Макрореологическая характеристика слизи жаберных граблей у толстолобика, Hypophthalmichthys molitrix
Summary
Этот протокол представляет собой метод выполнения реологической характеристики слизи, которая находится на жаберных граблях (ГР) толстолобица. Вязкоупругие характеристики GR-слизи, полученные путем измерения вязкости, модулей хранения и потерь, оцениваются для кажущейся предельности текучести, чтобы понять механизм подачи фильтра в ГР.
Abstract
Толстолобик, Hypophthalmichthys molitrix,является инвазивной планктиворной фильтрующей фидерной рыбой, которая заразила естественные водные пути верхнего бассейна реки Миссисипи из-за ее высокоэффективного механизма подачи фильтра. Характерные органы, называемые жаберными граблями (ГР), обнаруженные во многих таких фильтрующих питателей, способствуют эффективной фильтрации частиц пищи, таких как фитопланктон, размером в несколько микрон.
Мотивация исследовать реологию слизи GR проистекает из нашего желания понять ее роль в оказании помощи процессу подачи фильтра у толстолобица. Богатая слизью жидкость в «густом и липком» состоянии может способствовать адгезии пищевых частиц. Проникновение и транспорт через мембрану GR облегчается действием внешних сил сдвига, которые вызывают изменяющиеся скорости деформации сдвига. Таким образом, реология слизи может дать жизненно важный ключ к огромному аутоконкурентоспособной природе толстолобица в бассейне фильтрующих кормящих рыб. Исходя из этого, было установлено, что слизь ГР может обеспечивать адгезивную функцию для частиц пищевых продуктов и действовать как транспортное средство для оказания помощи в процессе подачи фильтра.
Основной целью протокола является определение предела текучести слизи, относящегося к минимальному напряжению сдвига, необходимому для инициирования потока, при котором необратимая пластическая деформация впервые наблюдается на структурированном вязкоупругом материале. Соответственно, реологические свойства слизи GR, т. е. вязкость, хранение и модули потерь, были исследованы для ее неньютоновской, сдвиго-истончаемой природы с использованием ротационного реометра.
Протокол, представленный здесь, используется для анализа реологических свойств слизи, извлеченной из жаберных граблей толстолобиком, выловленного в Харт-Крик на реке Миссури. Протокол направлен на разработку эффективной стратегии реологического тестирования и характеристики материала слизи, предполагаемой как структурированный вязкоупругий материал.
Introduction
Толстолобик, Hypophthalmichthys molitrix,является планктиворным фильтрующим кормушкой и инвазивным видом, который проник в несколько естественных водных путей в Соединенных Штатах. Этот вид был первоначально интродуцирован в верхний бассейн реки Миссисипи для контроля цветения водорослей1,2,3. Толстолобик является чрезвычайно эффективным кормушителем. Как правило, его потребляемые пищевые частицы варьируются от 4 до 20 мкм до более крупного зоопланктона, которые составляют около 80 мкм3,4,5. Этот вид перетравл с другими местными рыбами и потенциально может нанести огромный ущерб местным водным путям, ограничив доступные ресурсы1,2,6. Таким образом, фильтрующие кормовые рыбы, такие как толстолобик и большеголовый карп, представляют серьезную угрозу для Великих озер1,2,6,7,8.
