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Bioengineering

कार्यात्मक और ध्रुवीकृत पित्त एपिथेलियल अल्सर की पीढ़ी और मात्रात्मक लक्षण वर्णन

Published: May 16, 2020 doi: 10.3791/61404
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2
1Physiopathogénèse et traitement des maladies du foie, Université Paris-Saclay, Inserm U1193, 2ESPCI Paris, Université PSL
* These authors contributed equally

Summary

त्रि-आयामी (3 डी) सेलुलर सिस्टम ऑर्गेनोजेनेसिस की जांच के लिए प्रासंगिक मॉडल हैं। पित्त अल्सर उत्पादन और उनके लक्षण वर्णन के लिए एक हाइड्रोजेल आधारित विधि प्रस्तावित है। यह प्रोटोकॉल पुटी गठन दक्षता, आकारों का आकलन करने और उनकी कार्यक्षमता का परीक्षण करने के लिए एक सीधी और विश्वसनीय विधि के साथ 3 डी लक्षण वर्णन की बाधाओं को उजागर करता है।

Abstract

Cholangiocytes, एपिथेलियल कोशिकाओं है कि जिगर में पित्त नलिकाओं को लाइन, पित्त गठन और संशोधन की देखरेख । पिछले बीस वर्षों में, यकृत रोगों के संदर्भ में, कोलंगियोसाइट्स पर आधारित 3-आयामी (3 डी) मॉडल जैसे अल्सर, स्फेरॉइड, या ट्यूब जैसी संरचनाएं ऑर्गेनोजेनेसिस, रोग मॉडलिंग और दवा स्क्रीनिंग अध्ययन के लिए ऊतक टोपोलॉजी की नकल करने के लिए उभरी हैं। इन संरचनाओं को मुख्य रूप से हाइड्रोगेल में कोलंगियोसाइट्स एम्बेड करके प्राप्त किया गया है। इसका मुख्य उद्देश्य एपिथेलियल ध्रुवता, कार्यात्मक और रूपात्मक गुणों को संबोधित करके आत्म-संगठन का अध्ययन करना था। हालांकि, बहुत कम अध्ययन पुटी गठन दक्षता पर ध्यान केंद्रित करते हैं। जब यह मामला है, दक्षता अक्सर एक ही विमान की छवियों से मात्रा निर्धारित है । हाइड्रोजेल पॉलीमराइजेशन विषमता और दुष्प्रभावों से उत्पन्न होने वाले पुटी वितरण की संभावित विषमता का प्रतिनिधित्व किए बिना कार्यात्मक परख और संरचनात्मक विश्लेषण किया जाता है। इसलिए, मात्रात्मक विश्लेषण, जब किया जाता है, एक लेख से दूसरे में तुलना के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, यह पद्धति विभिन्न मैट्रिस और सेल प्रकारों की 3डी विकास क्षमता की तुलना की अनुमति नहीं देती है। इसके अतिरिक्त, इम्यूनोदाता अल्सर के लिए प्रयोगात्मक समस्या निवारण का कोई उल्लेख नहीं है। इस लेख में, हम यह दिखाने के लिए एक विश्वसनीय और सार्वभौमिक विधि प्रदान करते हैं कि प्रारंभिक सेल वितरण पुटी गठन के विषम ऊर्ध्वाधर वितरण से संबंधित है। हाइड्रोगेल में एम्बेडेड चोलंगियोसाइट कोशिकाओं को 10 दिनों के समय पाठ्यक्रम में हाइड्रोगेल गहराई के साथ जेड-स्टैक विश्लेषण के साथ पालन किया जाता है। इस विधि के साथ, पुटी गठन दक्षता और विकास की एक मजबूत गतिज प्राप्त की जाती है। हम पुटी ध्रुवता और गुप्त कार्य का मूल्यांकन करने के तरीके भी प्रस्तुत करते हैं। अंत में, इमेजिंग के लिए पुटी पतन को सीमित करने के लिए इम्यूनोस्टेटिंग प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए अतिरिक्त सुझाव प्रदान किए जाते हैं। इस दृष्टिकोण को अन्य 3 डी सेल संस्कृति अध्ययनों पर लागू किया जा सकता है, इस प्रकार एक सिस्टम की तुलना दूसरे से करने की संभावनाओं को खोल दिया जाता है।

Introduction

पिछले तीन दशकों में, इन विट्रो अनुसंधान का क्षेत्र 3 डी संस्कृति प्रणालियों की ओर उन्नत हुआ है। 3 डी में कोशिकाओं को स्फेरॉइड या एक पीपाड़/मैट्रिक्स की उपस्थिति या अनुपस्थिति में, एक बूंद में, आंदोलन में, माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में, या फ्लोटिंग 1 के रूप में कोशिकाओं को बनाने के लिए कई प्रोटोकॉलउभरेहैं। 3 डी संस्कृति विधियों के उपयोग ने 2-आयामी (2 डी) संस्कृतियों पर अपने फायदे साबित कर दिए हैं, विशेष रूप से एपिथेलियल कोशिकाओं के लिए, जिन्हें 3 डी संरचनाओं में स्वयं-व्यवस्थित करने के लिए दिखाया गया था, जिसे अल्सर या असिनी कहा जाता है। इस मामले में, कोशिकाएं एक ल्यूमेन को घेरते हुए एक मोनोलेयर बनाती हैं, जहां कोशिकाएं बेहतर शारीरिक विशिष्ट कार्यों के साथ अपना पूर्ण एपिथेलियल फेनोटाइप प्राप्त करती हैं2।

कई अध्ययनों ने प्राकृतिक मैट्रिस में इन एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड बनाने के तरीकों के विकास में योगदान दिया है। इसने वीवो सेल-सेल और सेल-माइक्रोएनवायरमेंट इंटरैक्शन में पुनर्पूंजीकरण करने की अनुमति दी है, ताकि एपिथेलियल फेनोटाइप3, 4,5,6,7की स्थापना और स्थिरता प्राप्त की जा सके। हाल ही में, और विशेष रूप से प्रत्यारोपण योग्य ऑर्गेनॉइड विकसित करने और एपिथेलियल कार्यक्रम के आयोजन के लिए माइक्रोएनवायरमेंट की आवश्यकता को समझने के उद्देश्य से, एपिथेलियल असिनी8,9,10के गठन को बढ़ाने के लिए सिंथेटिक हाइड्रोगेल विकसित किए गए हैं। दुर्भाग्य से, ये अध्ययन गुणात्मक डेटा पर रिपोर्ट करते हैं, या आंतरिक संदर्भों का उपयोग करके वर्तमान गणना विधियों जैसे कि 2डीप्लेन8,9,10में गैर-अल्सर पर अल्सर का अनुपात। यह एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड की दक्षता, स्थिरता, या रूपात्मक और शारीरिक लक्षण वर्णन के मामले में विभिन्न अध्ययनों के बीच किसी भी तुलना को रोकता है।

माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करके मोतियों में एपिथेलियल कोशिकाओं के माइक्रोएन्सेपुलेशन ने अधिक यथार्थवादी मात्रात्मक और तुलनात्मक परिणामों के लिए अनुमति दी है। इस तकनीक का उपयोग करते हुए, विभिन्न कोशिका प्रकारों के ऑर्गेनॉइड विभिन्न 3डी सेलुलर संरचनाओं11, 12के बीच आकृति विज्ञान के आधार पर बनाए गए और विभेदितकिएगए। हालांकि, इस तकनीक के साथ काम करना आसान नहीं है और माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उत्पादन करने के लिए स्वच्छ कमरों के उपयोग की आवश्यकता होती है। इस तकनीक को कुछ प्रकार के हाइड्रोगेल के लिए स्थापित किया गया है लेकिन इसकी बहुमुखी प्रतिभा को सीमित करते हुए अन्य हाइड्रोगेल पर लागू करने के लिए तकनीकी अनुकूलन की आवश्यकता होती है। इसलिए, एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड विकसित करने के उद्देश्य से अधिकांश अध्ययन हाइड्रोजेल बल्क में एपिथेलियल कोशिकाओं के एम्बेडिंग पर भरोसा करते हैं। इन तरीकों में, पूरी 3 डी संस्कृति के अंदर जेल संरचना और सेल वितरण की उच्च विषमता अक्सर उपेक्षित होती है। इसलिए, अधिकांश विश्लेषण एकल 2D छवियों से संबंधित हैं, जो पूरे 3 डी वॉल्यूम में विभिन्न सेलुलर वस्तुओं के वितरण का प्रतिनिधित्व करते हैं।

