Makroreologi Karakterisering av Gill Raker slem i silverkarpen, Hypophthalmichthys molitrix
Summary
Detta protokoll presenterar en metod för att utföra reologi karakterisering av slem som ligger på gill rakers (GRs) av silver karpen. Viskoelastiska egenskaper hos GR-slem, som erhålls genom mätning av viskositet, lagring och förlustmoduli, utvärderas för den uppenbara avkastningsstressen för att förstå filtermatningsmekanismen i AR.
Abstract
Silverkarpen Hypophthalmichthys molitrixär en invasiv planktivorös filtermatarfisk som angripit de naturliga vattenvägarna i övre Mississippis flodbassäng på grund av dess mycket effektiva filtermatningsmekanism. De karakteristiska organen som kallas gill rakers (GRs), som finns i många sådana filtermatare, underlättar effektiv filtrering av matpartiklar som fytoplankton som är av några mikrometer i storlek.
Motivationen att undersöka reologin i GR-slem härrör från vår önskan att förstå dess roll i att hjälpa filtermatningsprocessen i silverkarpen. Den slemrika vätskan, i ett “tjockt och klibbigt” tillstånd kan underlätta vidhäftningen av matpartikeler. Genomträngningen och transporten genom GR-membranet underlättas av verkan av yttre savkrafter som inducerar varierande savstamhastigheter. Därför kan slemreologi ge en viktig ledtråd till silverkarpens enorma utkonkurrenskraft i poolen av filtermatande fisk. Baserat på detta hävdades det att GR-slem kan ge en självhäftande funktion till livsmedelspartiklar och fungera som ett transportfordon för att hjälpa till i filtermatningsprocessen.
Huvudsyftet med protokollet är att bestämma slemmets avkastningsstress, som tillskrivs den minsta savspänning som krävs för att initiera flöde vid vilket irreversibel plastdeformation först observeras över ett strukturerat viskoelastiskt material. Följaktligen undersöktes reologiska egenskaper hos GR slem, dvs viskositet, lagring och förlust moduli, för dess icke-newtonska, shear-gallring natur med hjälp av en roterande reometer.
Ett protokoll som presenteras här används för att analysera de reologiska egenskaperna hos slem extraherade från gill rakers av en silverkarp, fiskad vid Hart Creek-platsen för Missouri River. Protokollet syftar till att utveckla en effektiv strategi för reologisk testning och materialkarakterisering av slem som antas vara ett strukturerat viskoelastiskt material.
Introduction
Silverkarpen Hypophthalmichthys molitrixär en planktivorös filtermatare och en invasiv art som har infiltrerat flera naturliga vattenvägar i USA. Denna art introducerades ursprungligen i övre Mississippi River basin för att kontrollera algblomningar1,2,3. Silverkarpen är en extremt effektiv matare. Vanligtvis varierar dess förbrukningsbara matpartikelstorlekar från 4 till 20 μm till större zooplankton som är cirka 80 μm3,4,5. Denna art har konkurrerat ut andra inhemska fiskar och kan potentiellt orsaka enorma skador på inhemska vattenvägar genom att begränsa tillgängliga resurser1,2,6. Således utgör filtermatning av fisk som silverkarpen och bighead-karpen ett stort hot mot de storasjöarna 1,2,6,7,8.