Фильтрующие кормовые рыбы обладают специальными органами, называемыми жаберными граблями (ГР), с тонким слоем слизи, обитающей на их поверхности. Эти органы повышают эффективность фильтрации и агрегации мелких частиц из поступающей жидкости. Целью протокола, представленного в настоящем описании, является характеристика неньютоновского, сдвигового истончающего свойства материала и предела текучести слизи GR, полученной с внутренней поверхности жаберных граблей в толстолобике. Значение предела текучести GR-слизи, установленное с помощью ротационного реометра, представляет интерес в данном исследовании. Измеренное напряжение предела текучести, также называемое «кажущееся напряжением предела текучести», зависит от методов испытаний, таких как устойчивая скорость сдвига или динамическая колебательная деформация типа9,10. Сдвиг-истончение, «жидкость предел-текучесть», претерпевает переход от твердого к жидкому поведению при критическом прикладном напряжении9,11. Кажущееся предел текучести – это минимальное напряжение сдвига, необходимое для инициирования потока или при котором необратимая пластическая деформация впервые наблюдается, когда слизь переходит из гелеобразного материала в жидко-подобный материал. Такое поведение можно наблюдать в структурированных вязкоупругих материалах. Переход от гелеобразного к жидкостному поведению грязевой слизи влечет за собой две функции: адгезивную роль для сбора пищевых частиц и роль транспортного средства для оказания помощи в процессе доставки и фильтрации твердых частиц. Расширенная функция слизи включает в себя создание диффузионных барьеров в резистентности к болезням и дыхании, обеспечение контролируемого высвобождения питательных факторов, токсичных компонентов и экскреции, создание метаболических путей для кормления и гнездования, помощь в защите хищников и производство модификаций пограничного слоя, которые улучшают локомоцию и эффективность движения12,13,14.
В отличие от простых жидкостей, сложные жидкости, такие как слизь, обладают свойствами, которые варьируются в зависимости от условий потока и требуют дополнительных параметров измерения для определения их физического поведения в масштабе объема. Для мониторинга вязкости и предела текучести GR-слизи проводятся реологические измерения с использованием ротационного реометра. Ротационный реометр применяет устойчивое или колебательное напряжение сдвига или деформацию с помощью вращающегося диска, контактирующего с образцом жидкости, и измеряет его реакцию. Обоснование использования этого прибора и метода заключается в том, что реометр может обеспечить набор измерений для описания свойств материала GR-слизи толстолобица, которые не могут быть определены только вязкостью.
Слизь является вязкоупругим материалом, и ее механическая реакция на навязанную деформацию находится между реакцией чистого твердого тела (регулируется законом упругости Гука) и реакцией чистой жидкости (управляемой законом вязкости Ньютона)15,16. Сложная макромолекулярная сеть, содержащаяся в слизи, может растягиваться и переориентироваться в ответ на внешние силы или деформацию. Вращающийся реометр состоит из геометрии конуса и пластины Пельтье, как показано на рисунке 1 и рисунке 2 (см. Таблицу 1 для спецификаций приборов). Целью данного исследования была разработка протокола для определения реологических свойств ГР-слизи. Преимуществом ротационного реометра перед вискозиметром является его способность производить динамические измерения с использованием небольших объемов образцов. Объем образца слизи GR в этом исследовании составил примерно 1,4 мл. Вискозиметр, с другой стороны, ограничен постоянными скоростями сдвига и требует больших объемов образца.
Ожидается, что реологические свойства слизи будут сильно варьироваться в пределах анатомии толстолобика. Например, свойства слизи, находящейся на поверхностях GR, могут отличаться от свойств эпибранхиального органа. Для учета потенциальной изменчивости свойств слизи в разных регионах рыбы полученный образец ГР-слизи разбавляли, а растворы трех концентраций создавали и тестировали с помощью ротационного реометра. Данные и результаты, касающиеся реологии слизи, представленные после выполнения протокола, продемонстрировали эффективность метода измерения. Иллюстративные данные, представленные в этой статье, не предназначены для обобщения всей популяции толстолобиком. Протокол, представленный в настоящем документе, может быть расширен для исследования реологии слизи в больших наборах образцов для проверки других гипотез.
Целью данного исследования является демонстрация вариации реологических свойств реологии слизи ГР с тремя различными концентрациями слизи (400 мг/мл, 200 мг/мл и 100 мг/мл). Концентрация 400 мг/мл представляет собой образец сырой слизи, собранный из рыбных ГР. Деионизированная вода (ДИ) использовалась для разбавления образца сырой слизи до концентраций 200 мг/мл и 100 мг/мл. Разбавление образцов слизи позволило оценить степень истончения сдвига и кажущийся предел текучести в зависимости от концентрации и определить концентрацию, при которой gr-слизь переходит в неньютоновское поведение. Шейкер использовался для разбиения любых больших скоплений слизи в образцах, чтобы смягчить ошибки в реологических данных из-за неоднородности.