पित्त नलिकाओं को प्रभावित करने वाली बीमारियां, जैसे कोलंगियोकार्सिनोमा, पित्त अट्रेसिया, प्राइमरी स्क्लेरोसिंग कोलैंगाइटिस, अन्य लोगों के अलावा, मृत्यु दर और रुग्णता का एक प्रमुख कारण हैं। जिगर प्रत्यारोपण के अलावा, इन शर्तों के लिए कोई प्रभावी उपचार कर रहे हैं13. पित्त वाहिनी गठन, रोग के कारणों की जांच करने के प्रयास, और प्रगति उपन्यास चिकित्सा के विकास की अनुमतिदेगा 14।

सामान्य या रोगी-व्युत्पन्न, विभेदित, या जनक-व्युत्पन्न कोलंगियोसाइट सेल लाइनों का उपयोग करके अल्सर, स्फेरॉइड या ट्यूब जैसी संरचनाओं के पित्त ऑर्गेनोटीपिक मॉडल15,16, 17,18,19,20विकसित किए गए हैं। विभिन्न अध्ययनों ने चोलंगियोसाइट ध्रुवीयता, कोलंगियोसाइट मार्कर की अभिव्यक्ति, सिलिया की उपस्थिति, कोलंगियोसाइटे स्रावित और पुनर्अभ्यात्मक क्षमता, और ल्यूमेन गठन और बाधा को फिर से बदल दिया है; जिनमें से सभी कोलंगियोसाइट फेनोटाइप, आकृति विज्ञान, और फ़ंक्शन15 , 17,19की महत्वपूर्ण विशेषताओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। अन्य लोगों ने20समय की लंबी अवधि के लिए रोगी-व्युत्पन्न पित्त ऑर्गेनॉइड के रखरखाव की सूचना दी है । हाल ही में, हमने पित्त अल्सर ऑर्गेनोजेनेसिस21पर जैव रासायनिक और जैव भौतिक संकेतों की भूमिका की जांच की। महत्वपूर्ण बात यह है कि पित्त अट्रेसिया के रोगजनन का अध्ययन पित्त स्फेरॉइड और ट्यूब7,22में किया गया था। इसके अलावा, प्राथमिक स्क्लेरोसिंग कोलंगाइटिस जैसे कोलांगियोसाइट सेनेसेंस, प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स का स्राव, साथ ही मैक्रोफेज भर्ती की प्रमुख विशेषताओं का सफलतापूर्वक अध्ययन किया गया, जो पित्त स्फेरॉइड15,20का उपयोग करके किया गया था। हालांकि, विट्रो 3 डी मात्रात्मक मॉडल में प्रजनन योग्य है जो शारीरिक रूप से कोलंगियोसाइट फेनोटाइप, फिजियोलॉजी और माइक्रोएनवायरमेंट को संशोधित करता है जहां इन प्रश्नों को संबोधित किया जा सकता है, अभी भी आवश्यक हैं। इसके अलावा, केवल कुछ प्रकाशनों ने पुटी निर्माण दक्षता21,23की सूचना दी है । यह स्थापित करने के लिए एक महत्वपूर्ण बिंदु है, विशेष रूप से जब ऑर्गेनोजेनेसिस, रोग के कारण की जांच, और cholangiocyte समारोह और ध्रुवीकरण के साथ दवा प्रतिक्रियाओं के सहसंबंध । इसके अलावा, पाड़/मैट्रिक्स में अंतर के साथ प्रोटोकॉल से प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया, यह सिस्टम के बीच तुलना करने के लिए मुश्किल है । इन मुद्दों को हल करने के लिए, हम ल्यूमेन गठन, कोलंगियोसाइट ध्रुवीकरण, और चोलंगियोसाइट गुप्त कार्य की नकल करने वाले पित्त अल्सर उत्पन्न करने के लिए एक मात्रात्मक, विश्वसनीय और सार्वभौमिक विधि का प्रस्ताव करते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि हम समय के साथ मूल्यांकन करते समय 3डी जेल में जेड-एक्सिस के साथ किए गए एक व्यवस्थित विश्लेषण पेश करते हैं, पुटी गठन दक्षता, आकार, व्यवहार्यता, ध्रुवीकरण और कार्यक्षमता। इसके अलावा, हमने प्रोटोकॉल के लिए एक उदाहरण के रूप में एक प्राकृतिक हाइड्रोजेल और सामान्य चूहा कोलंगियोसाइट्स (एनआरसी) एस का उपयोग किया, लेकिन अन्य प्राकृतिक या सिंथेटिक हाइड्रोगेल, साथ ही एपिथेलियल कोशिकाओं का उपयोग 3 डी सिस्टिक संरचनाओं के गठन के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

1. अल्सर की पीढ़ी

नोट: यह प्रोटोकॉल किसी भी प्रकार के हाइड्रोगेल के साथ किया जा सकता है, यदि जेलेशन कोशिकाओं को एम्बेड करने की अनुमति देता है।

  1. हाइड्रोजेल कोटिंग
    नोट: कक्ष स्लाइड की उचित हाइड्रोगेल कोटिंग कुएं के तल पर 2D सेल परतों के गठन से बचने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है, जो बाद में पुटी इमेजिंग में हस्तक्षेप कर सकता है और पुटी गठन दक्षता की गणना को ख़राब कर सकता है।
    1. जेल समाधान की एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस (O/N) पर हाइड्रोगेल गल।
    2. बर्फ या O/N पर-20 डिग्री सेल्सियस और एक 8-अच्छी तरह से चैंबर स्लाइड पर-20 डिग्री सेल्सियस O/N पर प्रीकूल पिपेट टिप्स ।
    3. बर्फ से भरी एक बर्फ बाल्टी पर हाइड्रोगेल और 8-वेल चैंबर स्लाइड रखें।
    4. 15 एमएल शंकु नली में, ठंडे एनआरसी पूर्ण माध्यम (सामग्री की तालिकादेखें) में 40% हाइड्रोगेल (V/V) युक्त समाधान तैयार करें और ट्यूब को बर्फ पर रखें।
    5. एक चैंबर स्लाइड कोट करने के लिए, ठंडे पिपेट युक्तियों का उपयोग करके, प्रत्येक कुएं के केंद्र पर हाइड्रोजेल समाधान के 50 माइक्रोन जोड़ें, और बर्फ पर चैंबर स्लाइड पकड़े हुए एक पिपेट टिप का उपयोग करके पूरी सतह पर फैलगए (चित्रा 1A)।
      नोट: बुलबुले से बचने के लिए हाइड्रोगेल समाधान को समान रूप से फैलाएं।
    6. हाइड्रोजेल को बहुलक बनाने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर कम से कम 15 मिनट के लिए चैंबर स्लाइड को इनक्यूबेट करें।
  2. सेल की तैयारी
    1. एनआरसी पूर्ण माध्यम, फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), और ट्राइप्सिन-एथिलेंडियामाइन टेट्राएसेटिक एसिड (ट्राइपसिन-ईडीटीए) को पानी के स्नान में पूर्व-गर्म 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    2. जबकि हाइड्रोगेल बहुलक है, यह सुनिश्चित करें कि एनआरसी को टी-25 सेमी 2 कोलेजन-लेपित फ्लास्क21 में 70% तक बढ़ायाजाए। कोशिकाओं को एक बार प्री-गर्म 1x पीबीएस के साथ धोएं।
    3. पूर्व गर्म 1x पीबीएस के 5 मिलीएल के साथ एनआरसी को इनक्यूबेट करें (टी-25 सेमी2 फ्लास्क के लिए) 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2।
      नोट: यह कदम है, जो ट्रिप्पसिन-EDTA के साथ इनक्यूबेशन समय छोटा कोशिकाओं के स्वयं के आयोजन गुणों को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है ।
    4. पीबीएस को त्यागें, ट्राइप्सिन-ईडीटीए के 1 एमसीएल जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. पूर्व गर्म पूर्ण एनआरसी माध्यम के 4 एमएल के साथ बेअसर। सेल निलंबन को 15 एमएल शंकु नली में ले लीजिए और स्थानांतरित करें, और 4 मिनट के लिए 150 x ग्राम पर स्पिन करें।
    6. मीडियम को डिस्कार्ड करें और सेल पेलेट को प्री-गर्म मीडियम के 5 एमएल में रीसस्पेंड करें।
    7. 40 माइक्रोन सेल छन्नी का उपयोग करके, सेल समाधान को 50 एमएल शंकु नली में फ़िल्टर करें और कोशिकाओं की गिनती करें।
      नोट: एक छलनी के माध्यम से कोशिकाओं को पारित करने के लिए मात्रात्मक परिणाम प्रजनन योग्य होने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है यानी, सेल समुच्चय के लगभग समान आकार पाने के लिए एंबेडेड हो ।
  3. हाइड्रोगेल समाधान में सेल निलंबन का एम्बेडिंग
    1. कोल्ड कंप्लीट एनआरसी मीडियम (ट्यूब 1) में 80% हाइड्रोजेल (V/V) के 1,600 माइक्रोन का समाधान तैयार करें; बर्फ में रखें। पतला 5 x10 5 कोशिकाओं/एमएल में 1,600 माइक्रोन में ठंडा पूरा एनआरसी माध्यम (ट्यूब 2) और बर्फ में रखें।
      नोट: यह कदम जल्दी से किया जाना चाहिए हाइड्रोगेल के बहुलीकरण से बचने के लिए, जबकि यह सेल निलंबन के साथ मिश्रण और सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए ।
    2. 40% हाइड्रोजेल (वी/वी), मिक्स ट्यूब 1 और ट्यूब 2 में2.5 x 10 5 कोशिकाओं/एमएल का सेल सीडिंग समाधान तैयार करना। बुलबुले(चित्रा 1B)से परहेज हाइड्रोगेल-लेपित चैंबर स्लाइड के प्रत्येक कुएं में सेल समाधान के 400 μL जोड़ें।
    3. मीडिया बदलने तक 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में चैंबर स्लाइड रखें।
    4. संस्कृति में 2 दिनों के बाद, प्रत्येक कुएं के एक कोने से माध्यम के 250 माइक्रोन निकालें, हाइड्रोगेल को पिपेट न करने के लिए सावधान रहें। फिर, धीरे-धीरे संस्कृति माध्यम के 250 माइक्रोन जोड़ें। हर 2 दिन में माध्यम बदलें।
      नोट: विशेष रूप से पुटी दीक्षा के दौरान, कक्ष स्लाइड के आंदोलन को कम करें।