Filtermatningsfisk har speciella organ som kallas gillkratorna (GRs) med ett tunt lager slem som bor på deras yta. Dessa organ förbättrar effektiviteten av filtrering och aggregering av små partiklar från den inkommande vätskan. Målet med protokollet som presenteras häri är att karakterisera den icke-newtonska, savförtunnande materiella egenskapen och ge stress av GR-slem som förvärvats från gillkraggornas inre yta i silverkarpen. Värdet av avkastning stress av GR-slem, konstateras med hjälp av en roterande reometer, är av intresse i denna studie. Den uppmätta avkastningsstressen som också kallas “skenbar avkastningsstress” beror på testmetoderna som stadig savhastighet eller dynamisk svängningsbelastning typ9,10. Den savförtunnande, “yield-stress fluid”, genomgår en övergång från fast till vätskeliknande beteende vid en kritisk tillämpad stress9,11. Den uppenbara avkastningsstressen är den minsta skärspänning som krävs för att initiera flöde eller den vid vilken irreversibel plastdeformation först observeras när slemmet övergår från ett gelliknande material till ett vätskeliknande material. Detta beteende kan observeras i strukturerade viskoelastiska material. Övergången från gelliknande till vätskeliknande beteende hos GR-slem innebär två funktioner, dvs. en vidhäftande roll för att samla matpartikeler och en transportfordonsroll för att hjälpa till i partikelleverans- och filtreringsprocessen. Slemts utökade funktion inkluderar att skapa diffusionsbarriärer vid sjukdomsresistens och andning, ge kontrollerad frisättning av näringsfaktorer, giftiga komponenter och utsöndring, skapa metaboliska vägar för utfodring och nestning, hjälpa till med rovdjursskydd och producera gränsskiktsändringar som förbättrar rörelse och propulsiveffektivitet 12,13,14.
Till skillnad från enkla vätskor har komplexa vätskor som slem egenskaper som varierar med flödesförhållanden och kräver ytterligare mätparametrar för att definiera deras fysiska beteende i bulkskala. För att övervaka viskositeten och ge stress av GR-slem utförs reologiska mätningar med hjälp av en roterande reometer. Rotationsreometern applicerar en stadig eller svängbar saxspänning eller stam med hjälp av en roterande skiva i kontakt med vätskeprovet och mäter dess svar. Logiken bakom att använda detta instrument och teknik är att reometern kan ge en uppsättning mätningar för att beskriva materialegenskaperna hos GR-slemmet hos silverkarpen, som inte kan definieras enbart av viskositet.
Slemmet är ett viskoelastiskt material och dess mekaniska reaktion på en påtvingad deformation är mellan en ren fast (styrd av Hookes elasticitetslag) och en ren vätska (styrd av Newtons viskositetslag)15,16. Det komplexa makromolekylära nätverket som finns i slemmet kan sträcka sig och omorienteras som svar på yttre krafter eller deformation. En rotationsreometer består av en kongeometri och en Peltierplatta enligt figur 1 och figur 2 (se tabell 1 för instrumentspecifikationer). Syftet med denna studie var att utveckla ett protokoll för att bestämma de reologiska egenskaperna hos GR slem. En fördel med rotationsreometern jämfört med en viscometer är dess förmåga att göra dynamiska mätningar med hjälp av små provvolymer. Gr slem prov volym i denna studie var cirka 1,4 ml. Viscometern är däremot begränsad till konstanta saxhastigheter och kräver stora provvolymer.
Slemmets reologiska egenskaper förväntas variera kraftigt inom silverkarpanatomi. Till exempel kan egenskaperna hos slem som bor på GR-ytorna vara annorlunda än epibranchialorganet. För att ta hänsyn till den potentiella variationen av slemegenskaper i olika delar av fisken späddes det förvärvade GR-slemprovet ut och lösningar av tre koncentrationer skapades och testades med hjälp av rotationsreometern.. De data och resultat avseende slemreologi som rapporterats efter att protokollet utförts visade mätteknikens effektivitet. De belysande data som presenteras i detta dokument är inte avsedda att generaliseras över hela silverkarppopulationen. Protokollet som presenteras häri kan utvidgas för att undersöka slemreologi över större provuppsättningar för att testa andra hypoteser.
Syftet med denna studie är att visa variationen av reologiska egenskaper hos GR slem reologi med tre olika slem koncentrationer (400 mg/mL, 200 mg/mL och 100 mg/mL). Koncentrationen på 400 mg/ml representerar det råa slemprov som skördats från fisk-GRs. Avjoniserat vatten (DI) användes för att späda ut det råa slemprovet till koncentrationerna 200 mg/mL och 100 mg/ml. Utspädning av slemproverna gjorde det möjligt att utvärdera graden av saxförtunning och uppenbar avkastningsstress som en funktion av koncentrationen och bestämningen av den koncentration vid vilken GR-slem övergår till icke-newtonskt beteende. En shaker användes för att bryta ner några stora klumpar av slem i proverna för att mildra fel i reologiska data på grund av inhomogenitet.
