İnme, minimal tedavi seçenekleri olan ve kaybedilen beyin dokusunu yenilemek için mevcut klinik tedavinin olmadığı küresel bir sorundur. Burada kemirgenlerin motor korteksinde hassas fototropotik inme oluşturma yöntemlerini ve daha sonra inmeden sonra doku yenilenmesi üzerindeki etkilerini incelemek için hidrojel biyomalzemelerin enjeksiyonunu açıklıyoruz.
İnme, amerika birleşik devletleri’nde engelliliğin ve beşinci önde gelen ölüm nedeninin başındadır. Tüm inmelerin yaklaşık % 87’si iskemik inmelerdir ve beyne kan sağlayan bir damarın ani tıkanma olarak tanımlanır. Tıkanmaya dakikalar kala hücreler ölmeye başlar ve onarılamaz doku hasarına neden olarak ortaya çıkan hücrelerdir. Mevcut terapötik tedaviler, reperfüzyona izin vermek ve daha ciddi beyin hasarını önlemek için pıhtı giderme veya lizise odaklanır. Geçici beyin plastisitesi zamanla hasarlı dokunun bir kısmını kurtarsa da, hastaların önemli bir kısmı asla çözülmeyecek nörolojik eksikliklerle baş başa kalır. İnmenin neden olduğu nörolojik açıkları tedavi etmek için terapötik seçeneklerin eksikliği vardır ve bu artan hasta popülasyonunun tedavisi için yeni stratejiler geliştirilmesi gerektiğini vurgular. Enjekte edilebilir biyomalzemeler şu anda aktif ajanların veya kök hücrelerin teslimi yoluyla beyin plastisitesini artırmak ve endojen onarımı iyileştirmek için tasarlanmıştır. Bu yaklaşımları test etmek için bir yöntem, bir kemirgen inme modeli kullanmak, biyomalzemeyi inme çekirdeğine enjekte etmek ve onarımı değerlendirmektir. İnme sonrası doğru tedavi için inme çekirdeğinin kesin yerini bilmek zorunludur, bu nedenle enjeksiyondan önce görüntüleme ihtiyacını önlemek için öngörülebilir bir inme konumu ile sonuçlanan bir inme modeli tercih edilir. Aşağıdaki protokol, fototropotik inmenin nasıl teşvik edeceğini, bir hidrojenin kontrollü ve hassas bir şekilde nasıl enjekte edeceğini ve biyomalzemeyi sağlam tutarken beynin nasıl çıkarılacağını ve kriyoseksiyon yapılacağını kapsayacaktır. Ek olarak, bu aynı hidrojel malzemelerin kök hücrelerin birlikte teslimi için nasıl kullanılabileceğini vurgulayacağız. Bu protokol, inme çekirdeğine diğer enjekte edilebilir biyomalzemelerin kullanımına genelleştirilebilir.
İnme, amerika Birleşik Devletleri’nde engelliliğin önde gelen nedeni ve beşinci ölüm nedenidir1. Tüm inmelerin yaklaşık% 87’si iskemiktir, geri kalan% 13’ünün çoğunluğu hemorajik2 ‘dir. İskemik inme, bir arterdeki kan akışının çevre dokuya tıkanması olarak tanımlanır. Bu tıkanıklık, hayatta kalan hastalarda sıklıkla kalıcı sakatlığa yol açan oksijen yoksunluğu ve sonraki nekroz ile sonuçlanır. İnme ölüm oranında bir azalma olsa da3, yaygınlığının 2030 yılına kadar 3,4 milyon kişiye çıkması bekleniyor4. Engelli hayatta kalanlardaki bu artış ve buna bağlı olarak ekonomik yük, sinirsel onarım mekanizmalarına odaklanan inme araştırmaları için bir itmeye yol açmıştır. İnmenin ardından, nekrotik bölgenin genişlemesini önleyen bir yara izi oluşumuna yol açan enflamatuar bir dönem vardır. Nekrotik çekirdeği çevreleyen bölge “peri-enfarktüs” olarak ad altındadır ve artan anjiogenez, nörogenez ve aksonal filizlenmeyi içeren bu bölgedeki plastisitenin hayvan modellerinde ve insanlarda gözlenen iyileşme ile doğrudan bağlantılı olduğuna dair güçlü bir kanıt vardır5. İnmeden sonraki karmaşık etkileşimleri düzgün bir şekilde kopyalayabilen in vitro modeller olmadığından, inme araştırmaları için hayvan modelleri gereklidir.