2. सिस्ट क्वांटिफिकेशन

  1. सिस्ट इमेजिंग
    नोट: इस खंड को जल्दी से किया जाना चाहिए ताकि सेल व्यवहार्यता से समझौता न किया जा सके यदि माइक्रोस्कोप सीओ 2 और तापमान कोनियंत्रित करने के लिए हीटिंग चैंबर से लैस नहीं है। लगातार मात्रा सुनिश्चित करने के लिए, पूर्ण हाइड्रोजेल वॉल्यूम में पुटी वितरण के प्रतिनिधि, अल्सर को चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी और सीरियल इमेजिंग (जेड-स्टैक) के माध्यम से चित्रित किया जाता है, जिसमें विभिन्न समय बिंदुओं में पूर्व-परिभाषित पैरामीटर होते हैं।
    1. हर बार बिंदु(चित्रा 1सी, डी)के लिए हाइड्रोगेल की गहराई के साथ एक जेड-स्टैक लें। इस उदाहरण में, जेड-स्टैक 1, 2, 4, 7 और 10 दिनों में लिए जाते हैं।
      नोट: इस विधि की प्रयोज्यता सुनिश्चित करने के लिए हाइड्रोगेल में प्रारंभिक सेल वितरण एक समान है या नहीं, इसकी जांच करें।
      1. एक छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर से लैस चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप के साथ, मैनुअल नाक-पीस पैड विंडो(चित्रा 2बी (1)में 10x उद्देश्य आवर्धन का चयन करें।
      2. सफेद दीपक पर स्विच करें और ब्राइटफील्ड इमेजिंग विकल्प का चयन करें।
      3. बार सबमेन्यू में'प्ले'बटन का चयन कर कैमरा स्विच ऑन करें। अल्सर के एक क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करें और एक्सपोजर समय(चित्रा 2बी (2) सेटकरें। छवियों की स्वचालित बचत के लिए ऑटो कैप्चर फ़ोल्डर विंडोखोलें (चित्रा 2बी (3))।
      4. कैप्चर जेड-सीरीज विंडो खोलें और जेड-स्टैक (एक ही XY निर्देशांक लेकिन विभिन्न जेड जांच) के ऊपर और नीचे के विमानों को जेड स्क्रू के साथ परिभाषित करें। उद्देश्य के आधार पर जेड-स्टेप को समायोजित करें, संकल्प का स्तर और अधिग्रहण(चित्रा 2बी (4)लॉन्च करने के लिए"अब भागो"बटन दबाएं।
        नोट: इस उदाहरण में, अल्सर 520 माइक्रोन की हाइड्रोगेल मोटाई पर फैले हुए हैं। 26 छवियां हाइड्रोगेल गहराई के साथ 20 माइक्रोन जेड-चरण अंतराल के साथ प्राप्त की जाती हैं। उद्देश्य के आधार पर, जेड-चरण को किसी भी पुटी को याद नहीं करने और एकल कोशिकाओं और समुच्चय का पता लगाने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए।
      5. प्रति अच्छी तरह से कम से कम 3 गैर-ओवरलैपिंग जेड-स्टैक लें।
        नोट: यह नमूना आवश्यक है जब, इस उदाहरण की तरह, हाइड्रोगेल बहुलीकरण में विषमताओं के कारण किनारों की तुलना में जेल की गहराई में अल्सर अधिक असंख्य हैं।
      6. एक प्रतिनिधि डेटासेट दोहराने चरण 2.1.1.5 है। कुल में 3 कुओं के लिए ।
        नोट: अल्सर का विषम वितरण हाइड्रोजेल के प्रकार, इसके बहुलीकरण और सेल लाइन पर निर्भर करता है। अच्छी तरह से प्रति तीन जेड-स्टैक और प्रति प्रयोग तीन कुओं को ध्यान में रखते हुए, प्रत्येक समय बिंदु पर पुटी गठन और पुटी वृद्धि की विशेषता के लिए न्यूनतम 200 अल्सर नौ जेड-स्टैक पर चित्रित किए जाते हैं।
  2. इमेज प्रोसेसिंग
    नोट: हाइड्रोगेल में, एनआरसी एकल कोशिकाओं, अल्सर या समुच्चय के रूप में पाया जा सकता है। अल्सर की पहचान एक लुमेन को संलग्न करने वाले गोल और पतले विपरीत कोशिका खोल की उपस्थिति से की जाती है, जबकि कोशिका एक अनियमित आकार प्रस्तुत करती है और इसमें ल्यूमेन नहीं होता है। समुच्चय और एकल कोशिकाओं में एक घना और विपरीत उपस्थिति होती है(चित्र 3बी (4)।
    1. फिजी सॉफ्टवेयर खोलें, जेड-स्टैक खोलें और फिजी मेनू में जाएं और फाइल पर क्लिक करें । ओपन (अनुपूरक चित्रा 1)। विश्लेषण करने के लिए जेड-स्टैक का चयन करें। जरूरत पड़ने पर'वर्चुअल स्टैक'ऑप्शन चुनें और ओपनिंग के लिए'हां'पर क्लिक करें(चित्रा 3ए(1))।
    2. छवि के माध्यम से ढेर डुप्लिकेट । डुप्लीकेट। बॉक्स पर क्लिक करें'डुप्लीकेट स्टैक'और क्लिक करें'ओके'(सप्लीमेंट्री फिगर 2)।
      नोट: इस उदाहरण में, Z-स्टैक .nd2 फ़ाइल प्रारूप में 16 बिट्स में एन्कोड किए गए हैं।
    3. डुप्लिकेट स्टैक से न्यूनतम तीव्रता का प्रक्षेपण बनाएं। छवि मेनू पर जाएं । ढेर । जेड परियोजना। प्रोजेक्शन टाइप'मिन रौशनी'का चयन करें और क्लिक करें'ओके'(चित्रा 3ए (2)(अनुपूरक चित्रा 3)।
    4. प्रक्षेपण से पृष्ठभूमि घटाना। प्रक्रिया मेनू पर जाएं । घटाना पृष्ठभूमि। रोलिंग बॉल त्रिज्या के 500.0 पिक्सल टाइप करें और बैकग्राउंड(चित्रा 3ए (3)(सप्लीमेंट्री फिगर 4)के विपरीत अल्सर को प्रस्तुत करने के लिए"लाइट बैकग्राउंड"पर क्लिक करें।
      नोट: रोलिंग बॉल त्रिज्या उस क्षेत्र के आकार को परिभाषित करती है जिस पर पृष्ठभूमि घटाव संचालित होती है। इस पैरामीटर की पहचान करने के लिए सबसे बड़ी वस्तु के आकार के लिए सेट किया जाना चाहिए ।
    5. यदि कंट्रास्ट बढ़ाने की जरूरत है, तो इमेज मेनू पर जाएं । समायोजित करें । चमक/इसके विपरीत । ऑटो । आवेदन करें। फिजी स्वचालित रूप से चमक और इसके विपरीत अनुकूलित करेगा। (चित्रा 3ए (3)में, निचले और ऊपरी ग्रे मूल्यों को क्रमशः 49702 और 65452(अनुपूरक चित्रा 5)के लिए निर्धारित किया गया था।
      नोट: यदि प्रक्षेपण अंशांकित नहीं है, तो विश्लेषण मेनू पर जाएं । स्केल सेट करें और संबंधित अंशांकन माइक्रोन/पिक्सेल अनुपात(अनुपूरक चित्रा 6)टाइप करें।
  3. पुटी गिनती और पुटी आकार माप
    1. अनुमानित पुटी व्यास को मापने के लिए, फिजी मेनू में सीधी-रेखा उपकरण का चयन करें और अंतिम प्रक्षेपण(चित्र 3बी(4)पर प्रत्येक पुटी के व्यास के पार एक रेखा बनाएं। आरओआई प्रबंधक को प्रत्येक पुटी के लिए बनाए गए ब्याज के नए क्षेत्र (आरओआई) को जोड़ें: आरओआई प्रबंधक की तेजी से गिनती और उद्घाटन के लिए कीबोर्ड पर"टी"शॉर्टकट दबाें। क्लिक करें 'सभीको दिखाओ' गिना अल्सर देखने के लिए(अनुपूरक चित्रा 7)
    2. जांच करें कि जेड-स्टैक पर प्रक्षेपण से सेट आरओआई को अधिरोपित करके कोई पुटी गिनती के बिना नहीं छोड़ा गया है। ऐसा करने के लिए, इसे चुनने के लिए जेड-स्टैक विंडो पर क्लिक करें। आरओआई मैनेजर में, क्लिक करें'सभी दिखाओ'और प्रति छवि की उस छवि की जांच करने के लिए जेड-स्टैक के साथ कर्सर को स्थानांतरित करें, सभी अल्सर(अनुपूरक चित्रा 8)गिना गया है।
    3. एक बार नए अल्सर की गिनती हो जाने के बाद और आरओआई को चरण 2.3.1 पर जोड़ा गया है, तो आरओआई सेट का चयन करें और इसे अधिक क्लिक करके आरओआई प्रबंधक विंडो के माध्यम से सहेजें। सेव (सप्लीमेंट्री फिगर 9)।
    4. आरओआई मैनेजर में सभी आरओआई का चयन करें और प्रत्येक पुटी का आकार प्राप्त करने के लिए आरओआई प्रबंधक में"उपाय"पर क्लिक करें। इससे प्रत्येक पुटी और उसके अनुमानित आकार की संख्या में'परिणाम'नाम के माप की एक नई खिड़की खुलेगी। फिर .csv प्रारूप में"परिणाम"खिड़की पर क्लिक करके और मेनू के माध्यम से सहेजें: फ़ाइल । सेव आसॅ् म(सप्लीमेंट्री फिगर 10)।
      नोट: एक मैक्रो अर्द्ध स्वचालित रूप से प्रक्रिया ढेर करने के लिए बनाया जा सकता है, अनुमानों से पुटी संख्या/आकार का अनुमान है, और तेजी से गिनती प्रक्रिया के लिए डेटा स्टोर । ऐसा करने के लिए, प्लगइन्स पर क्लिक करके, बार मेनू में टूल"रिकॉर्ड"का चयन करें। मैक्रोन । रिकॉर्ड।
  4. पुटी गठन दक्षता का मात्राकरण
    1. Equation 1एक प्रक्षेपण (वाई = 1, 2, 4, 7 या 10) पर, दिन वाई पर अल्सर की संख्या गिनें।
    2. वाई दिन में 1000 कोशिकाओं के लिए पुटी गठन दक्षता की गणना करने के लिए, उस समय बिंदु पर गणना की गई अल्सर की संख्या को हाइड्रोजेल मात्रा से अनुमानित दिन में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या से विभाजित करें और 1000(चित्रा 3C, चित्रा 4)से गुणा करें।
      Equation 2