Hos de flesta ryggradsdjur, inklusive fisk, är de dominerande slembildande makromolekylerna glykoproteiner (muciner) som tenderar att svälla i vatten genom förvecklingar eller kemisk korslänkning och skapa ett gelliknande material12,13,17,18,19,20. Den högmolekylära, gelbildande makromolekylen och högvattenhalten återspeglar halkan i slem13. En hög grad av intermakromolekylära interaktioner leder till gelbildning medan lägre nivåer av intermakromolekylära interaktioner eller brutna bindningar resulterar i vätskor med hög viskositet21.
Processerna för livsmedelspartikelfiltrering i filtermatningsfisk underlättas av GR-slemrelaterade egenskaper som sammanhållning och viskositet som bestämmer dess potential för vidhäftning och stift22. Styrkan hos slembaserad vidhäftning beror på specifika intermolecular, elektrostatiska eller hydrofobiska interaktioner23. Sanderson et al.24 genomförde en suspensionsmatningsstudie på svartfisk där de fann bevis för slembaserad vidhäftning. De uppgav att vidhäftningen av suspenderade livsmedelspartiklar med en slemhinna följs av transport av aggregerade klumpar av partiklar som binds samman med slem genom riktat vattenflöde som verkar påden 24. Slem som utsätts för savstamhastigheter som genereras från vattenflödet underlättar leveransen av livsmedelspartikeler till matsmältningsorgan. Endoskopiska tekniker användes för att observera filtrerade partiklar24.
Litteratur om utbudet av saxhastigheter och praktiska gränser i reologiska tester av GR slem är knappa. Därför söktes vägledning från reologiska studier om mag-, näs-, livmoderhals- och lungslem, laxhudsslem, hagfish slime och benledssmörjmedel där de reologiska karakteriseringen och icke-newtonska attributenstuderades 11,12,25,26,27,28,29,30,31. På senare tid har effekten av fiskhudsslem på rörelse och framdrivningseffektivitet studerats med konstant savhastighet viscometry. Hudslem reologi studier (utan någon utspädning eller homogenisering) som hänför sig till seabream, havsabborre och magert visat icke-newtonskt beteende vid vanligtvis låg saxhastigheter 14. I en annan relaterad studie konstaterades de råa huden slem prover från dorsala och ventrala sidor av senegalesiska sulan uppvisar icke-newtonskt beteende, vilket indikerar en högre viskositet av ventral slem alls shear hastigheteranses 32. Andra reologiska protokoll som hänför sig till vattenkraftsställningens utveckling och för högkoncentrerade suspensioner med konstant saxhastighetsvisscometer har också rapporterats ilitteraturen 33,34.
I denna studie undersöktes GR slem egenskaper med hjälp av en stamhastighet kontrolleras, roterande reometer som har använts i stor utsträckning i reologi experiment på komplexa biologiskavätskor 25. För newtonska vätskor förblir den uppenbara viskositeten konstant, är shear-rate-oberoende och savspänningarna varierar linjärt med savbelastningshastigheter(figur 3A,B). För icke-newtonska vätskor (t.ex. savförtunnande vätskor) är viskositeten shear-rate-beroende eller deformation-history-beroende(Figur 3A,B). Förlustmodulen (G”) representerar i vilken utsträckning materialet motstår tendensen att flöda och är representativt för vätskeviskositet (figur 4). Lagringsmodulen (G’) representerar materialets tendens att återställa sin ursprungliga form efter stressinducerad deformation och motsvarar elasticitet (figur 4). Fasvinkeln (δ) eller förlustförhärdningsvärdet beräknas utifrån G/G:s omvända tangent” Den representerar balansen mellan energiförlust och lagring och är också en vanlig parameter för karakterisering av viskoelastiska material (δ = 0° för ett hookeanskt fast ämne; δ = 90° för en trögflytande vätska; δ 45° för en viskoelastisk vätska) (Figur 4)25. Den uppenbara avkastningsstressen (σy)i strukturerade vätskor representerar en förändring av tillståndet som kan observeras i reologiska data från steady state sweep och dynamiska stress-stamsveper 10. Om den yttre applicerade stressen är mindre än den uppenbara avkastningsspänningen kommer materialet att deformeras elastiskt. När stressen överskrider den uppenbara avkastningsspänningen (markerad som “genomsnittlig stress” i figur 3B)övergår materialet från elastisk till plastisk deformation och börjar flöda i flytande tillstånd35. Mätning av lagringsmodulen (G’) och förlustmodulen (G”) i slemprovet under oscillatorisk stress (eller stam) kväver förändringen i materialtillståndet från gelliknande till viskoelastiskt vätskeliknande beteende.
