Summary

Imagem de super-resolução para estudar co-localização de proteínas e marcadores sinápticos em neurônios primários

Published: October 31, 2020
doi:

Summary

Este protocolo mostra como empregar microscopia de super-resolução para estudar a co-localização de proteínas em culturas neuronais primárias.

Abstract

Sinapses são os elementos funcionais dos neurônios e seus defeitos ou perdas são a base de várias doenças neurodegenerativas e neurológicas. Estudos de imagem são amplamente utilizados para investigar sua função e plasticidade em condições fisiológicas e patológicas. Devido ao seu tamanho e estrutura, estudos de localização de proteínas requerem técnicas de imagem de alta resolução. Neste protocolo, descrevemos um procedimento para estudar em neurônios primários a co-localização de proteínas-alvo com marcadores sinápticos em um nível de super-resolução utilizando microscopia de iluminação estruturada (SIM). SIM é uma técnica de iluminação de luz padronizada que dobra a resolução espacial da microscopia de campo largo, atingindo um detalhe de cerca de 100 nm. O protocolo indica os controles e configurações necessários para estudos robustos de co-localização e uma visão geral dos métodos estatísticos para analisar adequadamente os dados de imagem.

Introduction

A compreensão e visão da sinapse mudou enormemente desde sua primeira descrição por1Foster e Sherrington em 18971 . Desde então, nosso conhecimento da comunicação neuronal e dos processos moleculares por trás dela tem crescido exponencialmente2. Tornou-se claro que as sinapses podem ser consideradas como um sistema de dois compartimentos: um compartimento pré-sináptico contendo vesículas para a liberação de neurotransmissores e um compartimento pós-sináptico com receptores3. Essa visão simplista, nos últimos vinte anos, evoluiu para uma complexa rede de proteínas necessárias para transdutor de transmissão ligado à sinalização4.

Os ganhos no entendimento se devem, em parte, às técnicas de super-resolução que superaram o limite de difração da microscopia de luz convencional para se adequar melhor à dimensão das sinapses5,,6,,7,,8,,9,,10. Devido ao limite de difração, um microscópio óptico não pode atingir uma resolução acima de 200 nm lateralmente11,12. Para contornar esse limite, foram criadas técnicas de super-resolução, utilizando diferentes abordagens e atingindo diferentes resoluções de limite de subditração: SIM, STED (Estimulada Microscopia de Esgotamento de Emissões), PALM (Microscopia de Localização FotoAtivada) e STORM (Microscopia óptica de Reconstrução Estocástica)13,14. O SIM dobra a resolução espacial de sistemas de microscopia de campo largo baseados em laser inserindo uma grade de difração no feixe de excitação15. A grade móvel difunde os raios laser para criar um padrão de iluminação conhecido, geralmente listras. Este padrão de luz estruturado propositalmente é sobreposto à distribuição espacial desconhecida do corante fluorescente (da amostra). As franjas de interferência formadas pelos dois padrões codificam para detalhes finos indistinguíveis com microscopia de campo largo normal. A imagem super-resolvida final é obtida pela combinação e decodificação com métodos matemáticos várias imagens brutas da mesma amostra obtidas pelas traduções e rotações da grade de difração. A resolução das imagens super-resolvidas atinge 100 nm na lateral e 500 nm nas direções axial para 2D-SIM15 ou 100 nm na lateral e 250 nm nas direções axial para 3D-SIM16.

O novo entendimento da sinapse é ainda mais importante à luz das muitas doenças neurológicas onde a disfunção sináptica desempenha um papel importante no início e progressão17,18. Doença de Alzheimer, Síndrome de Down, Doença de Parkinson, doenças de príon, epilepsia, transtornos do espectro autista e síndrome do X frágil, entre outros, têm sido associadas a anormalidades na composição sináptica, morfologia e função19,,20,,21,22.

Recentemente, utilizando um conjunto de anticorpos específicos do SUMH, usamos o SIM para mostrar a co-localização nos neurônios hipocampais primários das proteínas SUMO com os marcadores pré e pós-sináptico sinaptophysin e PSD95 no nível de super resolução23. Isso nos permitiu confirmar evidências de microscopia bioquímica e confocal da localização do SUM nos neurônios.