3. सेल व्यवहार्यता

  1. 1 एमएल एसीटोन में 5 मिलीग्राम एफडीए को भंग करके 5 मिलीग्राम/एमएल पर फ्लोरोसिन डायसेटेट (एफडीए) का स्टॉक घोल तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. डिओनाइज्ड वॉटर (डीएच 2 ओ) में 2 मिलीग्राम/एमएल की सांद्रता पर प्रोपिडियम आयोडाइड(पीआई)का स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
  3. भ्रूण बछड़े सीरम (एफसीएस) के बिना एनआरसी माध्यम तैयार करें।
  4. एफडीए/पीआई धुंधला समाधान तैयार करने के लिए, एफसीएस के बिना एनआरसी माध्यम के 2.5 एमएल में एफडीए स्टॉक सॉल्यूशन (8 μg/mL अंतिम एकाग्रता) और पीआई स्टॉक समाधान (20 माइक्रोन/एमएल अंतिम एकाग्रता) के 4 माइक्रोन जोड़ें।
  5. कक्ष स्लाइड से माध्यम निकालें, प्रत्येक कुएं में धुंधला समाधान के 250 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर अंधेरे में 4-5 मिनट इनक्यूबेट। धुंधला समाधान ध्यान से बाहर पिपेट और 1x PBS के 250 माइक्रोन के साथ एक बार धोने।
  6. ध्यान से प्रत्येक अच्छी तरह से पूरा एनआरसी माध्यम के 250 μL जोड़ें और टेक्सास लाल और फ्लोरोसाइनिन आइसोथियोसायनेट (फिटसी) फिल्टर के साथ एक उल्टे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग कर चित्र ले लो। लाइव कोशिकाएं हरी होंगी और मृत कोशिकाएं लालहोंगी (चित्रा 5A)।
    नोट: लाइव/मृत कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए, चरण 2 के बाद हाइड्रोगेल वॉल्यूम में जेड-स्टैक लें और फ्लोरेसेंस के लिए इमेज प्रोसेसिंग विधि को अनुकूलित करें।

4. स्राव गतिविधि

नोट: कोलांगियोसाइट्स की एपिकल झिल्ली के माध्यम से स्राव गतिविधि का आकलन लुमेन में फ्लोरोसेइन के स्राव से किया जाता है। इसकी विशिष्टता का मूल्यांकन वेरापमिल, एक बहु-दवा प्रतिरोधी (एमडीआर) ट्रांसपोर्टर अवरोधक24के साथ एक ही परीक्षण करके किया जा सकता है ।

  1. 5 माइक्रोग्राम/एमएल पर Hoechst 33258 का धुंधला समाधान तैयार करने के लिए, एफसीएस के बिना एनआरसी माध्यम के 2.5 एमएल में 0.83 माइक्रोन ऑफ होचस्ट स्टॉक सॉल्यूशन (डीएच2ओ में 15 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक एकाग्रता) जोड़ें।
  2. प्रत्येक कुएं में 250 μL Hoechst समाधान जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 15 मिनट के लिए 5% सीओ2।
  3. Hoechst समाधान निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से एफडीए समाधान (8 μg/mL अंतिम एकाग्रता) के 250 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 4-5 मिनट इनक्यूबेट, 5% सीओ2।
    नोट: जैसे ही कोशिकाओं को एफडीए धुंधला समाधान के संपर्क में हैं, फ्लोरोसिन स्राव गतिज का पालन करने के लिए अल्सर के लिए आवश्यक समय को जांचना उपयोगी हो सकता है स्राव । ऐसा करने के लिए, समय-चूक इमेजिंग के माध्यम से 1 घंटे के लिए हर मिनट तस्वीरें लें। इस उदाहरण में, हाइड्रोगेल में एनआरसी स्राव अल्सर का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक समय लगभग 15-20 मिनट है।
  4. एफसीएस के बिना माध्यम के साथ रिंसिंग के बाद एक उल्टे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप 5 मिनट का उपयोग करके छवियां लें। ल्यूमेन(चित्रा6 ए) में नाभिक लेबलिंग और फ्लोरोसेसिन संचय को प्रकट करने के लिए 4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडोल (डीएपीआई) और फिटसी फिल्टर का उपयोग करें। स्रावित अल्सर की संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए, चरण 2 में जेड-स्टैक लें और छवियों को फ्लोरोसेंट छवियों के लिए छवि प्रसंस्करण चरणों को अनुकूलित करें।
    नोट: वेरापमिल परीक्षण के लिए, निम्नलिखित शर्तों के अनुसार, वेरापामिल के साथ एक इनक्यूबेशन द्वारा पिछली प्रक्रिया (चरण 4.3. से 4.4.) से पहले:
  5. डिमेथिल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में 10 एमएम वेरामिल का स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें। 10 माइक्रोन वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करने के लिए, एफसीएस के बिना 2.5 एमएल कल्चर मीडियम के साथ वेरापामिल स्टॉक सॉल्यूशन का 2.5 माइक्रोन मिलाएं।
  6. यह आकलन करने के लिए कि एमडीआर स्राव से ल्यूमेन परिणामों में फ्लोरेसेंस, एक और स्लाइड लें और प्रत्येक कुएं में वेरापामिल वर्किंग सॉल्यूशन के 250 माइक्रोन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट, 5% सीओ2
  7. समाधान निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से एफडीए समाधान (8 μg/mL अंतिम एकाग्रता) के 250 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर अंधेरे में 4-5 मिनट इनक्यूबेट । फिर, इमेजिंग(चित्रा 6बी, सी) से पहले 1x पीबीएस के 250 माइक्रोलसे धोएं।