У большинства позвоночных, включая рыб, преобладающими слизеобразующими макромолекулами являются гликопротеины (муцины), которые имеют тенденцию набухать в воде путем запутывания или химического сшивания и создают гелеобразный материал12,13,17,18,19,20. Высокомолекулярные, гелеобразующие макромолекулы и высокое содержание воды отражают скользкость в слизи13. Высокая степень межмакломолекулярных взаимодействий приводит к образованию геля, тогда как более низкие уровни межмакломолекулярных взаимодействий или разрыва связей приводят к образованию высоковязких флюидов21.
Процессам фильтрации пищевых частиц в рыбах, кормящихся фильтром, способствуют свойства, связанные со слизью GR, такие как когезия и вязкость, которые определяют ее потенциал для адгезии и прилипание22. Прочность адгезии на основе слизи зависит от конкретных межмолекулярных, электростатических или гидрофобных взаимодействий23. Sanderson et al.24 провели исследование суспензионного кормления у черной рыбы, в котором они обнаружили доказательства адгезии на основе слизи. Они заявили, что за адгезией взвешенных пищевых частиц со слизистой поверхностью следует транспорт агрегированных сгустков частиц, связанных вместе со слизью направленным потоком воды, действующим на нее24. Слизь, подверженная сдвиговым деформациям, образующаяся в результате потока воды, облегчает доставку пищевых частиц в органы пищеварения. Эндоскопические методы использовались для наблюдения за отфильтрованными частицами24.
Литература о диапазоне скоростей сдвига и практических пределах при реологическом тестировании ГР-слизи скудна. Поэтому руководство было запрошено у реологических исследований желудочной, носовой, шейной и легочной слизи, слизи кожи лосося, слизи hagfish и смазки поверхности костного сустава, в которых были изучены реологические характеристики и неньютоновские признаки11,12,25, 26,27,28,29,30,31. Совсем недавно влияние слизи рыбьей кожи на локомоцию и двигательную эффективность было изучено с помощью вискометрии с постоянной скоростью сдвига. Исследования реологии слизи кожи (без какого-либо разбавления или гомогенизации), относящиеся к морскому лесяму, морскому окуню и скудной области, продемонстрировали неньютоновское поведение при типично низких скоростях сдвига14. В другом связанном исследовании было обнаружено, что образцы сырой слизи кожи с дорсальной и вентральной сторон сенегальской подошвы демонстрируют неньютоновское поведение, что указывает на более высокую вязкость вентральной слизи при всех скоростях сдвига, рассматриваемыхкак 32. Другие реологические протоколы, относящиеся к развитию гидрогелевых каркасов и для высококонцентрированных суспензий с использованием вискозиметра с постоянной скоростью сдвига, также были зарегистрированы в литературе33,34.
В этом исследовании свойства слизи GR были исследованы с использованием ротационных реометров с контролируемой скоростью деформации, который широко использовался в реологических экспериментах на сложных биологических жидкостях25. Для ньютоновских жидкостей кажущаяся вязкость остается постоянной, не зависит от скорости сдвига, а напряжения сдвига изменяются линейно со скоростью деформации сдвига(рисунок 3A,B). Для неньютоновских жидкостей (таких как жидкости, разжижающих сдвиг) вязкость зависит от скорости сдвига или от истории деформации(рисунок 3A,B). Модуль потерь (G”) представляет степень, в которой материал сопротивляется склонности к текучести и является репрезентативным для вязкости жидкости(рисунок 4). Модуль хранения (G’) представляет собой тенденцию материала к восстановлению своей первоначальной формы после деформации, вызванной напряжением, и эквивалентен упругости(рисунок 4). Фазовый угол (δ) или значение касательной потерь вычисляется из обратного тангенса G”/G’. Он представляет собой баланс между потерей энергии и хранением, а также является общим параметром для характеристики вязкоупругих материалов (δ = 0° для твердого вещества Хуке; δ = 90° для вязкой жидкости; δ 45° для вязкоупругой жидкости)(рисунок 4)25. Кажущееся предел текучести (σy)в структурированных жидкостях представляет собой изменение состояния, которое можно наблюдать в реологических данных из устойчивого состояния развертки и динамических разверток напряжения-деформации10. Если внешнее приложенное напряжение меньше кажущейся предельной текучести, материал будет деформироваться упруго. Когда напряжение превышает кажущееся предел текучести (обозначенное как «среднее напряжение» на рисунке 3B),материал перейдет от упругой к пластической деформации и начнет течь в жидком состоянии35. Измерение модуля накопления (G’) и модуля потерь (G”) в образце слизи в условиях колебательного напряжения (или деформации) количественно определяет изменение состояния материала от гелеобразного до вязкоупругого жидкого поведения.