De typer av reometertester som utförs för att övervaka data som rör lagringsmodulus (G), förlustmodulus (G”) och synbar viskositet (η) beskrivs här. De dynamiska svängningstesterna (belastningssvepningar och frekvenssvep) övervakade G’ och G” under kontrollerad svängning av kongeometrin. De dynamiska belastningssvepningstesterna bestämde slemmets linjära viskoelastiska region (LVR) genom att övervaka det inneboende materialsvaret (figur 4). Stam svep användes för att bestämma det givande beteendet vid konstant svängning frekvens och temperatur. De dynamiska frekvenssvepningstesterna övervakade materialets reaktion på ökande frekvens (deformationshastighet) vid en konstant amplitud (stam eller stress) och temperatur. Stam bibehölls i den linjära viskoelastiska regionen (LVR) för dynamiska frekvens svep tester. Provningarna av snövarhastigheten i steady state övervakade den uppenbara viskositeten (η) under stadig rotation av kongeometrin. GR-slemmet utsattes för inkrementella stresssteg och den uppenbara viskositeten (η, Pa.s) övervakades för varierande savfrekvens (ý, 1/s).
Protokollet som presenteras i detta dokument behandlar GR slem som ett komplext strukturerat material av okänd viskoelasticitet med ett visst linjärt viskoelastiskt svarsområde. Fiskslemmet extraherades från den stora delen av silverkarpen under en fiskeexpedition vid Hart creek-platsen i Missourifloden av professor L. Patricia Hernandez (Institutionen för biologiska vetenskaper, George Washington University) 1,2,36. En rad RS inuti munnen på en Silverkarp visas i figur 5A och en schematisk ritning presenteras i figur 5B. Ett struket GR visas i figur 5C. Extraktionen av slem från GRs av silverkarpen presenteras som ett exempel i de schematiska ritningarna, figur 5D, E. Alla reometertester utfördes under en konstant, kontrollerad temperatur på 22 ± 0,002 °C, temperaturen som uppmättes på fiskeplatsen1,2,36. Varje slemprov testades tre gånger med reometern, och de genomsnittliga resultaten presenteras tillsammans med de statistiska felstaplarna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett av huvudsyftena med att utveckla detta protokoll är att fastställa att det är väl lämpat för reologisk karakterisering av GR-slem när mycket små provvolymer finns tillgängliga. Vi erkänner att fler prover från en skola av silverkarp behövs för att fullt ut karakterisera gr slem och de data som presenteras häri är inte en generalisering över hela silverkarppopulationen. Vår teknik är motiverad på grund av dess effektivitet med reologisk karakterisering av små provvolymer och med utökade undersökn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner stöd och finansiering från GW Center for Biomimetics and Bioinspired Engineering. Vi tackar professor L. Patricia Hernandez vid institutionen för biologiska vetenskaper vid George Washington University för att ha inspirerat utredningen och det pågående samarbetet, tillhandahållit biologisk expertis om silverkarpens fysiologi och tillhandahållit slemproverna. Vi tackar studenterna, Mr. David Palumbo, Ms. Carly Cohen, Mr Isaac Finberg, Mr. Dominick Petrosino, Mr Alexis Renderos, Ms Priscilla Varghese, Mr Carter Tegen och Mr Raghav Pajjur för hjälp i laboratoriet och Mr. Thomas Evans och Mr. James Thomas från TA Instruments, New Castle, DE för stöd med utbildning och underhåll av reometern. Bilder för figur 5A,C togs under en dissekering utförd av professor L. Patricia Hernandez vid institutionen för biologiska vetenskaper vid George Washington University.