5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा एपिथेलियल ध्रुवीयता मूल्यांकन

  1. फिक्सिंग समाधान तैयार करने के लिए, 1x पीबीएस, पीएच 7.4 में 5% सुक्रोज के साथ 4% फॉर्मलडिहाइड मिलाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में पूर्व-गर्म करें।
  2. कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, धीरे-धीरे मैट्रिक्स को नुकसान पहुंचाए बिना अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम को बाहर निकालें। धीरे-धीरे कुओं के किनारे फिक्सिंग समाधान के 400 μL जोड़ें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: इसके नुकसान को रोकने के लिए मैट्रिक्स के ऊपर तरल के 25 माइक्रोन हमेशा छोड़ दें।
  3. धीरे-धीरे फिक्सिंग समाधान को हटा दें और (आरटी) पर 1x पीबीएस के 400 माइक्रोन के साथ 3x धोएं।
  4. पीबीएस को पिपेट करें, 1x पीबीएस में 400 माइक्रोन परमेबिलाइजेशन समाधान (0.5% ट्राइटन एक्स-100) जोड़ें और आरटी में 10 मिनट को इनक्यूबेट करें।
  5. धीरे-धीरे पारमेबिलाइजेशन समाधान को हटा दें, इसके बाद 1x पीबीएस के 400 माइक्रोन के साथ 3 त्वरित वॉश और आरटी में 30 मिनट का एक लंबा धोने का कदम।
    नोट: इस चरण में, स्लाइड को 2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। इस मामले में, वाष्पीकरण और मैट्रिक्स सुखाने को रोकने के लिए एक पैराफिन फिल्म के साथ स्लाइड सील करें।
  6. पीबीएस निकालें, 0.1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और 1x पीबीएस में 10% बकरी सीरम युक्त अवरुद्ध समाधान के 400 माइक्रोन जोड़ें और आरटी में 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    सावधानी: 0.1% से अधिक बीएसए की सांद्रता के परिणामस्वरूप ल्यूमेन रिऐक्शन और आगे पुटी पतन (प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें)(चित्रा 7 ए)होगा।
  7. अवरुद्ध समाधान को बाहर निकालें और पीबीएस/0.05% ट्वीन 20 के 400 माइक्रोन के साथ एक बार धोएं और त्यागें।
  8. 1x पीबीएस में एंटीबॉडी समाधान के 150 माइक्रोन जोड़ें, उदाहरण के लिए, ई-कैडेरिन एंटीबॉडी पतला 1:400 और फालोडिन 568 (16.2 एनएम अंतिम एकाग्रता) 1x पीबीएस में और आरटी में 90 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: ई-कैडेरिन का यह कमजोर पड़ने का उपयोग मानक 2डी इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के समान है।
  9. पीबीएस/0.05% ट्वीन 20, 3x के 400 माइक्रोन के साथ नमूना धोएं; हर बार आरटी में 10 मिनट के लिए नमूना इनक्यूबेटिंग ।
  10. माध्यमिक एंटीबॉडी के 150 माइक्रोन जोड़ें (बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी एलेक्सा फ्लोर प्लस 647), 1x पीबीएस में 1:500 पतला और आरटी में 60 मिनट इनक्यूबेट।
  11. पीबीएस/0.05% ट्वीन 20 के 400 माइक्रोन के साथ 3x धोएं, हर बार आरटी में 10 मिनट के लिए नमूना इनक्यूबेटिंग।
  12. 1x पीबीएस के 400 माइक्रोन के साथ 3x धोएं, हर बार आरटी में 10 मिनट के लिए नमूना इनक्यूबेटिंग।
  13. पिछले धोने के PBS त्यागें और नीचे दिए गए दो विकल्पों में से एक के बाद कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से दृश्य के लिए चैंबर स्लाइड तैयार करते हैं ।
    1. 1x पीबीएस के 400 माइक्रोन और प्रति अच्छी तरह से DAPI के 50 माइक्रोन जोड़ें। नमूनों की जांच कुएं के नीचे से की जा सकती है, बिना कवरस्लिप(चित्रा 7B)के साथ बढ़ते की आवश्यकता के बिना।
    2. DAPI युक्त एंटीफैड रिएजेंट के प्रति अच्छी तरह से 100 μL जोड़ें और स्लाइड को आरटी पर O/N सुखाने दें।

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Representative Results

अल्सर का गठन और लक्षण वर्णन
3डी सेल कल्चर सिस्टम ऑर्गेनोजेनेसिस और डिजीज मॉडलिंग25का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं । दुर्भाग्य से, इनमें से अधिकांश विधियां गुणात्मक हैं या एक ही विमान पर किए गए आंतरिक मात्राकरण का उपयोग करते हैं, जो कि विभिन्न अध्ययनों7,8,9,10,15,18,23के बीच पुटी गठन दक्षता के संदर्भ में किसी भी तुलना को रोकते हैं, जो अल्सर बनाम गैर-अल्सर की संख्या की तुलना करके किया जाता है। प्रयोग के समय अल्सर और उनके संबंधित आकारों की पूरी संख्या रिकॉर्ड करके, इस प्रोटोकॉल में प्रस्तावित विधि, पुटी गठन और विकास(चित्रा 4)के विकास के विश्लेषण के लिए अनुमति देती है।

चरण विपरीत छवियों के आधार पर, 0 दिन, 8 घंटे के बाद सेल सीडिंग ज्यादातर छोटे सेल समुच्चय हाइड्रोगेल में एम्बेडेड पाए जाते हैं । 1 दिन, 42.95 (26.53, 50.47) (पहले, तीसरे चतुर्थक) के औसत व्यास के छोटे अल्सर और हाइड्रोगेल में बिखरे हुए अल्सर के संलयन ध्यान देने योग्य हैं। 4 दिन तक, कुल संरचनाओं के साथ-साथ 75 (56.48, 97.97) माइक्रोन के औसत व्यास के अल्सर का निरीक्षण करना आम है। 7 और 10 दिनों तक औसत पुटी व्यास क्रमशः 108.67 (75.31, 141.76) माइक्रोन और 186.46 (113.98, 278.29) माइक्रोन तक पहुंच गया। दिलचस्प बात यह है कि पुटी गठन दक्षता 70.03 से बढ़ जाती है ± 5.05 अल्सर ±/ /1000 कोशिकाओं पर 4 दिन तक स्थिर शेष 10(चित्रा 4B),सुझाव है कि अल्सर सेल समुच्चय है कि एम्बेडिंग या अगले 48h के दौरान फार्म के समय में मौजूद है से अनिवार्य रूप से फार्म, सेल माइग्रेशन या छोटे सेल के संलयन के माध्यम से। पुटी आकार विकास के संबंध में, जबकि मतलब आकार एक धीमी और नियमित ढलान का पालन करता है, आकार वितरण संस्कृति के समय के साथ व्यापक रूप से बढ़ता है, यह दर्शाता है कि विभिन्न अल्सर एक ही गति से नहीं बढ़ते हैं। दिलचस्प बात यह है कि इसे हमारे अवलोकन (नहीं दिखाए गए) से जोड़ा जा सकता है कि हाइड्रोगेल में अल्सर समान रूप से वितरित नहीं किए जाते हैं, हाइड्रोगेल वॉल्यूम के केंद्र में झूठ बोलने वाले सबसे बड़े अल्सर। चूंकि पुटी व्यास की वृद्धि मुख्य रूप से स्राव गतिविधि पर निर्भर करती है (चूंकि सेल डिवीजन दर एनआरसी व्युत्पन्न अल्सर में सीमित है), इसलिए यह अनुमानित किया जा सकता है कि यह गतिविधि हाइड्रोगेल गुणों पर अत्यधिक निर्भर है जो सेल संस्कृति की मात्रा में समरूप नहीं हैं।