Здесь описаны типы тестов реометра, выполняемых для мониторинга данных, относящихся к модулю хранения (G’), модулю потерь (G”) и кажущейся вязкости (η). Динамические испытания колебаний (развертки деформации и частотные развертки) контролировали G’ и G” при контролируемых колебаниях геометрии конуса. Динамические испытания на развертку деформации определяли линейную вязкоупругую область (LVR) слизи путем мониторинга внутренней реакции материала(рисунок 4). Деформационные развертки использовались для определения поведения выхода при постоянной частоте колебаний и температуре. В ходе динамических испытаний на частотную развертку контролировалась характеристика материала на возрастающую частоту (скорость деформации) при постоянной амплитуде (деформация или напряжение) и температуре. Деформация поддерживалась в линейной вязкоупругой области (LVR) для динамических испытаний на частотную развертку. В ходе стационарных испытаний на скорость сдвига наблюдалась кажущаяся вязкость (η) при устойчивом вращении геометрии конуса. СЛИЗЬ ГР подвергали постепенным шагам напряжения, а кажущуюся вязкость (η, Па.с)) контролировали на предмет различной скорости сдвига (ý, 1/с).
Протокол, представленный в данной статье, рассматривает слизь GR как сложный структурированный материал неизвестной вязкоупругости с определенным линейным диапазоном вязкоупругого отклика. Рыбья слизь была извлечена из ГР толстолобика во время рыболовной экспедиции на месте ручья Харт в реке Миссури профессором Л. Патрисией Эрнандес (Департамент биологических наук, Университет Джорджа Вашингтона) 1,2,36. Массив ГР внутри устья толстолобица показан на рисунке 5А, а схематический рисунок представлен на рисунке 5B. Исеченный ГР показан на рисунке 5C. Извлечение слизи из ГР толстолобица представлено в качестве примера на схематических рисунках, рисунок 5D,E. Все испытания реометра проводились при постоянной, контролируемой температуре 22 ± 0,002 °C, температура, зарегистрированная на месте промысла1,2,36. Каждый образец слизи был протестирован три раза с помощью реометра, и усредненные результаты представлены вместе со статистическими погрешностностями.
Protocol
Representative Results
Discussion
Одной из основных целей разработки этого протокола является установление того, что он хорошо подходит для реологической характеристики слизи ГР при наличии очень малых объемов образцов. Мы признаем, что для полной характеристики реологических свойств слизи GR необходимы дополнительн?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают поддержку и финансирование со стороны Центра биомиметики и биоинспирированной инженерии GW. Мы благодарим профессора Л. Патрисию Эрнандес из Департамента биологических наук Университета Джорджа Вашингтона за вдохновение для исследования и постоянного сотрудничества, предоставление биологической экспертизы по физиологии толстолобиком и предоставление образцов слизи. Мы благодарим студентов, г-на Дэвида Палумбо, г-жу Карли Коэн, г-на Исаака Финберга, г-на Доминика Петросино, г-на Алексиса Рендероса, г-жу Присциллу Варгезе, г-на Картера Тегена и г-на Рагхава Паджжура за помощь в лаборатории и г-на Томаса Эванса и г-на Джеймса Томаса из TA Instruments, New Castle, DE за поддержку в обучении и обслуживании реометра. Изображения для рисунков 5A, C были сделаны во время вскрытия, выполненного профессором Л. Патрисией Эрнандес с факультета биологических наук в Университете Джорджа Вашингтона.
