasjonene på 200 mg/ml og 400 mg/ml hadde henholdsvis -1,8 og -0,91, og viser dengivende oppførselen (Figur 8A). Under dynamiske oscillasjonsmålinger er de viskoelastiske egenskapene uavhengige av strekkamplituden i det lineære viskoelastiske området (LVR) (figur 4). Avkastende oppførsel i GR-slimet under dynamiske oscillasjonsmålinger kan observeres når det viskoelastiske materialet (GR-slim) kommer inn i det ikke-lineære viskoelastiske området (NLVR) etter hvert som lagringsmoduluset (G') reduseres (figur 4). I NLVR-regimet vil det viskoelastiske materialet demonstrere solid-gel-lignende oppførsel hvis lagringsmodulus er større enn tapsmodulus (G' > G"). Når tapsmodulusen overskrider lagringsmodulus (G' < G"), oppstår en "crossover" mellom G' og G"-data. Som vist i figur 7B,C, viste 200 mg/ml og 400 mg/ml GR-slimkonsentrasjoner væskelignende atferd preget av "crossover" mellom G- og G-data. Det tilsynelatende utbyttestresset under steady state-målinger er representert som den gjennomsnittlige verdien av stress til et bøyningspunkt er nådd (Figur 3B). Deretter begynner stresset å øke kraftig med en økning i skjærstammen som vist i figur 3B og figur 8B. GR-slimdataene (konsentrasjoner på 200 mg/ml og 400 mg/ml) viste skjærfortynnende væskeoppførsel til materialet begynner å gi (Figur 8A,B). Det tilsynelatende utbyttestresset ble observert tydelig i 200 mg/ml og 400 mg/ml slimkonsentrasjoner på grunn av deres ikke-newtonske egenskaper (figur 8B). Det tilsynelatende utbyttestresset under dynamiske oscillasjonsmålinger vises i figur 4 og figur 7B,C som "crossover"-området mellom G- og G-data, etterfulgt av G-verdier som overskrider G'. Gr-slimdataene på 400 mg/ml viste skjærfortynnende, ikke-newtonsk oppførsel. Utbruddet av materialutbyttet ble observert med et tilsynelatende utbyttestress på ca. 0,2736 Pa (figur 7C). Hydrogel-til-væske-lignende overgang med fasevinkel (δ = brunfarge-1 (G"/G')) endres i figur 4 og 7D-F. Ekstremet i fasevinkelen er forbundet med en Hookean fast ved 0° og viskøs væske ved 90° som vist i figur 4. Fasevinkelverdiene rundt 45° ble tilskrevet overgang av gellignende oppførsel av materialet til en væskelignende oppførsel. Slimkonsentrasjonen på 400 mg/ml viste tydelig en endring i materialet som er karakteristisk fra hydrogel til væske som atferd gjennom prosessen med å gi et tilsynelatende utbyttestress på ~ 0,2736 Pa (Figur 7F).
Å forstå målebegrensningene og unngå data uegnet for fysisk tolkning er en utfordring med komplekse og myke biologiske væsker, spesielt i studier som involverer små utvalgsvolumer11. Dataene som genereres under lavmoment og sekundære strømningseffekter er uegnet for fysisk tolkning og er avhengige av geometrien som brukes i reometeret (for eksempel kjegle og plate i denne studien). Disse regimene ble identifisert for å unngå feilrepresentasjon av eksperimentelle data som lider av instrumentoppløsning og måleartefakter på grunn av momentumdiffusjon. Grenser for lavt dreiemoment (Figur 6A og Figur 8A) er geometrifunksjoner og minimumsmomenter som genereres av instrumentet (Tabell 1). Under stabile skjærmålingsforhold har kriteriet for å avvise data påvirket av lavmomentgrensen for en kjegleplategeometri av radius (R) med minimum dreiemoment (Tmin = 10 x10 -9 Nm, tabell 1) blitt diskutert av Ewoldt et al. og presenteres under11:
hvor er skjærstammen. I motsetning til 100 mg/ml GR-slimkonsentrasjonene viste 200 mg/ml og 400 mg/ml GR slimkonsentrasjoner upåvirket av lavmomenteffekter som tydelig viser ikke-newtonsk, skjærfortynnende oppførsel med høy nullskjærsspenningsviskositet ved lave skjærstammehastigheter. Kriteriet for minimum målbar viskoelastisk moduli under dynamiske oscillasjonsmålinger har blitt diskutert av Ewoldt et al. og presentert nedenfor (Formel 4)11. I ligning 4, for en kjegleplategeometri av radius (R) minimum dreiemoment under oscillatorisk skjær (Tmin = 2 x 10-9 Nm, tabell 1).