हम तो उन्हें हाइड्रोगेल (दिन 0) और अल्सर में 10 दिन एफडीए/PI लाइव धुंधला(चित्रा 5A)का उपयोग कर में एम्बेड करने के बाद कोशिकाओं की व्यवहार्यता की पुष्टि की । एफडीए एक गैर-फ्लोरोसेंट अणु है जो केवल जीवित कोशिकाओं, एक एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया के माध्यम से, हरे फ्लोरोसेंट यौगिक फ्लोरोसेसिन26में परिवर्तित करने में सक्षम हैं। पीआई जीवित कोशिकाओं के लिए एक गैर-पारगम्य अणु है जो परिगलित कोशिकाओं के डीएनए में इंटरकैलिट करता है27. दिलचस्प बात यह है कि मृत कोशिकाएं जो 10 दिन में संस्कृति की मात्रा में पूरी कोशिकाओं के 3% से कम का प्रतिनिधित्व करती हैं, ज्यादातर अल्सर के बाहर पाई जाती हैं, अलग कोशिकाओं या छोटे समुच्चय के हिस्से के रूप में। हालांकि, हमने देखा कि परिगलित कोशिकाओं से मलबा 10 दिन(चित्रा 5B)में कुछ बड़े अल्सर में जमा होता है। इसलिए, सिस्टिक संस्कृतियों के रखरखाव के लिए, उन स्थितियों में 10 दिनों से पहले अल्सर के पास बढ़ने की सिफारिश की जाती है।

कार्यात्मक मूल्यांकन
शारीरिक परिस्थितियों में, कोलंगियोसाइट्स का मुख्य कार्य अवशोषण और गुप्त तंत्र के माध्यम से कैनलिकुलर पित्त को संशोधित करना है जिसमें से एमडीआर चैनल एक प्रमुख खिलाड़ी28है। अल्सर की कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए, हमने एफडीए/होचस्ट के साथ दिन 10 अल्सर को इनक्यूबेटेड किया और फ्लोरोसिन के गठन और बेसल से इसके स्राव को एपिकल ल्यूमिनल स्पेस(चित्रा 6ए, बी)में देखा । इस प्रकार, पुष्टि है कि अल्सर में एनआरसी अपने गुप्त कार्यों को बनाए रखते हैं। इसके अलावा, फ्लोरोसेइन का स्राव एमडीआर अवरोधक वेरापमिल(चित्रा 6 सी)के साथ अल्सर के पूर्व-उपचार से बाधित था, यह दिखाता है कि ल्यूमेन में फ्लोरेसेंस एफडीए का संचय एमडीआर ट्रांसपोर्टर के माध्यम से स्राव के कारण था न कि अंतरकोशिकीय अंतरिक्ष से लीक होने से।

पुटी ध्रुवता का आकलन
एनआरसी अल्सर के ध्रुवीकरण को स्थापित करने के लिए, हमने इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल में अनुकूलन चरणों की एक श्रृंखला आयोजित की। अल्सर में एपिथेलियल सेल ध्रुवता की परीक्षा में एक मुख्य बाधा ल्यूमेन में निहित तरल पदार्थ के रिसाव के कारण इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रक्रिया के दौरान ऑर्गेनॉइड वास्तुकला का लगातार पतन है। इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण का मूल्यांकन परीक्षण करके किया गया है कि विभिन्न स्थितियां पुटी संरचना के रखरखाव को कैसे प्रभावित कर सकती हैं। हमने पाया कि फिक्सिंग (फॉर्मलडिहाइड (फॉर्मलडिहाइड (2-4%) + सुक्रोज (5-10%)) या पारमेबिलाइजेशन स्थितियां (ट्राइटन एक्स-100 और सुक्रोज दोनों का 0.1-1%) सिस्ट आर्किटेक्चर पर ज्यादा प्रभाव नहीं पड़ा। इन श्रेणियों का उपयोग चोलंगियोसाइट्स(चित्रा 7 ए)को दृढ़ता से ठीक करने और धीरे-धीरे करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, हमने देखा कि संतृप्ति के दौरान बीएसए को 0.1% या उससे कम पर रखना पुटी अखंडता को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि उच्च सांद्रता के परिणामस्वरूप पुटी रिऐक्शन और ल्यूमेन पतन(चित्रा 7 ए) होताहै।