Materials
| Materials | |||
| Kim Wipes | VWR | 470224-038 | To clean Sample from plate |
| Gloves | VWR | 89428-750 | To prevent contamination of sample |
| Pipette | VWR | 89079-974 | To transport sample from vial to rheometer |
| Pipette Tips | Thermo Scientific | 72830-042 | To transport sample from vial to rheometer |
| Shaker | VWR | 89032-094 | To homogenously mix sample of mucus |
| Vials | VWR | 66008-710 | Contains measured sample volumes |
| Weigh Scale | Ohaus | Scout –SPX Balances | To weigh mass of mucus samples |
| Chemical Reagents | |||
| De-Ionized Water (H20) | – | – | Liquid |
| Sterile 70% Isopropanol (C3H8O) | VWR | 89108-162 | Liquid |
| GR Mucus | |||
| 100 mg/mL concentration, 2mL | – | – | Viscoelastic Material |
| 400 mg/mL concentration, 1mL | – | – | Viscoelastic Material |
| 200 mg/mL concentration, 1mL | – | – | Viscoelastic Material |
| Software | |||
| MATLAB | Mathworks | R2017a | Data analysis, post-processing and graphical representation |
| Trios | TA Instruments | v4.5.042498 | Rheometer instrument control and analysis software |
References
- Cohen, K. E., Hernandez, L. P. The complex trophic anatomy of silver carp, Hypophthalmichthys molitrix, highlighting a novel type of epibranchial organ. Journal of Morphology. 279, 1615-1628 (2018).
- Cohen, K. E., Hernandez, L. P. Making a master filterer: Ontogeny of specialized filtering plates in silver carp (Hypophthalmichthys molitrix). Journal of Morphology. 279, 925-935 (2018).
- Cremer, M., Smitherman, R. Food habits and growth of silver and bighead carp in cages and ponds. Aquaculture. 20 (1), 57-64 (1980).
- Battonyai, I., et al. Relationship between gill raker morphology and feeding habits of hybrid bigheaded carps (Hypophthalmichthys spp.). Knowledge and Management of Aquatic Ecosystems. 416, 36 (2015).
- Zhou, Q., Xie, P., Xu, J., Ke, Z., Guo, L. Growth and food availability of silver and bighead carps: Evidence from stable isotope and gut content analysis. Aquaculture Research. 40 (14), 1616-1625 (2009).
- Freedman, J. A., Butler, S. E., Wahl, D. H. . Impacts of invasive Asian carps on native food webs (Final Report). , (2012).
- Nico, L., Fuller, P., Li, J. . Silver carp (Hypophthalmichthys molitrix)-FactSheet. , (2017).
- Walleser, L., Howard, D., Sandheinrich, M., Gaikowski, M., Amberg, J. Confocal microscopy as a useful approach to describe gill rakers of Asian species of carp and native filter-feeding fishes of the upper Mississippi River system. Journal of Fish Biology. 85 (5), 1777-1784 (2014).
- Nelson, A. Z., Ewoldt, R. H. Design of yield-stress fluids: a rheology-to-structure inverse problem. Soft Matter. 13, 7578-7594 (2017).
- Chen, T. Rheological Techniques for Yield Stress Analysis. TA Instruments Applications Note, RH025. , (2020).
- Ewoldt, R. H., Johnston, M. T., Caretta, L. M., Spagnolie, S. Experimental challenges of shear rheology: how to avoid bad data. Complex Fluids in Biological Systems. , (2015).
- Thornton, D. J., Sheehan, J. K. From Mucins to Mucus: Toward a more coherent understanding of this essential barrier. Proceedings of the American Thoracic Society. 1, 54-61 (2004).
- Shepard, K. L. Functions for fish mucus. Reviews in Fish Biology and Fisheries. 4, 401-429 (1994).
