Summary

Super-Resolution Imaging zur Untersuchung der Kolokalisierung von Proteinen und synaptischen Markern in primärer Neuronen

Published: October 31, 2020
doi:

Summary

Dieses Protokoll zeigt, wie man eine hochauflösende Mikroskopie einsetzt, um die Proteinkolokalisierung in primären neuronalen Kulturen zu untersuchen.

Abstract

Synapsen sind die funktionellen Elemente von Neuronen und ihre Defekte oder Verluste sind die Grundlage für mehrere neurodegenerative und neurologische Erkrankungen. Bildgebende Studien werden häufig verwendet, um ihre Funktion und Plastizität unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Aufgrund ihrer Größe und Struktur erfordern Lokalisierungsstudien von Proteinen hochauflösende bildgebende Verfahren. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Untersuchung der Kolokalisierung von Zielproteinen mit synaptischen Markern in Primärneuronen auf einer Superauflösungsebene mittels strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM). SIM ist eine gemusterte Lichtbeleuchtungstechnik, die die räumliche Auflösung der Weitfeldmikroskopie verdoppelt und ein Detail von etwa 100 nm erreicht. Das Protokoll gibt die erforderlichen Kontrollen und Einstellungen für robuste Co-Lokalisierungsstudien und einen Überblick über die statistischen Methoden zur korrekten Analyse der Bilddaten an.

Introduction

Das Verständnis und die Sicht der Synapse hat sich seit ihrer ersten Beschreibung durch Foster und Sherrington im Jahre 1897 enorm verändert1. Seitdem ist unser Wissen über neuronale Kommunikation und die dahinter stehenden molekularen Prozesse exponentiell gewachsen2. Es ist klar geworden, dass Synapsen als ein Zwei-Kompartime-System gedacht werden können: ein präsynaptisches Fach mit Vesikeln für die Freisetzung von Neurotransmittern und ein postsynaptisches Fach mit Rezeptoren3. Diese vereinfachende Sichtweise hat sich in den letzten zwanzig Jahren zu einem komplexen Netzwerk von Proteinen entwickelt, die erforderlich sind, um die Senderbindung in die Signalisierung4zu transduzieren.

Die Gewinne im Verständnis sind teilweise auf Super-Resolution-Techniken zurückzuführen, die die Beugungsgrenze der konventionellen Lichtmikroskopie überschritten haben, um der Dimension der Synapsen besser5,6,7,8,9,10anzupassen. Aufgrund der Beugungsgrenze kann ein optisches Mikroskop seitlich keine Auflösung über 200 nmerreichen 11,12. Um diese Grenze zu umgehen, wurden Super-Resolution-Techniken entwickelt, die verschiedene Ansätze und verschiedene Sub-Diffraktions-Limit-Auflösungen erreichten: SIM, STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) und STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM verdoppelt die räumliche Auflösung laserbasierter Weitfeldmikroskopiesysteme, indem ein Beugungsgitter in den Anregungsstrahlpfad15eingebracht wird. Das bewegliche Gitter diffriert die Laserstrahlen, um ein bekanntes Beleuchtungsmuster zu erzeugen, in der Regel Streifen. Dieses zweckdienlich strukturierte Lichtmuster wird der unbekannten räumlichen Verteilung des Fluoreszenzfarbstoffs (der Probe) überlagert. Die Interferenzfranen, die durch die beiden Muster gebildet werden, kodieren für sonst ununterscheidbare Feine Details mit normaler Weitfeldmikroskopie. Das endgültige superaufgelöste Bild wird durch Die Kombination und Dekodierung mit mathematischen Methoden mehrere Rohbilder derselben Probe erhalten durch die Übersetzungen und Drehungen des Beugungsgitters erhalten. Die Auflösung der superaufgelösten Bilder erreicht 100 nm in der Seitlichen und 500 nm in axialen Richtungen für 2D-SIM15 oder 100 nm in der Seitlichen und 250 nm in axialen Richtungen für 3D-SIM16.

Das neue Verständnis der Synapse ist noch wichtiger angesichts der vielen neurologischen Störungen, bei denen synaptische Dysfunktion spielt eine wichtige Rolle bei Beginn und Progression17,18. Alzheimer-Krankheit, Down-Syndrom, Parkinson-Krankheit, Prion-Erkrankungen, Epilepsie, Autismus-Spektrum-Störungen und fragile x-Syndrom unter anderem wurden mit Anomalien in der synaptischen Zusammensetzung, Morphologie und Funktion19,,20,21,22verbunden.

