Injektion von Hydrogel-Biomaterialgerüsten in das Gehirn nach einem Schlaganfall

Summary

Schlaganfall ist ein globales Problem mit minimalen Behandlungsmöglichkeiten und keiner aktuellen klinischen Therapie zur Regeneration des verlorenen Hirngewebes. Hier beschreiben wir Methoden zur Erzeugung eines präzisen photothrombotischen Schlaganfalls im motorischen Kortex von Nagetieren und der anschließenden Injektion von Hydrogel-Biomaterialien, um ihre Auswirkungen auf die Geweberegeneration nach einem Schlaganfall zu untersuchen.

Abstract

Schlaganfall ist die Hauptursache für Behinderung und die fünfthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten. Etwa 87% aller Schlaganfälle sind ischämische Schlaganfälle und werden als plötzliche Blockade eines Gefäßes definiert, das das Gehirn mit Blut versorgt. Innerhalb weniger Minuten nach der Blockade beginnen die Zellen zu sterben und führen zu irreparablen Gewebeschäden. Aktuelle therapeutische Behandlungen konzentrieren sich auf die Entfernung oder Lyse von Gerinnseln, um die Reperfusion zu ermöglichen und schwerere Hirnschäden zu verhindern. Obwohl die vorübergehende Plastizität des Gehirns im Laufe der Zeit einen Teil des beschädigten Gewebes retten kann, bleiben signifikante Teile der Patienten mit neurologischen Defiziten zurück, die sich nie auflösen werden. Es fehlt an therapeutischen Optionen zur Behandlung neurologischer Defizite, die durch Einen Schlaganfall verursacht werden, was die Notwendigkeit unterstreicht, neue Strategien zur Behandlung dieser wachsenden Patientenpopulation zu entwickeln. Injizierbare Biomaterialien werden derzeit entwickelt, um die Plastizität des Gehirns zu verbessern und die endogene Reparatur durch die Abgabe von Wirkstoffen oder Stammzellen zu verbessern. Eine Methode, um diese Ansätze zu testen, besteht darin, ein Nagetierschlagmodell zu verwenden, das Biomaterial in den Schlaganfallkern zu injizieren und die Reparatur zu bewerten. Die genaue Lage des Schlaganfallkerns zu kennen, ist für die genaue Behandlung nach dem Schlaganfall unerlässlich, daher ist ein Schlaganfallmodell, das zu einem vorhersagbaren Schlaganfallort führt, vorzuziehen, um die Notwendigkeit einer Bildgebung vor der Injektion zu vermeiden. Das folgende Protokoll behandelt, wie man einen photothrombotischen Schlaganfall induziert, wie man ein Hydrogel kontrolliert und präzise injiziert und wie man das Gehirn extrahiert und kryosektioniert, während das Biomaterial intakt bleibt. Darüber hinaus werden wir aufzeigen, wie dieselben Hydrogelmaterialien für die Co-Delivery von Stammzellen verwendet werden können. Dieses Protokoll kann auf die Verwendung anderer injizierbarer Biomaterialien in den Schlaganfallkern verallgemeinert werden.

Introduction

Schlaganfall ist die Hauptursache für Behinderung und die fünfthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten¹. Ungefähr 87% aller Schlaganfälle sind ischämisch, während eine Mehrheit der restlichen 13% hämorrhagisch^{ist 2}. Ein ischämischer Schlaganfall ist definiert als die Blockade des Blutflusses in einer Arterie zum umgebenden Gewebe. Dieser Verschluss führt zu Sauerstoffmangel und anschließender Nekrose, die bei überlebenden Patienten oft zu dauerhaften Behinderungen führt. Während die Sterblichkeitsrate von Schlaganfall³zurückgegangen ist, wird erwartet, dass seine Prävalenz bis 2030 auf 3,4 Millionen Menschen ansteigen wird⁴. Diese Zunahme behinderter Überlebender und die daraus resultierende wirtschaftliche Belastung haben zu einem Vorstoß für die Schlaganfallforschung geführt, die sich auf Mechanismen der neuronalen Reparatur konzentriert. Nach dem Schlaganfall kommt es zu einer entzündlichen Periode, die zur Bildung einer Narbe führt, die verhindert, dass sich die nekrotische Region ausdehnt. Die Region, die den nekrotischen Kern umgibt, wird als “Periinfarkt” bezeichnet, und es gibt starke Hinweise darauf, dass die Plastizität in dieser Region, die eine erhöhte Angiogenese, Neurogenese und axonale Keimung umfasst, direkt mit der beobachteten Erholung bei Tiermodellen und Menschen zusammenhängt⁵. Da es keine In-vitro-Modelle gibt, die die komplexen Wechselwirkungen nach einem Schlaganfall richtig replizieren können, sind Tiermodelle für die Schlaganfallforschung unerlässlich.

Es gibt mehrere In-vivo-Modelle, die verwendet werden können, um einen ischämischen Schlaganfall zu erzeugen. Eines der häufigsten Modelle, die bei Mäusen verwendet werden, ist der Verschluss der mittleren Hirnarterie oder MCAo durch distalen oder proximalen (über intraarteriale Filamente) Verschluss. Das proximale Modell, auch bekannt als Filament MCAo (fMCAo), führt typischerweise zu großen ischämischen Schlaganfällen, die zwischen 5% und 50% der gehirnförmigen Hemisphäre umfassen, abhängig von der Anzahl der Faktoren⁶. In diesen Modellen wird eine Naht oder ein Filament von der Arteria carotis interna in die Basis der mittleren Hirnarterie (MCA) vorgeschoben und für einen bestimmten Zeitraum an Ort und Stelle gehalten. Diese Methode zur Okklusion, die vorübergehend oder dauerhaft gemacht werden kann, erzeugt einen Infarkt, der im Striatum zentriert ist und einen darüber liegenden Kortex beinhalten kann oder auch nicht⁶. Die resultierende Schlaggröße ist sehr variabel, und bildgebende Verfahren wie Laserdoppler sind erforderlich, um die Wirksamkeit des Verfahrens in jeder Maus zu bestätigen. Intraarterieller oder intralumnaler Filamentverschluss, der länger als 30 Minuten dauert, erzeugt Schläge am größeren Ende des Größenbereichs. Einige Forscher haben sich auf kürzere Filamentverschlusszeiten konzentriert, die einen erheblichen experimentellen Fokus und eine Laborvalidierung erfordern⁷. Filament-MCAo-Modelle bei Mäusen folgen ähnlichen Stadien des Zelltods, der ischämischen Progression und der Bildung einer Periinfarktregion, wie sie bei menschlichen Schlaganfallfällen beobachtet werden; Die größeren Schlaganfälle ähneln jedoch eher dem Krankheitszustand von bösartigen Hirninfarkten, die seltenere, weniger behandelbare menschliche Schlaganfälle sind⁶. In der Zwischenzeit erfordert der distale MCA-Verschluss eine aufwendigere Operation und Kraniektomie. In diesem Modell wird der distale Teil des MCA, der entlang der Oberfläche des Gehirns verläuft, direkt mit einer Nahtbindung oder Kauterisation verschlossen. In einigen Variationen der Technik sind die Halsschlagadern einseitig oder vorübergehend-bilateral verschlossen. Ein Vorteil des distalen MCAo besteht darin, dass er einen kortikalen Schlag erzeugt, dessen Größe weniger variabel ist als das Filamentmodell. Das distale Modell erzeugt jedoch aufgrund der Transektion der äußeren Halsschlagader (ECA) eine schlechtere Verhaltensleistung, was auch bei fMCAo 6 ein Problem^darstellt.

Ein alternatives Schlaganfallmodell, das dafür bekannt ist, weniger invasiv zu sein, ist das photothrombotische (PT) Modell. Das PT-Modell führt zu einem klar definierten Ort der Ischämie und ist mit einer hohen Überlebensrate assoziiert⁸. Die Technik beruht auf einem lichtempfindlichen Farbstoff, der intraperitoneal injiziert wird und die intravaskuläre Photooxidation einfach durch Bestrahlung des gewünschten Gewebes mit einem Licht oder Laser^{ermöglicht 9}. Bei Anregung bilden sich Sauerstoffradikale, die Endothelschäden verursachen, die die Thrombozytenaggregation und Gerinnselbildung im bestrahlten Bereich aktivieren^8,9. Die strenge Kontrolle über Hubgröße und -position sowie die hohe Reproduzierbarkeit des PT-Modells machen es ideal für die Untersuchung von Biomaterialien. Während Präzision durch einen Laser und stereotaktische Koordinaten ermöglicht wird, gibt es einige Nachteile, die dieses Modell für wenige Studien weniger ideal machen können. Im Gegensatz zum fMCAo-Modell kann das PT-Hubmodell nicht reperfundiert werden. Daher wären Materialien zur Untersuchung neuroprotektiver Wirkstoffe, die spezifisch für Schäden nach Reperfusion oder die Mechanismen nach reperfusion sind, hier nicht sinnvoll⁸. Darüber hinaus wird aufgrund der mikrovaskulären Beleidigung des PT-Modells eine relativ kleine ischämische Penumbra gesehen. Stattdessen tritt ein lokales vasogenes Ödem auf, das für den menschlichen Schlaganfall untypisch ist, was dieses Modell für präklinische Arzneimittelstudien, die sich auf den Periinfarktbereich^{konzentrieren,}unerwünscht macht⁶,⁸.

Das übergeordnete Ziel von Biomaterialstrategien bei Schlaganfällen ist es, entweder bioaktive Wirkstoffe zu liefern oder als surrogatartige extrazelluläre Matrix für das Wachstum von Hirngewebe zu fungieren. Eine Strategie, die wir mit unseren Methoden untersuchen werden, besteht darin, Hydrogel direkt in den Schlaganfallkern zu liefern, im Gegensatz zum periinfarkten Gewebe, in dem viele aktuelle Zelltherapien verabreicht werden¹⁰. Die Begründung für diesen Ansatz ist, dass die Abgabe in das nekrotische Gewebe im Kern die Störung des umgebenden gesunden oder sich erholenden Gewebes vermeidet. Wir gehen davon aus, dass die Diffusion aller im Biomaterial enthaltenen Wirkstoffe in der Lage sein wird, den Periinfarkt vom Kern aus zu erreichen, zumal wir feststellen, dass die Abgabe von Hydrogel-Biomaterialien die Dicke der Glianarbe reduziert¹¹. Dies ist wichtig, da gezeigt wurde, dass die Periinfarktregion nach einem Schlaganfall Neuroplastizität aufweist, was sie zu einem attraktiven Ziel macht. Darüber hinaus kann die Abgabe einer Surrogatmatrix an den Schlaganfallkern mit angiogenen¹² oder neurogenen¹³ Faktoren beladen werden, um die Bildung von neuem Gewebe zu steuern, sowie Zellen für die Abgabe¹⁴. Die Zellabgabe wird durch die Verwendung einer Matrix erheblich verbessert, da sie die Zellen vor den harten Injektionskräften und der lokalen Umgebung schützt, die während der Entbindung vorhanden sind, sowie die Differenzierung und Transplantation fördert¹⁵.

Diese injizierbaren therapeutischen Biomaterialien haben klinische Relevanz bei Schlaganfallanwendungen, da es derzeit keine medizinischen Therapien gibt, die die neuronale Erholung nach einem Schlaganfall stimulieren. Die zugrunde liegenden neuronalen Schaltkreise, die an der Genesung beteiligt sind, liegen im Hirngewebe, das an den Schlaganfallkern¹⁶angrenzt, während der Schlaganfallkern selbst frei von lebensfähigem Nervengewebe ist. Wir gehen davon aus, dass die Abgabe eines Biomaterials in den nekrotischen Schlaganfallkern das Potenzial hat, das angrenzende Gewebe durch eine Reihe von zuvor erwähnten Mechanismen zu regenerativen Prozessen zu stimulieren, darunter die Depotfreisetzung von Wachstumsfaktoren^13,die Stimulation des Gewebewachstums und die Förderung der Wiederherstellung der Entwicklung von Hirngewebe^11,12, Veränderung der Immunantwort¹⁷und die Abgabe von aus Stammzellen abgeleiteten^{Therapeutika 14. 18}. Um jedoch die Möglichkeit dieser Anwendungen effektiv zu untersuchen, ist eine konsistente und reproduzierbare Methode zur Induktion von Schlaganfällen und zur Injektion von Biomaterialien erforderlich. Das PT-Hubmodell verwendet Techniken, die eine präzise Kontrolle über die Ausrichtung und Position des Hubs bieten. Ein am stereotaktischen Gerät befestigter Laser führt die Ausrichtung, und an den stereotaktischen Geräten angebrachte Pumpen steuern die Injektionsrate des Materials, ohne dass zusätzliche Formen der Bildgebung erforderlich sind. Daher haben wir uns entschieden, die Methoden zur Durchführung eines PT-Schlaganfalls in den motorischen Kortexen von Mäusen und zur Injektion von Biomaterialien in den Schlaganfallkern zu beschreiben. Hier verwenden wir mikroporöse geglühte Partikel (MAP) Hydrogele als Biomaterial für die Injektion ohne Zusatz von Zellen oder Wachstumsfaktoren. Darüber hinaus erklären wir, wie man das Gehirn mit intaktem Biomaterial erfolgreich abrufen kann, und wir diskutieren immunchemische Assays, die zur Analyse des Schlaganfallergebnisses mit und ohne Injektion von Biomaterialien verwendet werden.

Protocol

Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit IUCAC an der Duke University und der University of California Los Angeles durchgeführt. 8 bis 12 Wochen alte männliche C57Bl/6J-Mäuse wurden in dieser Studie verwendet. Die Tiere wurden unter kontrollierter Temperatur (22 ± 2 °C) mit einer 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklusperiode und Zugang zu pelletiertem Futter und Wasser ad libitum untergebracht. Analgesie- und Sedierungsprotokolle werden als von der IUCAC genehmigt beschrieben, können sich jedoch von den in anderen …

Representative Results

Ziel dieser Methode war es, zu demonstrieren, wie man nach einem Schlaganfall Biomaterialien in das Gehirn injizieren kann. Ein photothrombotisches Modell mit Rosenbengalen und einem 520-nm-Laser wurde zur kontrollierten Ausrichtung der Schlaganfallläsion in Größe und Ort verwendet. Fünf Tage nach dem Schlaganfall konnte der Infarkt während der Operation sichtbar gemacht werden (Abbildung 1B) und durch TTC und Bildgebung von IHC-gefärbten Objektträgern (Abbildung …

Discussion

Hier zeigen wir ein leicht reproduzierbares, minimalinvasives, permanentes Schlaganfallmodell und beschreiben, wie fünf Tage nach dem Schlaganfall ein Biomaterial in den Infarkt injiziert werden kann. Die Verwendung des photothrombotischen Farbstoffs Rose Bengal und eines 520 nm kollimierten Lasers, der mit dem stereotaktischen Gerät verbunden ist, gibt uns die Möglichkeit, den Schlag mit erhöhter Präzision am motorischen Kortex der Maus zu positionieren. Fünf Tage nach dem Schlaganfall ist die Lage des Infarkts du…