Cholangiocyte कार्य उनके उचित apico-basolateral ध्रुवीयता29पर निर्भर हैं । यह सत्यापित करने के लिए कि एनआरसी अल्सर ध्रुवीकृत संरचनाओं के रूप में हाइड्रोगेल में स्वयं इकट्ठा होता है, हमने क्रमशः एफ-ऐक्टिन और ई-कैडेरिन के एपिकल और बेसोलेटरल स्थानीयकरण की पुष्टि की। हमारे अल्सर में ई-कैडेरिन अभिव्यक्ति यह भी इंगित करती है कि एनआरसी कम से कम 10 दिनों के दौरान हाइड्रोगेल(चित्रा 7 बी)में अपने एपिथेलियल फेनोटाइप को बनाए रखते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: पुटी गठन और लक्षण वर्णन का प्रायोगिक कार्यप्रवाह। (A)चैंबर स्लाइड की हाइड्रोजेल कोटिंग । (ख)हाइड्रोजेल में एम्बेडिंग सेल। (ग)सिस्ट फॉर्मेशन की माइक्रोस्कोपी। (घ)सिस्ट ग्रोथ, फिजिबिलिटी, फंक्शनैलिटी और ध्रुवीकरण का 10 दिन का फॉलोअप असेसमेंट । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: छवि अधिग्रहण विधि। (A)जेड-स्टैक अधिग्रहण का कार्यप्रवाह 1 से 10 दिन तक हाइड्रोगेल गहराई के साथ किया जाता है: जेड-स्टैक अधिग्रहण(1)जेड-स्टैक की छवि प्रसंस्करण(2)न्यूनतम तीव्रता प्रक्षेपण और सिस्ट क्वांटिफिकेशन(3)की पीढ़ी । (ख)छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर स्क्रीनशॉट उद्देश्य के चयन(1),मापदंडों का समायोजन(2),छवियों की स्वत: बचत(3),और जेड-स्टैक अंशांकन(4)दिखा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: पुटी आकार और पुटी गठन दक्षता के परिमाणीकरण के लिए विधि। (A)छवि प्रसंस्करण लेआउट चित्रण: जेड-स्टैक विश्लेषण करने के लिए(1),इसकी न्यूनतम तीव्रता जेड-प्रोजेक्शन(2),पृष्ठभूमि घटाव के बाद अंतिम जेड-प्रक्षेपण(3)सिस्ट काउंटिंग और पुटी आकार अनुमान के लिए उपयोग किया जाता है। (ख)प्रक्षेपण पर पुटी पहचान(A3)प्रक्षेपण के एक ज़ूम के साथ(4)एक अंधेरे सेल खोल एक उज्जवल lumen, जो नीली लाइनों द्वारा प्रतिष्ठित कर रहे है एक उज्जवल lumen संलग्न द्वारा चित्रित की पहचान दिखाने के लिए, जो नीली रेखाओं द्वारा प्रतिष्ठित कर रहे है व्यास माप बनाम एक अंधेरे और अनियमित लाल तीर द्वारा बताया उपस्थिति के साथ समुच्चय के लिए प्लॉट । (ग)1,000 कोशिकाओं के लिए पुटी निर्माण दक्षता की गणना का सूत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: हाइड्रोगेल में सिस्ट फॉर्मेशन दक्षता और पुटी आकार वितरण। (A)समय-चूक 0, 1, 2, 4, 7, और 3 डी संस्कृतियों के 10 दिनों में प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियों दिखा रहा है । (ख)मतलब पुटी गठन दक्षता के गतिज के साथ प्लॉट ग्राफ ± एसईएम (एन = 3) । (ग)बॉक्स और मूंछ की साजिश संस्कृति के समय में पुटी आकार वितरण दिखा । ब्लैक बार पहली चतुर्थक, औसत और तीसरी चतुर्थक का प्रतिनिधित्व करते हैं; लाइनें वितरण की चौड़ाई का प्रतिनिधित्व करते हैं; काले डॉट्स न्यूनतम और वितरण की अधिकतम, एन = 3 का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: हाइड्रोगेल में एनआरसी अल्सर की व्यवहार्यता। (ए)प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट 0 दिन में संस्कृतियों की लाइव छवियां और 10 दिन में, एफडीए (ग्रीन = लाइव) और पीआई (लाल = मृत) के साथ दाग । ध्यान दें कि लाल फ्लोरेसेंस मुख्य रूप से एकल कोशिकाओं से जुड़ा हुआ था। (ख)प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट 10 दिन में एक गल सिस्ट की लाइव छवि, जहां मृत कोशिकाओं (लाल रंग में) ल्यूमेन में जमते देखा गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: हाइड्रोगेल में एनआरसी अल्सर की कार्यक्षमता। (A)10 दिन के सिस्ट की प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट लाइव छवियां जहां सेल की परत को न्यूक्लियी लेबलिंग विद होचस्ट (ब्लू) और स्रावित एफडीए (ग्रीन) द्वारा ल्यूमेन द्वारा प्रकट किया गया था। (ख)एफडीए के साथ स्राव परीक्षण के बाद प्रतिनिधि चरण कंट्रास्ट/फ्लोरोसेंट लाइव छवियां, जो ल्यूमेन में संचित दिखाई गई थीं । (ग)वेरापामिल, एक एमडीआर अवरोधक, प्रतिनिधि चरण विपरीत/अल्सर की फ्लोरोसेंट लाइव छवियों को दिखाने के लिए कि एफडीए सेल की परत में बनाए रखा गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: हाइड्रोजेल में एनआरसी अल्सर का इम्यूनोफ्लोरेसेंस। (A)प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण में प्रतिनिधि पुटी आकार दिखाने वाले उज्ज्वल क्षेत्र छवियों के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का अनुकूलन। बाएं से दाएं:(जीवित पुटी)निर्धारण से पहले पूर्ण माध्यम में एक जीवित पुटी,(निर्धारण)निर्धारण के बाद एक पुटी,(पारमेबिलाइजेशन)पारमेबिलाइजेशन के बाद एक और पुटी,(संतृप्ति)संतृप्ति चरण के बाद एक पुटी और(लेबलिंग)इम्यूनोलाबेलिंग चरण में एक पुटी। (ख)(1-2): एक पुटी के माध्यम से एक खंड के कन्फोकल छवियां जो एपिकल सरफेस मार्कर एफ-ऐक्टिन (लाल-नारंगी), बेसोलेटरल मार्कर ई-कैडेरिन (हरा) और डीएपीआई (नीले) से सना हुआ नाभिक दिखा रही हैं । (3): निम्नलिखित लेबलिंग के साथ अल्सर के एक सेट का 3 डी पुनर्गठन: एफ-ऐक्टिन के लिए लाल-नारंगी और ई-कैडेरिन के लिए हरा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 1: स्टैक का उद्घाटन। जेड-स्टैक खोलने की प्रक्रिया को दर्शाते हुए सॉफ्टवेयर का स्क्रीनशॉट कैप्चर करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 2: स्टैक दोहराव। एक जेड-स्टैक को डुप्लिकेट करने की प्रक्रिया को दिखाने वाले सॉफ्टवेयर का स्क्रीनशॉट कैप्चर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्र 3: न्यूनतम तीव्रता प्रक्षेपण का उत्पादन। डुप्लिकेट जेड-स्टैक से न्यूनतम तीव्रता प्रक्षेपण बनाने की प्रक्रिया को चित्रित करने वाले सॉफ्टवेयर का स्क्रीनशॉट कैप्चर करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 4: पृष्ठभूमि हटाने। जेड-स्टैक प्रक्षेपण से पृष्ठभूमि को हटाने के लिए विधि को चित्रित करने वाले सॉफ्टवेयर का स्क्रीनशॉट कैप्चर करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 5: कंट्रास्ट एन्हांसमेंट। जेड-स्टैक प्रक्षेपण के विपरीत को बढ़ाने के लिए कदमों को रेखांकित करने वाले सॉफ्टवेयर का स्क्रीनशॉट कैप्चर करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्र 6: चित्र अंशांकन। जेड-स्टैक और माइक्रोन में जेड-स्टैक प्रक्षेपण को कैलिब्रेट करने की प्रक्रिया को चित्रित करने वाले सॉफ्टवेयर का स्क्रीनशॉट कैप्चर करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 7: पुटी गिनती। सीधी लाइन उपकरण के साथ जेड-स्टैक प्रक्षेपण पर अल्सर की गिनती करने की प्रक्रिया को दर्शाते हुए सॉफ्टवेयर का स्क्रीनशॉट कैप्चर करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 8: पुटी गिनती चेक-अप। जेड-स्टैक प्रक्षेपण और जेड-स्टैक पर गिने गए अल्सर की संख्या की तुलना करने के लिए विधि को रेखांकित करने वाले सॉफ्टवेयर का स्क्रीनशॉट कैप्चर करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 9: आरओआई बचत। स्क्रीनशॉट दिखाता है कि मतगणना द्वारा परिभाषित आरओआई सेट को कैसे बचाया जाए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 10: पुटी का आकार और संख्या माप। स्क्रीनशॉट कैसे मापने के लिए और जेड-स्टैक प्रक्षेपण और जेड स्टैक से पुटी संख्या को बचाने के लिए विवरण सॉफ्टवेयर के कब्जा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

ऑर्गेनोजेनेसिस और 3 डी सेलुलर संरचनाओं के रखरखाव का अध्ययन करने के लिए, विभिन्न ऊतकों को मॉडलिंग किया गया है, विभिन्न सेलुलर मूल का उपयोग करके, लेकिन सिंथेटिक हाइड्रोगेल्स8, 9,10,21सहित विभिन्न प्रकार के अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिस भी। हालांकि, 3डी मात्रात्मक विश्लेषण की कमी के कारण जो ऑर्गेनॉइड गठन या कार्यक्षमता7, 8, 9,10,15,18केसंदर्भ में तरीकों के बीच तुलना के लिए अनुमति देता है, हाइड्रोजेल या दवा स्क्रीनिंग के लिए आगे मानकीकरण पहुंच से बाहर रहता है।

इन कमियों को दूर करने के लिए, हम एपिथेलियल सेल-व्युत्पन्न अल्सर उत्पन्न करने के लिए हाइड्रोगेल-आधारित, प्रजनन योग्य और मानकीकृत प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं। यहां, हमने एक संदर्भित कोलंगियोसाइट सेल लाइन से बेसल लैमिना व्युत्पन्न हाइड्रोगेल में पित्त अल्सर के गठन के साथ इसका उदाहरण दिया। 3 डी क्वांटिफिकेशन की सीमा को अनलॉक करने के लिए, पुटी निर्माण दक्षता की गणना हाइड्रोगेल में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की कुल संख्या के सापेक्ष की जाती है और पुटी विकास काइनेटिक्स को निरंतर हाइड्रोगेल मात्रा में मापा जाता है।

हम प्रासंगिक पुटी मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देने के लिए अल्सर को उत्पन्न करने और इसके लिए व्यवस्थित चरणों की एक श्रृंखला प्रदान करते हैं। इस उद्देश्य के लिए, हाइड्रोजेल एम्बेडिंग के समय सेल समुच्चय का एक समान वितरण उत्पन्न करने और हाइड्रोगेल की संरचना की विषमता को दरकिनार करने के लिए विशेष प्रयास किए गए हैं, जो पुटी गिनती के लिए एक प्रतिनिधि नमूना रखने के लिए शर्तों को स्थापित करके पुटी गठन को प्रभावित करता है।

प्रयोगात्मक प्रजनन को महत्वपूर्ण चरणों के माध्यम से संबोधित किया जाता है जैसे, सेल समग्र आकार को सीमित करने के लिए सेल निलंबन को फ़िल्टर करना और सेल-हाइड्रोगेल इसके अलावा से पहले कक्ष स्लाइडों की प्री-कोटिंग जब कोशिकाएं संस्कृति पोत की सतह से संपर्क करती हैं। लगातार मात्राकरण विभिन्न नमूनों और प्रयोगों में मापदंडों का एक निरंतर सेट के साथ हाइड्रोगेल के जेड-अक्ष के साथ तस्वीरें लेने का समाधान किया जाता है।

