脳卒中後の脳へのヒドロゲルバイオマテリアル足場の注入
Summary
脳卒中は、最小限の治療オプションと失われた脳組織を再生するための現在の臨床療法のない世界的な問題です。ここでは、げっ歯類の運動皮質における正確な光血栓性脳卒中を作成し、その後のヒドロゲル生体材料の注入を行い、脳卒中後の組織再生に及ぼす影響を研究する方法を説明する。
Abstract
脳卒中は障害の主な原因であり、米国における死亡原因の第5位である。脳卒中の約87%は虚血性脳卒中であり、脳に血液を供給する血管の突然の閉塞と定義されています。閉塞の数分以内に、細胞は死に始め、回復不可能な組織損傷をもたらす。現在の治療は、再灌流を可能にし、より深刻な脳損傷を防ぐために血栓除去またはリシスに焦点を当てています。一過性の脳可塑性は、時間の経過とともに損傷した組織の一部を救う可能性がありますが、患者のかなりの部分は決して解決しない神経学的欠陥を残しています。脳卒中によって引き起こされる神経学的欠陥を治療するための治療オプションの欠如があり、この増加する患者集団を治療するための新しい戦略を開発する必要性を強調している。注射可能な生体材料は現在、脳の可塑性を高め、活性薬剤または幹細胞の送達を通じて内因性修復を改善するように設計されている。これらのアプローチをテストする1つの方法は、げっ歯類のストロークモデルを利用し、生体材料をストロークコアに注入し、修復を評価することです。脳卒中後の正確な治療にはストロークコアの正確な位置を知ることが不可欠であり、したがって、射出前のイメージングの必要性を避けるために、予測可能なストローク位置をもたらすストロークモデルが好ましい。次のプロトコルは、フォトトロンボミックストロークを誘導する方法、制御された正確な方法でヒドロゲルを注入する方法、および生体材料をそのまま維持しながら脳を抽出し、凍結する方法をカバーします。また、これらと同じヒドロゲル材料を幹細胞の共送にどう使うことができるかを強調します。このプロトコルは、ストロークコアに他の注射可能な生体材料を使用するように一般化することができる。
Introduction
脳卒中は障害の主な原因であり、米国における死因の第5位である。全脳卒中の約87%が虚血性であり、残りの13%の大部分は出血性2である。虚血性脳卒中は、周囲の組織への動脈の血流の閉塞として定義される。この閉塞は、酸素欠乏とその後の壊死をもたらし、しばしば生き残った患者の永久的な障害につながる。脳卒中3の死亡率は減少しているが、その罹患率は2030年4年までに340万人に増加すると予想されている。この障害を持つ生存者の増加とそれに伴う経済的負担は、神経修復のメカニズムに焦点を当てた脳卒中研究の推進につながっています。脳卒中の後には、壊死領域の拡大を妨げる瘢痕の形成につながる炎症期がある。壊死性コアを取り巻く領域は「梗塞周囲」と呼ばれ、血管新生の増加、神経新生、および軸索発芽を含むこの領域の可塑性が、動物モデルおよびヒト5での観察された回復に直接関連しているという強い証拠がある。脳卒中後の複雑な相互作用を適切に再現できるインビトロモデルがないため、脳卒中の研究には動物モデルが不可欠です。
虚血性脳卒中を作り出すために使用することができるいくつかのin vivoモデルがある。マウスで使用される最も一般的なモデルの1つは、中大脳動脈閉塞(MCAo)が遠位または近位(動脈内フィラメントを介して)閉塞を介してである。近位モデルはフィラメントMCAo(fMCAo)としても知られており、通常、大脳半球の5%から50%を包含する大きな虚血性脳卒中をもたらし、因子数6に依存する。これらのモデルでは、縫合またはフィラメントが中大脳動脈(MCA)の基部に頸動脈の内部から進み、一定期間所定の位置に保たれる。この閉塞の方法は、一時的または永久的に作ることができるが、線条体を中心とする梗塞を生じ、皮質6を覆うことを伴う場合も、関与しないかもしれない。得られたストロークサイズは非常に可変であり、レーザードップラーなどのイメージング技術は、各マウスにおける手順の有効性を確認するために必要とされる。30分以上続く動脈内または発光フィラメント閉塞は、サイズ範囲の大きな端部でストロークを生成します。一部の研究者は、実質的な実験的焦点と実験室検証7を必要とするフィラメント閉塞時間の短縮に焦点を当てています。マウスのフィラメント MCAo モデルは、同様の段階の細胞死、虚血性進行、およびヒト脳卒中症例に見られる梗塞部の形成に従います。しかし、大きな脳卒中は悪性脳梗塞の疾患状態によく似ており、これはあまり一般的ではなく、治療が少ない人間の脳卒中6である。一方、遠位MCA閉塞は、より関与する手術とクラニエクトミーを必要とする。このモデルでは、脳の表面に沿って走るMCAの遠位部分は、縫合結または焼灼で直接閉塞される。この技術のいくつかのバリエーションでは、頸動脈は一方的または一時的に二国間閉塞である。遠位MCAoの利点は、フィラメントモデルよりもサイズが小さい皮質ベースのストロークを生成することです。しかし、遠位モデルは、外的頸動脈(ECA)の斜離による悪い行動出力を生じるが、これはfMCAo6にも懸念される。
侵襲性が低いという別のストロークモデルは、フォトトロンボティック(PT)モデルです。PTモデルは虚血の明確な位置をもたらし、高い生存率8と関連している。この技術は、光またはレーザー9で所望の組織を照射するだけで血管内光酸化を可能にする腹腔内に注入された感光性色素に依存する。興奮すると、内皮損傷を引き起こす酸素ラジカルが形成され、照射領域8,9における血小板凝集および血栓形成を活性化する。ストロークの大きさや位置を厳しく制御し、PTモデルの再現性が高いため、生体材料の研究に最適です。レーザーと立体的な座標を使用して精度を実現できますが、このモデルを少数の研究にはあまり理想的にしないかもしれないいくつかの欠点があります。fMCAo モデルとは異なり、PT ストローク モデルは再設定できません。したがって、再灌流後の損傷に特異的な神経保護剤や再灌流後の機構を調査するための材料は、ここでは有用ではないであろう8.さらに、PTモデルの微小血管侮辱のために、比較的小さい虚血性陰茎が見られる。その代わりに、局所的な血管形成性浮腫が生じ、これはヒトの脳卒中に対して特徴を有せず、梗塞周辺領域6,8に焦点を当てた前臨床試験ではこのモデルは望ましくない。
脳卒中の生体材料戦略の全体的な目標は、生理活性剤を提供するか、脳組織の成長のための代理細胞外マトリックスとして機能することです。我々の方法を用いて探求する1つの戦略は、多くの現在の細胞療法が10に送達される梗塞周辺組織とは対照的に、ヒドロゲルをストロークコアに直接送達することである。このアプローチの根拠は、コアに見られる壊死組織への送達が周囲の健康または回復組織を破壊することを避けることである。我々は、生体材料内に含まれる任意の活性剤の拡散がコアから梗塞の下に到達することができると仮定し、特にヒドロゲル生体材料の送達は、グリア瘢痕11の厚さを減少させることを発見した。これは、梗塞後の神経可塑性を示すことが示されているので、これは重要であり、魅力的な標的となっています。さらに、ストロークコアへの代理マトリックスの送達には、血管新生12 または神経原性13 因子を装填して、新しい組織の形成を誘導し、また送達用細胞14を装うことができる。細胞送達は、送達中に存在する過酷な注入力や局所環境から細胞を保護し、また分化及び生着を促進するのでマトリックスを用いて大きく増強される。
これらの注射可能な治療用バイオマテリアルは、脳卒中後の神経回復を刺激する医療療法がないため、脳卒中の適用に臨床的関連性を有する。回復に関与する基礎となる神経回路は、脳卒中コア16に隣接する脳組織にあり、脳卒中コア自体には実行可能な神経組織が欠けている。壊死性脳卒中コアに生体材料を送達することは、成長因子13のデポ放出、成長中の組織の刺激、脳組織の回復の促進を含む多くのメカニズムを通じて、回生プロセスに向けて隣接組織を刺激する可能性があると予想する。 18.しかし、これらの応用の可能性を効果的に研究するためには、脳卒中を誘導し、生体材料を注入するための一貫した、再現性のある方法が必要である。PT ストローク モデルでは、ストロークの向きと位置を正確に制御できる手法を使用します。ステレオタキシックデバイスに取り付けられたレーザーは、向きを導き、立体装置に取り付けられたポンプは、画像化の追加の形態を必要とせずに材料の射出速度を制御する。そこで、マウスの運動皮質でPTストロークを行う方法や、生体材料をストロークコアに注入する方法を説明することを選択しました。ここでは、細胞や成長因子を加えずに注入するための生体材料として、微孔性アニール粒子(MAP)ヒドロゲルを使用します。また、生体材料をそのまま脳に取り出す方法を説明し、生体材料の注入の有無にかかわらず脳卒中の結果を分析するための免疫化学アッセイについて議論する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、簡単に再現可能で、低侵襲、永久的な脳卒中モデルを示し、脳卒中の5日後に梗塞に生体材料を注入する方法を説明します。フォトトロンボティック色素ローズベンガルとステレオタックシックデバイスに接続された520 nmコリメートレーザーの使用は、私たちに強化された精度でマウスの運動皮質にストロークを配置する能力を与えます。脳卒中の5日後、梗塞の位置は、照射の中?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、国立衛生研究所と国立神経疾患・脳卒中研究所の資金提供を認めたいです(R01NS079691)。
Materials
| 10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
| 2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
| 25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
| 25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
| 2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
| Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
| Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
| Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
| BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
| Bone Iris Mini Scissors – 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
| Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack – for attaching laser to sterotax |
| Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
| Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
| Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
| Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
| CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
| Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
| Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
| Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
| EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
| EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
| ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
| Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
| FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
| Fine Scissors – straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
| IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
| Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
| Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
| Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
| M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
| Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
| Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
| Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
| Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
| Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
| Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
| Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
| Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
| Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
| Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
| PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
| Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
| Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
| Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
| Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
| Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
| Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
| Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
| SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
| Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
| StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
| Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
| Student Adson Forceps -1×2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Student Fine Forceps – straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
| Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
| Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
| Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
| VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
| Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |
References
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