Materials
| Materials | |||
| Kim Wipes | VWR | 470224-038 | To clean Sample from plate |
| Gloves | VWR | 89428-750 | To prevent contamination of sample |
| Pipette | VWR | 89079-974 | To transport sample from vial to rheometer |
| Pipette Tips | Thermo Scientific | 72830-042 | To transport sample from vial to rheometer |
| Shaker | VWR | 89032-094 | To homogenously mix sample of mucus |
| Vials | VWR | 66008-710 | Contains measured sample volumes |
| Weigh Scale | Ohaus | Scout –SPX Balances | To weigh mass of mucus samples |
| Chemical Reagents | |||
| De-Ionized Water (H20) | – | – | Liquid |
| Sterile 70% Isopropanol (C3H8O) | VWR | 89108-162 | Liquid |
| GR Mucus | |||
| 100 mg/mL concentration, 2mL | – | – | Viscoelastic Material |
| 400 mg/mL concentration, 1mL | – | – | Viscoelastic Material |
| 200 mg/mL concentration, 1mL | – | – | Viscoelastic Material |
| Software | |||
| MATLAB | Mathworks | R2017a | Data analysis, post-processing and graphical representation |
| Trios | TA Instruments | v4.5.042498 | Rheometer instrument control and analysis software |
References
- Cohen, K. E., Hernandez, L. P. The complex trophic anatomy of silver carp, Hypophthalmichthys molitrix, highlighting a novel type of epibranchial organ. Journal of Morphology. 279, 1615-1628 (2018).
- Cohen, K. E., Hernandez, L. P. Making a master filterer: Ontogeny of specialized filtering plates in silver carp (Hypophthalmichthys molitrix). Journal of Morphology. 279, 925-935 (2018).
- Cremer, M., Smitherman, R. Food habits and growth of silver and bighead carp in cages and ponds. Aquaculture. 20 (1), 57-64 (1980).
- Battonyai, I., et al. Relationship between gill raker morphology and feeding habits of hybrid bigheaded carps (Hypophthalmichthys spp.). Knowledge and Management of Aquatic Ecosystems. 416, 36 (2015).
- Zhou, Q., Xie, P., Xu, J., Ke, Z., Guo, L. Growth and food availability of silver and bighead carps: Evidence from stable isotope and gut content analysis. Aquaculture Research. 40 (14), 1616-1625 (2009).
- Freedman, J. A., Butler, S. E., Wahl, D. H. . Impacts of invasive Asian carps on native food webs (Final Report). , (2012).
- Nico, L., Fuller, P., Li, J. . Silver carp (Hypophthalmichthys molitrix)-FactSheet. , (2017).
- Walleser, L., Howard, D., Sandheinrich, M., Gaikowski, M., Amberg, J. Confocal microscopy as a useful approach to describe gill rakers of Asian species of carp and native filter-feeding fishes of the upper Mississippi River system. Journal of Fish Biology. 85 (5), 1777-1784 (2014).
- Nelson, A. Z., Ewoldt, R. H. Design of yield-stress fluids: a rheology-to-structure inverse problem. Soft Matter. 13, 7578-7594 (2017).
- Chen, T. Rheological Techniques for Yield Stress Analysis. TA Instruments Applications Note, RH025. , (2020).
- Ewoldt, R. H., Johnston, M. T., Caretta, L. M., Spagnolie, S. Experimental challenges of shear rheology: how to avoid bad data. Complex Fluids in Biological Systems. , (2015).
- Thornton, D. J., Sheehan, J. K. From Mucins to Mucus: Toward a more coherent understanding of this essential barrier. Proceedings of the American Thoracic Society. 1, 54-61 (2004).
- Shepard, K. L. Functions for fish mucus. Reviews in Fish Biology and Fisheries. 4, 401-429 (1994).