İskemik inme üretmek için kullanılabilecek birkaç in vivo model vardır. Farelerde kullanılan en yaygın modellerden biri, distal veya proksimal (intra-arteriyel filament yoluyla) tıkanıklık yoluyla orta serebral arter tıkanıklığı veya MCAo’dur. Filament MCAo (fMCAo) olarak da bilinen proksimal model, tipik olarak, faktör sayısına bağlı olarak, serebral yarımkürenin% 5 ila% 50’sini kapsayan büyük iskemik inmelerle sonuçlanır6. Bu modellerde, bir dikiş veya filament iç şahdamarından orta serebral arterin (MCA) tabanına ilerletilir ve belirli bir süre yerinde tutulur. Geçici veya kalıcı hale getirilebilen bu tıkanıklık yöntemi, striatum merkezli bir enfarktüs üretir ve korteksin aşırıya bulaştırılmasını içerebilir veya içermeyebilir6. Elde edilen kontur boyutu oldukça değişkendir ve her farede prosedürün etkinliğini doğrulamak için lazer doppler gibi görüntüleme teknikleri gereklidir. 30 dakikadan uzun süren intra-arteriyel veya intra-luminal filament tıkanıklığı, boyut aralığının daha büyük ucunda vuruşlar üretir. Bazı araştırmacılar, önemli deneysel odaklanma ve laboratuvar doğrulaması gerektiren daha kısa filament tıkanma sürelerine odaklanmıştır7. Farelerdeki Filament MCAo modelleri, insan inme vakalarında görüldüğü gibi hücre ölümünün, iskemik ilerlemenin ve peri-enfarktüs bölgesinin oluşumunun benzer aşamalarını izler; bununla birlikte, daha büyük inmeler, daha az yaygın, daha az tedavi edilebilir insan inmeleri olan malign serebral enfarktüslerin hastalık durumuna daha yakından benzer6. Bu arada distal MCA tıkanıklığı daha ilgili bir ameliyat ve kraniektomi gerektirir. Bu modelde, MCA’nın beynin yüzeyi boyunca uzanan distal kısmı doğrudan bir dikiş bağı veya koterizasyon ile tıkanır. Tekniğin bazı varyasyonlarında, şahdamarları tek taraflı veya geçici olarak çift taraflı olarak tıkanır. Distal MCAo’nun bir yararı, filament modelinden daha az değişken boyutta kortikal tabanlı bir inme üretmesidir. Bununla birlikte, distal model, fMCAo6ile de ilgili bir endişe olan dış şahdamarının (ECA) transeksiyon nedeniyle daha zayıf davranışsal çıktı üretir.
Daha az invaziv olmasıyla bilinen alternatif bir kontur modeli fototropombotik (PT) modeldir. PT modeli iyi tanımlanmış bir iskemi yeri ile sonuçlanır ve yüksek sağkalım oranı8ile ilişkilidir. Teknik, intraperitoneal olarak enjekte edilen ve intravasküler foto-oksidasyona izin veren ışığa duyarlı bir boyaya dayanır, sadece istenen dokuyu bir ışık veya lazerle ışınlayarak9. Eksitasyondan sonra, ışınlanan bölgede trombosit toplama ve pıhtı oluşumunu aktive eden endotel hasarına neden olan oksijen radikalleri oluşur8,9. Strok boyutu ve konumu üzerindeki sıkı kontrolün yanı sıra PT modelinin yüksek tekrarlanabilirliği, biyomalzemelerin incelenmesi için idealdir. Lazer ve stereotaksik koordinatlar kullanılarak hassasiyet mümkün olsa da, bu modeli birkaç çalışma için daha az ideal hale getirebilecek bazı dezavantajlar vardır. fMCAo modelinin aksine, PT kontur modeli yeniden çürütülemez. Bu nedenle, reperfüzyondan sonraki hasarlara veya reperfüzyonu takip eden mekanizmalara özgü nöroprotektif ajanların araştırılması için malzemeler burada yararlı olmayacaktır8. Ek olarak, PT modelinin mikrovasküler hakareti nedeniyle nispeten küçük iskemik penumbra görülür. Bunun yerine, insan inmesi için karakteristik olmayan lokal vazojenik ödem oluşur, bu da bu modeli peri-enfarktüs alanı6,8’eodaklanan preklinik ilaç çalışmaları için istenmeyen hale getirir.