der Gmin er lagringsmodulus (G') eller tap modulus (G") og er skjærstammen. Instrumenteringsbegrensningsregimene som styres av lavmomenteffekter, er merket i figur 6A og 6B. Sekundærstrømningsregimet under steady state-målinger styres av en innadgående momentumdiffusjon av væsken ved hjelp av en virvel som bor i rotasjonskjeglen og plategeometrien11. Det sekundære strømningsmønsteret øker dreiemomentet feil, slik at væsken ser ut til å være skjærfortykning (figur 8A). Den sekundære strømningsgrensen, foreslått av Ewoldt et al. i figur 8A, ble trukket ved hjelp av følgende relasjon11:
der L = βR, β er kjeglevinkelen, R er kjegleradiusen, ρ = 1000 kg m-3, Recrit = 4 og er skjærhastigheten. Dette regimet bidro til å estimere de uendelige skjærstammeviskositeten (η∞) verdiene i GR-slimprøver.
En modifikasjon av protokollen kan gjøres ved hjelp av en flatplategeometri i stedet for kjegleplategeometrien som vist i protokollen som presenteres her. Flatplatetestene bør utføres med en parametrisk variasjon av målegapet i rotasjonsreometeret for å avsløre avhengigheten av tilsynelatende utbyttespenning på målegapet og geometrien. De foreslåtte forbedringene av protokollen som presenteres i dette dokumentet er beskrevet nedenfor. En parametrisk variasjon av strekkamplituden i det lineære viskoelastiske regimet (LVR) og oscillasjonsfrekvensen skal utføres. 'Tack and peel' reologi tester bør utføres for å utvikle en full forståelse av adhesivity av GR mucus. Reologikarakteristikker av GR-slim bør utføres på større prøvevolumensembler sammen med studier for å måle spor av blodceller for å ta hensyn til effekten på de generelle GR-reologiske egenskapene.
Begrensningene i protokollen er beskrevet nedenfor. Vanskelighetene ved GR-slimutvinningsprosedyrene og tilstedeværelsen av blodceller eller vevsfragmenter i slimprøvene kan påvirke slimets reologi. Det skal imidlertid bemerkes at slimet som brukes i protokollen ikke hadde noen synlige spor av blod. GR-slimprøven er et heterogent materiale og kan ha forskjellige reologiske egenskaper på grunn av variansen i stedet for og forholdene etter utvinning. Denne begrensningen ble adressert ved tilstrekkelig homogenisering av GR-slimet ved hjelp av en shaker for å bryte ned store klumper av slim og vevs tilstedeværelse. En annen viktig begrensning er de svært små GR-slimprøvevolumene (ca. 1,4 ml), høstet for analyser som begrenser en generalisering av GR-slimegenskaper.
Betydningen av denne protokollen er at den tillater en nøyaktig reologisk karakterisering av ikke-newtonske, biologiske væsker som slimet. Protokollen som presenteres her, baner vei for å undersøke andre lignende biologiske væsker forbundet med menneskelige, dyre- og plantesekretjoner. I tillegg kan syntetiske væsker eller polymerbaserte løsninger som er analoger av biologiske væsker, testes ved hjelp av denne protokollen for å forstå materialegenskaper under varierende påkjenninger, oscillasjonsfrekvenser og temperatur. Protokollen er velegnet for reologisk karakterisering av biologiske væsker når svært små prøvevolumer gjøres tilgjengelig.
Det utvidede utfallet av protokollen er at den tilsynelatende viskositeten og tilsynelatende utbyttespenningen til GR-slim vil lette etableringen av analytiske modeller for å tolke resultater fra grunnleggende hydrodynamisk undersøkelse av filterfôring og avansert teknologi som krever og involverer kryssstrøm og membranfiltrering.