पुटी गठन दक्षता और पुटी वृद्धि गतिज हाइड्रोगेल में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की कुल संख्या से अनुमानित हैं। नतीजतन, छवि प्रसंस्करण के लिए एक अनुकूलनीय एल्गोरिदम पुटी गिनती और पुटी आकार माप के लिए छवियों को खंडित करने का प्रस्ताव है। प्रस्तावित विधि की नवीनता यह है कि गिनती और माप जेड-स्टैक अनुमानों पर किया जाता है। विशिष्ट पृष्ठभूमि को हटाने के बाद, विश्लेषण करने के लिए छवियों की संख्या प्रतिबंधित है, जिससे समय का काफी लाभ होता है और हार्ड डिस्क के संतृप्ति को सीमित किया जाता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस संरचनात्मक स्तर पर 3 डी संस्कृतियों का विश्लेषण करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है, विशेष रूप से ध्रुवीकरण, उचित एपिथेलियल सेल फंक्शन4में कुंजी। इस प्रकार, हमने अपने प्रोटोकॉल के इम्यूनोफ्लोरेसेंस भाग के निर्धारण, पारमेबिलाइजेशन और अवरुद्ध चरणों को सावधानीपूर्वक अनुकूलित करने के लिए कार्य किया; पुटी रिऐक्शन और आगे ल्यूमेन पतन को रोकने के लिए बीएसए एकाग्रता का निवारण।

कुल मिलाकर प्रस्तावित विधि एक सरल, प्रजनन योग्य, और महंगी प्रभावी प्रोटोकॉल, 3 डी सेलुलर संस्कृतियों को उत्पन्न करने और गुणात्मक और मात्रात्मक मापदंडों की जांच करने के लिए मार्ग खोलती है। इसके अलावा, यह विधि विभिन्न प्रकार के मैट्रिस के बीच तुलना के लिए अनुमति देती है: पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल) (खूंटी) के साथ एक ही विधि का उपयोग करके-व्युत्पन्न हाइड्रोगेल्स हम यह प्रदर्शित कर सकते हैं कि ल्यूमेन गठन और विकास क्रमशःहाइड्रोगेलकठोरता और चिपकने वालीता पर गंभीर रूप से निर्भर हैं। यह प्रोटोकॉल विभिन्न कोशिकाओं से प्राप्त स्फेरॉइड के गठन और कार्य की तुलना करने के लिए भी लागू होता है, जो ऊतक-विशिष्ट एपिथेलियल स्पफेरॉइड मॉडल के मानकीकरण में भाग ले सकता है। हालांकि, एक सीमा यह है कि संस्कृति मीडिया, प्रारंभिक सेल सीडिंग और पुटी गठन के लिए आवश्यक समय जैसी संस्कृति स्थितियों का अनुकूलन अन्य सेल प्रकारों के लिए आवश्यक हो सकता है। पित्त वाहिनी क्षेत्र में, यह काम पित्त वाहिनी ऑर्गेनोजेनेसिस, साथ ही रोग के आणविक मार्गों, और दवा परीक्षण के बारे में सवालों के जवाब देने में योगदान दे सकता है । इस प्रोटोकॉल को उच्च थ्रूपुट विश्लेषण पर लागू होने पर भी इसकी सीमा मिलेगी क्योंकि पुटी गिनती और इमेजिंग प्रसंस्करण जैसे कुछ कदम अभी तक स्वचालित नहीं हैं, भले ही हम इमेजिंग प्रक्रिया को अर्ध-स्वचालित करने के लिए मैक्रो का प्रस्ताव करते हैं जिसे स्वचालितीकरण के लिए आगे विकसित किया जा सकता है। इस मामले में स्वचालित प्रसंस्करण की सीमा छवि पृष्ठभूमि है। यह प्राकृतिक जटिल हाइड्रोगेल की विषम संरचना के कारण होता है जैसे तहखाने झिल्ली प्रकार जैल, लेकिन हमारा मानना है कि स्वचालितीकरण को पारदर्शी जैल जैसे खूंटी-व्युत्पन्न हाइड्रोगेल पर लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम डॉ निकोलस LaRusso (मेयो क्लिनिक, रोचेस्टर, मिनेसोटा, संयुक्त राज्य अमेरिका) का शुक्रिया अदा करते हैं, जिन्होंने कृपया एनआरसी सेल लाइन प्रदान की।

इस काम को आईलाइट आरएचयू प्रोग्राम (ग्रांट एएनआर-16-आरयूएस-0005) और धू हेपाटिनोव दोनों की वित्तीय सहायता मिली।

हम इमेजिंग पर उनके समर्थन के लिए इसाबेल गार्सिन और रेसेउ डी इमेजरी सेल्यूले पेरिस सैक्ले का शुक्रिया अदा करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 µl- Pipette Eppendorf Research Plus Thermo Fisher Scientific 3120000020
100 µl - Pipette Eppendorf Research Plus Thermo Fisher Scientific 3120000046
1000 µl - Pipette Eppendorf Research Plus Thermo Fisher Scientific 3120000062
1X PBS Thermo Fisher Scientific 14190-094
200 µl - Pipette Eppendorf Research Plus Thermo Fisher Scientific 3120000054
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt Sigma-Aldrich T5516 NRC complete medium final concentration = 3.4 µg/mL
Acetic acid VWR 20104-298 0.02N final
Aerosol barrier pipettes tips 10 µl (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 2707439
Aerosol barrier pipettes tips 1000 µl (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 2707404
Aerosol barrier pipettes tips 200 µl (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 2707430
Antibiotic Antimicotic Solution (100X) Sigma-Aldrich A5955 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Bovine pituitary extract Thermo Fisher Scientific 13028-014 NRC complete medium final concentration = 30 µg/mL
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A2153 1:1000 dilution
Chemically Defined Lipid Concentrate (100X) Thermo Fisher Scientific 11905-031 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Collagen high concentration, rat tail Thermo Fisher Scientific 354249 50 µg/mL final concentration
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902 NRC complete medium final concentration = 0.393 µg/mL
DMEM F12 Thermo Fisher Scientific 21331-020 NRC complete medium final concentration = 1X
E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal Thermo Fisher Scientific PA5-32178 1:400 dilution
Eclipse TE300 inverted microscope Nikon imaging
Ethanolamine Sigma-Aldrich E9508 NRC complete medium final concentration = 0.32 mM
Fetal calf serum Thermo Fisher Scientific 10270-106 NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution
Fluoroshield with DAPI (Mounting medium) Sigma-Aldrich F6057
Formaldehyde 16% (W/V) Thermo Fisher Scientific 28906 4% (W/V)
Goat serum Thermo Fisher Scientific 16210-064 1:10 dilution
Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA - flash 4.OLT) Hamamatsu imaging
Hoechst 33258 Sigma-Aldrich B1155 5 µg/mL final concentration
IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647 Thermo Fisher Scientific A32733 1:500 dilution
ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n Open source image processing software
Insulin-Transferrin-Selenium (100X) Thermo Fisher Scientific 51300-044 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
L-Glutamine (100X) Thermo Fisher Scientific 25030-024 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL) Thermo Fisher Scientific 356231 4:10 dilution
NIS Elements software version 4.50.00 Nikon image acquisition and display
Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-035 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2) Nikon
Prolong Gold Antifade Reagent Thermo Fisher Scientific P36931
Propidium Iodide (PI) Sigma-Aldrich P4170 20 µg/mL final concentration
Rhodamine Phalloidin Thermo Fisher Scientific R415 16.2 nM final concentration
Sir-Actin / Verapamil kit Spirochrome SC001 10 µM final concentration
Soybean trypsin inhibitor Thermo Fisher Scientific 17075-029 NRC complete medium final concentration = 50 µg/mL
Sterile cell strainer 40 µm (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 22363547
Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 1367811E
Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 1367811D
Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 11926955
Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 7200886
Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 553913
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 5:100 dilution
Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon) Thermo Fisher Scientific 353108
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 5:1000 dilution
Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red Thermo Fisher Scientific 25300-054 1X
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 5:10000 dilution
Vitamin (100X) Thermo Fisher Scientific 11120-037 NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution
μ-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi Clinisciences 80826

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References

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Bouzhir, L., Gontran, E., Loarca, L., Collado-Hilly, M., Dupuis-Williams, P. Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts. J. Vis. Exp. (159), e61404, doi:10.3791/61404 (2020).

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