- Fernández-Alacid, L., et al. Skin mucus metabolites in response to physiological challenges: A valuable non-invasive method to study teleost marine species. Science of the Total Environment. 644, 1323-1335 (2018).
- Wagner, C. E., Wheeler, K. M., Ribbeck, K. Mucins and Their Role in Shaping the Functions of Mucus Barriers. Annual Reviews in Cell and Developmental Biology. 34, 189-215 (2018).
- Bird, R. B., Armstrong, R. C., Hassager, O. . Dynamics of Polymeric Liquids, Volume 1: Fluid Mechanics. , 1255-1284 (1987).
- Mantle, M., Allen, A. Isolation and characterisation of the native glycoprotein from pig small intestinal mucus. Biochemical Journal. 195, 267-275 (1981).
- Allen, A., Hutton, D. A., Pearson, J. P., Sellers, L. A., Nugent, J., O’Conner, M. Mucus glycoprotein structure, gel formation and gastrointestinal mucus function. Mucus and Mucosa (Ciba Foundation Symposium). , 137-156 (1984).
- Asakawa, M. Histochemical studies of the mucus on the epidermis of eel, Anguillajaponica. Bulletin of Japanese Society of Scientific Fisheries. 36, 83-87 (1970).
- Fletcher, T. C., Jones, R., Reid, L. Identification of glycoproteins in goblet cells of epidermis and gill of plaice (Pleuroneces platessa L.), flounder (Platichthys flesus (L.)) and rainbow trout (Salmo gairdneri Richardson). Histochemical Journal. 8, 597-608 (1976).
- Silberberg, A. Mucus glycoprotein, its biophysical and gel forming properties. Symposia of the Society for Experimental Biology. 43, 43-64 (1989).
- Hills, B. . The Biology of Surfactants. , 408 (1988).
- Aubert, H., Brook, A. J., Shephard, K. L. Measurement of the adhesion of a desmid to a substrate. British Phycology Journal. 24, 293-295 (1989).
- Sanderson, S. L., Cech, J. J., Patterson, M. R. Fluid dynamics in suspension feeding black fish. Science. 251, 1346-1348 (1991).
- Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (2), 86-100 (2009).
- Chaudhary, G., Ewoldt, R. H., Thiffeault, J. L. Unravelling hagfish slime. Journal of Royal Society Interface. 16 (150), 20180710 (2019).
- Downing, S., Salo, W., Spitzer, R., Koch, E. The hagfish slime gland: a model system for studying the biology of mucus. Science. 214, 1143-1145 (1981).
- Hwang, S. H., Litt, M., Forsman, W. C. Rheological properties of mucus. Rheologica Acta. 8, 438-448 (1969).
- Litt, M. Mucus rheology. Archives of Internal Medicine. 126, 417-423 (1970).
- Quarishi, M. S., Jones, N. S., Mason, J. The rheology of nasal mucus: a review. Clinical Otolaryngology. 23, 403-413 (1998).
- Nordgård, C. T., Draget, K. I., Seternes, T. Rheology of salmon skin mucus. Annual Transactions – The Nordic Rheology Society. 23, 175-179 (2015).
- Fernández-Alacid, L., et al. Comparison between properties of dorsal and ventral skin mucus in Senegalese sole: Response to an acute stress. Aquaculture. 513, 734410 (2019).
- Yüce, C., Willenbacher, N. Challenges in Rheological Characterization of Highly Concentrated Suspensions – Case Study for Screen-printing Silver Pastes. Journal of Visualized Experiments. (122), e55377 (2017).
- Sultan, S., Mathew, A. P. 3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds. J. Vis. Exp. (146), (2019).
- Barnes, H. A., Hutton, J. F., Walters, K. . An Introduction to Rheology. , (1989).
- USGS Current Conditions for USGS 06910450 Missouri River at Jefferson City, MO. U.S. Geological Survey Available from: https://nwis.waterdata.usgs.gov/usa/nwis/uv/?cb_00010=on&cb_00060=on&cb_00065=on&format=gif_default&site_no=0691045&p09-19&end_date=2018-09-21 (2020)