Aqui, descrevemos um protocolo para estudar a localização de proteínas em neurônios primários hipocampais de camundongos. Ao mesmo tempo, este protocolo pode ser adaptado a diferentes tipos de culturas neuronais primárias.

Protocol

1. Culturas primárias Neurônios primários hipocampais de rato de cultura em tampas câmaras (como Ibidi μ-Slide 8 Bem ou Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) que correspondem ao requisito objetivo para #1,5 (0,17 mm) de espessura de deslizamento. Tampas de câmara de revestimento com 100 μL de poli-L-lisina (100 μg/mL). No dia seguinte, lave as tampas câmara duas vezes com soro fisco estéril tamponado (PBS). Para obter neurônios primários do camundongo, isole o hipocampi do…

Representative Results

Apresentamos aqui o fluxo de trabalho padrão para estudar a co-localização das proteínas neuronais. Primeiro calibramos o microscópio e, em seguida, realizamos a análise sim das amostras. Para calibrar o sistema, utilizamos microesferas fluorescentes de 0,1 μm de diâmetro. Ao obter imagens 3D-SIM super resolvidas das contas, os dados de imagem subjacentes são transformados em Fourier para recon converter-nas em uma representação de frequência espacial. Na Figura 2A,o padrão de f…

Discussion

Elucidar a estrutura e a composição da sinapse é crucial para a compreensão dos processos fisiológicos e patológicos que regulam a memória e a cognição. Enquanto no estado normal, as sinapses são os blocos de construção da memória, elas também estão por trás de distúrbios neurológicos complexos, como a doença de Alzheimer32. O protocolo descrito aqui serve para estudar a co-localização de proteínas neuronais com uma técnica de microscopia de super resolução chamada SIM. Ut…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem a Edoardo Micotti pela crítica construtiva ao manuscrito. Este estudo foi apoiado pela BrightFocus A2019296F, por Fondo di Beneficenza – Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), pela Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) e pela Rede de Treinamento Inovador Marie Skłodowska-Curie (JK).

Materials

0.4% Trypan blue solution  Thermo Fisher Scientific 15250061 Chemical
70 µm filter  Corning 352350 Equiment
Alexa Thermo Fisher Scientific Antibody
Antibody SENP1 Santa Cruz sc-271360 Antibody
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Chemical
Bovine serum albumin  Merck 5470 Chemical
CaCl2 Merck Life Science 21115 Chemical
Chambered coverslips Ibidi 80826 Equiment
DyLight Thermo Fisher Scientific Antibody
FBS (Hyclone) GIBCO SH3007002 (CHA1111L) Serum
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent Thermo Fisher Scientific F8803 Equiment
Glucose Merck Life Science G8769 Chemical
Glutamax GIBCO 35050061 Chemical
HEPES Merck Life Science H3537 Chemical
L-Cystein  Merck Life Science  C6852-25g Chemical
MAP2 Merck AB15452 Antibody
MEM  Life Technologies 21575022 Medium
MgCl Merck Life Science M8266 Chemical
NaOH VWR International 1,091,371,000 Chemical
Neurobasal A Life Technologies 10888022 Medium
N-SIM Super Resolution Microscope Nikon Instrument
Papain Merck Life Science  P-3125 Chemical
paraformaldehyde  Thermo Fisher Scientific 28908 Chemical
Pen/Strep 10x Life Technologies 15140122 Chemical
phosphate-buffered saline  Gibco 10010023 Chemical
Poly-L lysine Sigma P2636 Chemical
ProLong Diamond Glass Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970 Chemical
PSD95  NeuroMab K28/43 Antibody
Round coverglass Thermo 12052712 Equiment
SUMO1 Abcam ab32058 Antibody
Synaptophysin  Merck S5768  Antibody
Triton X-100  Merck T8787 Chemical
Trypsin inhibitor  Merck Life Science  T9003-500MG Chemical

References

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Russo, L., Natale, C., Conz, A., Kelk, J., Restelli, E., Chiesa, R., Salmona, M., Fioriti, L., Colnaghi, L. Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons. J. Vis. Exp. (164), e61434, doi:10.3791/61434 (2020).

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