Den makro-reologiske studien hevder at slimet i kontakt med matpartikler i utgangspunktet er, i en gellignende tilstand som tjener som lim. Ved initiering av strømning og skjær tvinger slimet til å oppnå en tilsynelatende utbyttespenning og gjennomgår plastisk deformasjon. Protokollutførelsen ved hjelp av et rotasjonsreometer hjalp til med karakterisering av overgangen av slim fra gellignende til væskelignende oppførsel. Denne overgangen ble eksperimentelt observert, og det tilsynelatende utbyttestresset ble registrert ved 0,2736 Pa i rotasjonsreometereksperimenter. Når de ytre påkjenningene på slimet er mindre enn det tilsynelatende utbyttestresset, vil slimet demonstrere gellignende oppførsel for å lette vedheft av matpartikler. Når de ytre påkjenningene overstiger det tilsynelatende utbyttestresset, vil slim demonstrere skjærfortynnende oppførsel som vil lette transport av agglomererte matpartikler til fordøyelsesorganene i sølvkarpe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter er erklært.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner støtte og finansiering fra GW Center for Biomimetics and Bioinspired Engineering. Vi takker professor L. Patricia Hernandez ved Institutt for biovitenskap ved George Washington University for å ha inspirert undersøkelsen og det pågående samarbeidet, og ga biologisk ekspertise på sølvkarpe fysiologien og ga slimprøvene. Vi takker studentene, Mr. David Palumbo, Ms. Carly Cohen, Mr. Isaac Finberg, Mr. Dominick Petrosino, Mr. Alexis Renderos, Ms. Priscilla Varghese, Mr. Carter Tegen og Mr. Raghav Pajjur for hjelp i laboratoriet og Mr. Thomas Evans og Mr. James Thomas fra TA Instruments, New Castle, DE for støtte med opplæring og vedlikehold av reometeret. Bilder for figur 5A,C ble tatt under en disseksjon utført av professor L. Patricia Hernandez ved Institutt for biovitenskap ved George Washington University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Kim Wipes | VWR | 470224-038 | To clean Sample from plate |
| Gloves | VWR | 89428-750 | To prevent contamination of sample |
| Pipette | VWR | 89079-974 | To transport sample from vial to rheometer |
| Pipette Tips | Thermo Scientific | 72830-042 | To transport sample from vial to rheometer |
| Shaker | VWR | 89032-094 | To homogenously mix sample of mucus |
| Vials | VWR | 66008-710 | Contains measured sample volumes |
| Weigh Scale | Ohaus | Scout –SPX Balances | To weigh mass of mucus samples |
| Chemical Reagents | |||
| De-Ionized Water (H20) | - | - | Liquid |
| Sterile 70% Isopropanol (C3H8O) | VWR | 89108-162 | Liquid |
| GR Mucus | |||
| 100 mg/mL concentration, 2mL | - | - | Viscoelastic Material |
| 400 mg/mL concentration, 1mL | - | - | Viscoelastic Material |
| 200 mg/mL concentration, 1mL | - | - | Viscoelastic Material |
| Software | |||
| MATLAB | Mathworks | R2017a | Data analysis, post-processing and graphical representation |
| Trios | TA Instruments | v4.5.042498 | Rheometer instrument control and analysis software |
References
- Cohen, K. E., Hernandez, L. P. The complex trophic anatomy of silver carp, Hypophthalmichthys molitrix, highlighting a novel type of epibranchial organ. Journal of Morphology. 279, 1615-1628 (2018).
- Cohen, K. E., Hernandez, L. P. Making a master filterer: Ontogeny of specialized filtering plates in silver carp (Hypophthalmichthys molitrix). Journal of Morphology. 279, 925-935 (2018).
- Cremer, M., Smitherman, R. Food habits and growth of silver and bighead carp in cages and ponds. Aquaculture. 20 (1), 57-64 (1980).
- Battonyai, I., et al. Relationship between gill raker morphology and feeding habits of hybrid bigheaded carps (Hypophthalmichthys spp.). Knowledge and Management of Aquatic Ecosystems. 416, 36 (2015).
- Zhou, Q., Xie, P., Xu, J., Ke, Z., Guo, L. Growth and food availability of silver and bighead carps: Evidence from stable isotope and gut content analysis. Aquaculture Research. 40 (14), 1616-1625 (2009).
- Freedman, J. A., Butler, S. E., Wahl, D. H. Impacts of invasive Asian carps on native food webs (Final Report). , University of Illinois, Kaskaskia Biological Station. Urbana-Champaign, IL. (2012).
- Nico, L., Fuller, P., Li, J. Silver carp (Hypophthalmichthys molitrix)-FactSheet. , (2017).
- Walleser, L., Howard, D., Sandheinrich, M., Gaikowski, M., Amberg, J. Confocal microscopy as a useful approach to describe gill rakers of Asian species of carp and native filter-feeding fishes of the upper Mississippi River system. Journal of Fish Biology. 85 (5), 1777-1784 (2014).