Kürzlich haben wir mit einer Reihe von SUMO-spezifischen Antikörpern SIM verwendet, um die Kolokalisierung in primären Hippocampus-Neuronen der SUMO-Proteine mit den prä- und postsynaptischen Markern Synaptophysin und PSD95 auf Superauflösungsebene23zu zeigen. Dies ermöglichte es uns, biochemische und konfokale Mikroskopie-Beweise für die SUMO-Lokalisierung in Neuronen zu bestätigen.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Untersuchung der Lokalisierung von Proteinen in Maus-Hippocampus-Primärneuronen. Gleichzeitig kann dieses Protokoll an verschiedene Arten von primären neuronalen Kulturen angepasst werden.

Protocol

1. Primärkulturen Kultur Maus Hippocampus primäre Neuronen in kammerförmigen Abdeckungen (wie Ibidi μ-Slide 8 Well oder Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass), die die objektive Anforderung für #1,5 (0,17 mm) Abdeckung dicke entsprechen. Mantelkammer-Abdeckungen mit 100 l Poly-L-Lysin (100 g/ml). Am nächsten Tag die kammerförmigen Deckel zweimal mit steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS) waschen. Um Maus primär neuronen zu erhalten, isolieren Hippocampi von P1-P4 Welpen<sup…

Representative Results

Wir präsentieren hier den Standard-Workflow zur Kolokalisierung neuronaler Proteine. Wir haben zuerst das Mikroskop kalibriert und als nächstes die SIM-Analyse der Proben durchgeführt. Zur Kalibrierung des Systems verwendeten wir fluoreszierende Mikrosphären mit einem Durchmesser von 0,1 m. Nach dem Erhalt von super aufgelösten 3D-SIM-Bildern der Perlen werden die zugrunde liegenden Bilddaten Fourier-transformiert, um sie in eine räumliche Frequenzdarstellung umzuwandeln. In Abbildung 2A</stron…

Discussion

Die Aufklärung der Struktur und Zusammensetzung der Synapse ist entscheidend für das Verständnis der physiologischen und pathologischen Prozesse, die Gedächtnis und Kognition regulieren. Während im normalen Zustand, Synapsen sind die Bausteine des Gedächtnisses, Sie auch zugrunde liegen komplexe neurologische Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit32. Das hier beschriebene Protokoll dient dazu, die Kolokalisierung neuronaler Proteine mit einer superhochauflösenden Mikroskopietechnik namens SIM…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Edoardo Micotti für die konstruktive Kritik an dem Manuskript. Diese Studie wurde unterstützt von BrightFocus A2019296F, von Fondo di Beneficenza – Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), von Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) und vom Marie Skéodowska-Curie Innovative Training Network (JK).

Materials

0.4% Trypan blue solution  Thermo Fisher Scientific 15250061 Chemical
70 µm filter  Corning 352350 Equiment
Alexa Thermo Fisher Scientific Antibody
Antibody SENP1 Santa Cruz sc-271360 Antibody
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Chemical
Bovine serum albumin  Merck 5470 Chemical
CaCl2 Merck Life Science 21115 Chemical
Chambered coverslips Ibidi 80826 Equiment
DyLight Thermo Fisher Scientific Antibody
FBS (Hyclone) GIBCO SH3007002 (CHA1111L) Serum
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent Thermo Fisher Scientific F8803 Equiment
Glucose Merck Life Science G8769 Chemical
Glutamax GIBCO 35050061 Chemical
HEPES Merck Life Science H3537 Chemical
L-Cystein  Merck Life Science  C6852-25g Chemical
MAP2 Merck AB15452 Antibody
MEM  Life Technologies 21575022 Medium
MgCl Merck Life Science M8266 Chemical
NaOH VWR International 1,091,371,000 Chemical
Neurobasal A Life Technologies 10888022 Medium
N-SIM Super Resolution Microscope Nikon Instrument
Papain Merck Life Science  P-3125 Chemical
paraformaldehyde  Thermo Fisher Scientific 28908 Chemical
Pen/Strep 10x Life Technologies 15140122 Chemical
phosphate-buffered saline  Gibco 10010023 Chemical
Poly-L lysine Sigma P2636 Chemical
ProLong Diamond Glass Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970 Chemical
PSD95  NeuroMab K28/43 Antibody
Round coverglass Thermo 12052712 Equiment
SUMO1 Abcam ab32058 Antibody
Synaptophysin  Merck S5768  Antibody
Triton X-100  Merck T8787 Chemical
Trypsin inhibitor  Merck Life Science  T9003-500MG Chemical

References

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Russo, L., Natale, C., Conz, A., Kelk, J., Restelli, E., Chiesa, R., Salmona, M., Fioriti, L., Colnaghi, L. Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons. J. Vis. Exp. (164), e61434, doi:10.3791/61434 (2020).

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