- Fernández-Alacid, L., et al. Skin mucus metabolites in response to physiological challenges: A valuable non-invasive method to study teleost marine species. Science of the Total Environment. 644, 1323-1335 (2018).
- Wagner, C. E., Wheeler, K. M., Ribbeck, K. Mucins and Their Role in Shaping the Functions of Mucus Barriers. Annual Reviews in Cell and Developmental Biology. 34, 189-215 (2018).
- Bird, R. B., Armstrong, R. C., Hassager, O. . Dynamics of Polymeric Liquids, Volume 1: Fluid Mechanics. , 1255-1284 (1987).
- Mantle, M., Allen, A. Isolation and characterisation of the native glycoprotein from pig small intestinal mucus. Biochemical Journal. 195, 267-275 (1981).
- Allen, A., Hutton, D. A., Pearson, J. P., Sellers, L. A., Nugent, J., O’Conner, M. Mucus glycoprotein structure, gel formation and gastrointestinal mucus function. Mucus and Mucosa (Ciba Foundation Symposium). , 137-156 (1984).
- Asakawa, M. Histochemical studies of the mucus on the epidermis of eel, Anguillajaponica. Bulletin of Japanese Society of Scientific Fisheries. 36, 83-87 (1970).
- Fletcher, T. C., Jones, R., Reid, L. Identification of glycoproteins in goblet cells of epidermis and gill of plaice (Pleuroneces platessa L.), flounder (Platichthys flesus (L.)) and rainbow trout (Salmo gairdneri Richardson). Histochemical Journal. 8, 597-608 (1976).
- Silberberg, A. Mucus glycoprotein, its biophysical and gel forming properties. Symposia of the Society for Experimental Biology. 43, 43-64 (1989).
- Hills, B. . The Biology of Surfactants. , 408 (1988).
- Aubert, H., Brook, A. J., Shephard, K. L. Measurement of the adhesion of a desmid to a substrate. British Phycology Journal. 24, 293-295 (1989).
- Sanderson, S. L., Cech, J. J., Patterson, M. R. Fluid dynamics in suspension feeding black fish. Science. 251, 1346-1348 (1991).
- Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (2), 86-100 (2009).
- Chaudhary, G., Ewoldt, R. H., Thiffeault, J. L. Unravelling hagfish slime. Journal of Royal Society Interface. 16 (150), 20180710 (2019).
- Downing, S., Salo, W., Spitzer, R., Koch, E. The hagfish slime gland: a model system for studying the biology of mucus. Science. 214, 1143-1145 (1981).
- Hwang, S. H., Litt, M., Forsman, W. C. Rheological properties of mucus. Rheologica Acta. 8, 438-448 (1969).
- Litt, M. Mucus rheology. Archives of Internal Medicine. 126, 417-423 (1970).
- Quarishi, M. S., Jones, N. S., Mason, J. The rheology of nasal mucus: a review. Clinical Otolaryngology. 23, 403-413 (1998).
- Nordgård, C. T., Draget, K. I., Seternes, T. Rheology of salmon skin mucus. Annual Transactions – The Nordic Rheology Society. 23, 175-179 (2015).
- Fernández-Alacid, L., et al. Comparison between properties of dorsal and ventral skin mucus in Senegalese sole: Response to an acute stress. Aquaculture. 513, 734410 (2019).
- Yüce, C., Willenbacher, N. Challenges in Rheological Characterization of Highly Concentrated Suspensions – Case Study for Screen-printing Silver Pastes. Journal of Visualized Experiments. (122), e55377 (2017).
- Sultan, S., Mathew, A. P. 3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds. J. Vis. Exp. (146), (2019).
- Barnes, H. A., Hutton, J. F., Walters, K. . An Introduction to Rheology. , (1989).
- USGS Current Conditions for USGS 06910450 Missouri River at Jefferson City, MO. U.S. Geological Survey Available from: https://nwis.waterdata.usgs.gov/usa/nwis/uv/?cb_00010=on&cb_00060=on&cb_00065=on&format=gif_default&site_no=0691045&p09-19&end_date=2018-09-21 (2020)