- Nelson, A. Z., Ewoldt, R. H. Design of yield-stress fluids: a rheology-to-structure inverse problem. Soft Matter. 13, 7578-7594 (2017).
- Chen, T. Rheological Techniques for Yield Stress Analysis. TA Instruments Applications Note, RH025. , (2020).
- Ewoldt, R. H., Johnston, M. T., Caretta, L. M. Experimental challenges of shear rheology: how to avoid bad data. Complex Fluids in Biological Systems. Spagnolie, S. , Springer. (2015).
- Thornton, D. J., Sheehan, J. K. From Mucins to Mucus: Toward a more coherent understanding of this essential barrier. Proceedings of the American Thoracic Society. 1, 54-61 (2004).
- Shepard, K. L.
- Fernández-Alacid, L., et al. Skin mucus metabolites in response to physiological challenges: A valuable non-invasive method to study teleost marine species. Science of the Total Environment. 644, 1323-1335 (2018).
- Wagner, C. E., Wheeler, K. M., Ribbeck, K. Mucins and Their Role in Shaping the Functions of Mucus Barriers. Annual Reviews in Cell and Developmental Biology. 34, 189-215 (2018).
- Bird, R. B., Armstrong, R. C., Hassager, O. Dynamics of Polymeric Liquids, Volume 1: Fluid Mechanics. , Wiley. New York. 1255-1284 (1987).
- Mantle, M., Allen, A. Isolation and characterisation of the native glycoprotein from pig small intestinal mucus. Biochemical Journal. 195, 267-275 (1981).
- Allen, A., Hutton, D. A., Pearson, J. P., Sellers, L. A. Mucus glycoprotein structure, gel formation and gastrointestinal mucus function. Mucus and Mucosa (Ciba Foundation Symposium). Nugent, J., O'Conner, M. , Pitman. London. 137-156 (1984).
- Asakawa, M. Histochemical studies of the mucus on the epidermis of eel, Anguillajaponica. Bulletin of Japanese Society of Scientific Fisheries. 36, 83-87 (1970).
- Fletcher, T. C., Jones, R., Reid, L. Identification of glycoproteins in goblet cells of epidermis and gill of plaice (Pleuroneces platessa L.), flounder (Platichthys flesus (L.)) and rainbow trout (Salmo gairdneri Richardson). Histochemical Journal. 8, 597-608 (1976).
- Silberberg, A. Mucus glycoprotein, its biophysical and gel forming properties. Symposia of the Society for Experimental Biology. 43, 43-64 (1989).
- Hills, B. The Biology of Surfactants. , Cambridge Univ. Press. Cambridge. 408 (1988).
- Aubert, H., Brook, A. J., Shephard, K. L. Measurement of the adhesion of a desmid to a substrate. British Phycology Journal. 24, 293-295 (1989).
- Sanderson, S. L., Cech, J. J., Patterson, M. R. Fluid dynamics in suspension feeding black fish. Science. 251, 1346-1348 (1991).
- Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J.
- Chaudhary, G., Ewoldt, R. H., Thiffeault, J. L.
- Downing, S., Salo, W., Spitzer, R., Koch, E. The hagfish slime gland: a model system for studying the biology of mucus. Science. 214, 1143-1145 (1981).
- Hwang, S. H., Litt, M., Forsman, W. C.
- Litt, M.
- Quarishi, M. S., Jones, N. S., Mason, J. The rheology of nasal mucus: a review. Clinical Otolaryngology. 23, 403-413 (1998).
- Nordgård, C. T., Draget, K. I., Seternes, T.
- Fernández-Alacid, L., et al. Comparison between properties of dorsal and ventral skin mucus in Senegalese sole: Response to an acute stress. Aquaculture. 513, 734410 (2019).
- Yüce, C., Willenbacher, N. Challenges in Rheological Characterization of Highly Concentrated Suspensions - Case Study for Screen-printing Silver Pastes. Journal of Visualized Experiments. (122), e55377 (2017).
- Sultan, S., Mathew, A. P. 3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds. J. Vis. Exp. (146), (2019).
- Barnes, H. A., Hutton, J. F., Walters, K. An Introduction to Rheology. , Elsevier. Amsterdam. (1989).
- National Water Information System. USGS Current Conditions for USGS 06910450 Missouri River at Jefferson City, MO. U.S. Geological Survey. , Available from: https://nwis.waterdata.usgs.gov/usa/nwis/uv/?cb_00010=on&cb_00060=on&cb_00065=on&format=gif_default&site_no=0691045&p09-19&end_date=2018-09-21 (2020).