Materials

10% Normal Goat Serum	VWR	100504-028	For blocking buffer
2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium	Medline	MDS090735
25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle	Fishcer Scientific	14824663	Syringes used to inject biomaterials
25uL Positive displacement pipette	Gilson	M-25
2x Beam Expander, 400-650nm	Thorlabs	GBE02-A	Laser beam expander
Adjustable Stage Platform	Kopf Instruments	901
Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit	Abcam	ab113435
Anti-Iba1 Antibody, goat	abcam	ab5076
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12"	Medsupply	367294	For perfusions
BKF12- Matte Black Aluminum Foil	Thorlabs	BKF12	To cover anything that is reflective when using laser.
Bone Iris Mini Scissors – 3-1/2"	Sklar surgical instruments	64-2035
C57BL/6 Mice	Jackson Laboratory	000664	8-12 weeks of age
Cage Assembly Rob	Thorlabs	ER3-P4	3" Long, diameter 6mm, 4 pack – for attaching laser to sterotax
Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter	Fine Science Tools	19007-05	For creating burr hole
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate	VWR	EM1.01036.0250
Compact Controller for pigtailed lasers	Thorlabs	CLD1010LP
Cotton Swabs	VWR	89031-288
CP 25 pipette tips	Gilson	F148012
Donkey anti-goat IgG H&L (488)	abcam	ab150129
Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647)	abcam	ab150075
Donkey Anti-rat IgG H&L (555)	abcam	ab150154
EMS DPX Mountant	Elecron Microscopy Sciences	13512	Mounting solution for slides
EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom	Electron Microscopy Sciences	16564	For gelatin coating slides
EMS Paraformaldehyde, Granular	VWR	100504-162	For making 45 PFA
ESD Worstation kit	Elmstat	WSKK5324SB	Need for setting up the laser
Fiber Bench Wall Plate, unthreaded	Thorlabs	HCA3	Need for connecting laser to Kopf shaft
FiberPort	Thorlabs	PAF-X-5-A	FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm
Fine Scissors – straight/sharp-blunt/10cm	Fine Science Tools	14028-10
GFAP Antibody, rat	Thermo Fisher Scientific	13-0300
Heating Plate	Kopf Instruments	HP-4M
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	H-4000	For staining slides
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center	VetEquip	901808
Iodine Prep Pads	Medx Supple	MED MDS093917H
Jewlers Forceps #5	GFS chemicals	46085
Laser Safety Glasses	Thorlabs	LG10B	Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too)
M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck	United Scope	LED-11C
Medical USP Grade Oxygen	Airgas	OX USP250
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade	Intefra Miltex	V96-118
Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer	Harvard aparatus	72-6110
Mini-pump variable flow	Thomas Scientific	70730-064	Pump for perfusions
Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm	Kent Scientific	RBMA-200c	For TTC slices
Mouse Gas Anethesia Head Holder	Kopf Instruments	923-B
Nanojet Control Box	Chemyx	10050
Nanojet pump header	Chemxy	10051	Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial
Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch	Fishcer Scientific	NC9459562
Non-rupture ear bars 60º	Kopf Instruments	922
PBS buffer pH 7.4	VWR	97062 338
Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin	Thorlabs	LP520-MF100
Positive charge glass slides	Hareta	AHS90-WH
Power engergy meter	Thorlabs	PM100D	Used to measure your mW laser output
Puralube Vet Ointment	Dr. Foster Smith	9N-76855
Rectal Probe Mouse	kopf Instruments	Ret-3-ISO
Rose Bengal Dye 95%	Sigma-Aldrich	330000-5G
Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth	Kopf Instruments	1770-02	For connecting laser to sterotaxic device
Slim photodiode power sensor	Thorlabs	S130VC	Used with power energy meter
SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining	Thorlabs	CP02	For connecting laser expander
Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL	VWR	10002-726	To inject rose bengal
StainTray Slide Staining System	Simport Scientific	M920-2	For staining slides
Sterotaxic device	Kopf Instruments	940	Small Animal Stereotaxic Instrument
Student Adson Forceps -1×2 teeth	Fine Science Tools	91127-12
Student Fine Forceps – straight/broad Shanks	Fine Science Tools	91113-10
Temperature Controller	Kopf Instruments	TCAT-2LV
Tissue-Tek OCT compound	VWR	25608-930
Triton X-100	VWR	97063-864
Upper Bracket Clamp	Kopf Instruments	1770-c	For connecting laser to sterotaxic device
Vetbond Tissue Adhessive 3mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-361931
Vogue Professional My Manicurist	Bargin Source	6400	For Burrs
VWR Bead Sterilizers	VWR	75999-328
Tissue Tek OCT compound	Sakura	4583	For tissue embeding