İnmede biyomalzeme stratejilerinin genel amacı ya biyoaktif ajanlar sunmak ya da beyin dokusu büyümesi için hücre dışı bir matris olarak hareket etmektir. Yöntemlerimizi kullanarak araştıracağımız bir strateji, birçok mevcut hücre tedavilerinin verildiği peri-enfarktüs dokusunun aksine, hidrojel’i doğrudan inme çekirdeğine teslim etmektir10. Bu yaklaşımın gerekçesi, çekirdekte bulunan nekrotik dokuya doğumun çevredeki sağlıklı veya iyileşen dokuyu bozmaktan kaçınacağıdır. Biyomalzemeye dahil olan herhangi bir aktif ajanın difüzyonunun çekirdekten peri-enfarktüse ulaşabileceğini varsayıyoruz, özellikle hidrojel biyomalzemelerin teslimatının glial skarın kalınlığını azalttığını bulduğumuz için11. Peri-enfarktüs bölgesinin inmeden sonra nöroplastisite gösterdiği ve çekici bir hedef haline getirdiği için bu önemlidir. Ayrıca, inme çekirdeğine bir taşıyıcı matrisin teslimi, yeni dokunun oluşumuna rehberlik etmek için anjiyojenik12 veya nörojenik13 faktörle ve doğum için hücrelerle yüklenebilir14. Hücre teslimi bir matris kullanılarak büyük ölçüde geliştirilmiştir, çünkü hücreleri teslimat sırasında mevcut olan sert enjeksiyon kuvvetlerinden ve yerel ortamdan korur, ayrıca farklılaşmayı ve engraftment15’iteşvik eder.
Bu enjekte edilebilir terapötik biyomalzemeler inme uygulamalarında klinik öneme sahiptir, çünkü şu anda inmeden sonra nöronal iyileşmeyi uyaran tıbbi tedaviler yoktur. İyileşmede yer alan altta yatan sinir devreleri inme çekirdeğine bitişik beyin dokusunda yatmaktadır16İnme çekirdeğinin kendisi canlı sinir dokusundan yoksundur. Nekrotik inme çekirdeğine biyomalzeme verilmesinin, büyüme faktörlerinin depo salınımı 13 , büyümedeki dokunun uyarılması ve iyileşen beyin dokusu gelişiminin teşviki11 , 12, immün yanıtların değiştirilmesi17ve kök hücre türevi terapötiklerin verilmesi14, 18. Bununla birlikte, bu uygulamaların olasılığını etkili bir şekilde incelemek için, inmeyi teşvik etmek ve biyomalzeme enjekte etmek için tutarlı ve tekrarlanabilir bir yönteme ihtiyaç vardır. PT kontur modeli, konturun yönü ve konumu üzerinde hassas kontrol sağlayan teknikler kullanır. Stereotaksik cihaza bağlı bir lazer yönlendirmelere rehberlik eder ve stereotaksik cihazlara bağlı pompalar, ek görüntüleme formlarına gerek kalmadan malzemenin enjeksiyon oranını kontrol eder. Bu nedenle, farelerin motor kortekslerinde PT inme yapma ve inme çekirdeğine biyomalzeme enjekte etme yöntemlerini tanımlamayı seçtik. Burada, ilave hücre veya büyüme faktörü olmadan enjeksiyon için biyomalzeme olarak mikro gözenekli tavlanmış parçacık (MAP) hidrojelleri kullanıyoruz. Ek olarak, beynin sağlam biyomalzeme ile nasıl başarılı bir şekilde alınacağını açıklıyoruz ve inme sonucunu biyomalzeme enjeksiyonu ile ve enjeksiyonu olmadan analiz etmek için kullanılan immün entrika testlerini tartışıyoruz.
Burada kolayca tekrarlanabilir, minimal invaziv, kalıcı bir inme modeli gösteriyoruz ve inmeden beş gün sonra enfarktüse nasıl biyomalzeme enjekte edeceğimizi açıklıyoruz. Fototropombotik boya Rose Bengal ve stereotaksik cihaza bağlı 520 nm kolimli lazer kullanımı bize inmeyi farenin motor korteksine gelişmiş hassasiyetle konumlandırma yeteneği verir. İnmeden beş gün sonra, enfarktüsün yeri ışınlamanın merkezinde gözle görülebilir, bregma için 2.0 mm vasat yanal. Hidrojel daha sonra şır?…
The authors have nothing to disclose.
Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü’nü finanse etmek için kabul etmek istiyoruz (R01NS079691).
10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
Bone Iris Mini Scissors – 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack – for attaching laser to sterotax |
Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
Fine Scissors – straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
Student Adson Forceps -1×2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
Student Fine Forceps – straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |