Injeção de andaimes biomaterial de hidrogel no cérebro após o derrame

Summary

O AVC é um problema global com opções mínimas de tratamento e nenhuma terapia clínica atual para regenerar o tecido cerebral perdido. Aqui descrevemos métodos para criar um derrame fototrombótico preciso no córtex motor de roedores e posterior injeção de biomateriais de hidrogel para estudar seus efeitos na regeneração tecidual após o acidente vascular cerebral.

Abstract

O AVC é a principal causa de incapacidade e a quinta principal causa de morte nos Estados Unidos. Aproximadamente 87% de todos os derrames são derrames isquêmicos e são definidos como o bloqueio repentino de um vaso que fornece sangue ao cérebro. Poucos minutos após o bloqueio, as células começam a morrer e resultam em danos irreparáveis aos tecidos. Os tratamentos terapêuticos atuais se concentram na remoção do coágulo ou na lise para permitir a reperfusão e prevenir danos cerebrais mais graves. Embora a plasticidade cerebral transitória possa salvar parte do tecido danificado ao longo do tempo, frações significativas de pacientes são deixadas com déficits neurológicos que nunca se resolverão. Faltam opções terapêuticas para tratar déficits neurológicos causados pelo AVC, enfatizando a necessidade de desenvolver novas estratégias para tratar essa crescente população de pacientes. Os biomateriais injetáveis estão sendo projetados para melhorar a plasticidade cerebral e melhorar o reparo endógeno através da entrega de agentes ativos ou células-tronco. Um método para testar essas abordagens é utilizar um modelo de curso de roedor, injetar o biomaterial no núcleo do traçado e avaliar o reparo. Saber a localização precisa do núcleo do avc é imperativo para o tratamento preciso após o derrame, portanto, um modelo de derrame que resulte em um local previsível de derrame é preferível para evitar a necessidade de imagem antes da injeção. O protocolo a seguir abordará como induzir um derrame fototrombótico, como injetar um hidrogel de forma controlada e precisa, e como extrair e criosecção do cérebro enquanto mantém o bioma material intacto. Além disso, vamos destacar como esses mesmos materiais de hidrogel podem ser usados para a co-entrega de células-tronco. Este protocolo pode ser generalizado para o uso de outros biomateriais injetáveis no núcleo do traçado.

Introduction

O AVC é a principal causa de incapacidade e a quinta principal causa de morte nos Estados Unidos¹. Aproximadamente 87% de todos os derrames são isquêmicos, enquanto a maioria dos 13% restantes são hemorrágicos². Um derrame isquêmico é definido como o bloqueio do fluxo sanguíneo em uma artéria para o tecido circundante. Essa oclusão resulta em privação de oxigênio e necrose subsequente que muitas vezes leva à incapacidade permanente em pacientes sobreviventes. Embora tenha havido uma diminuição na taxa de mortalidade por acidente vascular cerebral³, espera-se que sua prevalência aumente para 3,4 milhões de pessoas até 2030⁴. Esse aumento de sobreviventes com deficiência e consequente carga econômica levou a um impulso para a pesquisa de derrame que se concentra em mecanismos de reparação neural. Após o AVC há um período inflamatório que leva à formação de uma cicatriz que impede a expansão da região necrótica. A região em torno do núcleo necrosado é chamada de “peri-infarto” e há fortes evidências de que a plasticidade nesta região, que inclui o aumento da angiogênese, neurogênese e broto axonal, está diretamente ligada à recuperação observada em modelos animais e humanos⁵. Como não existem modelos in vitro que possam replicar adequadamente as interações complexas após o AVC, os modelos animais são essenciais para a pesquisa de avc.

Existem vários modelos in vivo que podem ser usados para produzir derrame isquêmico. Um dos modelos mais comuns utilizados em camundongos é a oclusão da artéria cerebral média, ou MCAo, através da oclusão distal ou proximal (via filamento intra-arterial). O modelo proximal, também conhecido como filamento MCAo (fMCAo), normalmente resulta em grandes derrames isquêmicos que abrangem entre 5% e 50% do hemisfério cerebral, dependentes do número de fatores⁶. Nesses modelos, uma sutura ou filamento é avançada da artéria carótida interna para a base da artéria cerebral média (MCA) e mantida no lugar por um período específico de tempo. Este método de oclusão, que pode ser feito temporário ou permanente, produz um infarto centrado no estriado e pode ou não envolver o córtex⁶. O tamanho resultante do acidente vascular cerebral é altamente variável, e técnicas de imagem, como doppler laser, são necessárias para confirmar a eficácia do procedimento em cada rato. A oclusão de filamento intra-arterial ou intra-luminal que dura mais de 30 minutos produz traços na extremidade maior da faixa de tamanho. Alguns investigadores se concentraram em tempos de oclusão de filamentos mais curtos, que requerem foco experimental substancial e validação laboratorial⁷. Os modelos de Filamento MCAo em camundongos seguem estágios semelhantes de morte celular, progressão isquêmica e formação de uma região peri-infarto, como visto em casos de derrame humano; no entanto, os derrames maiores se assemelham mais ao estado da doença de infartos cerebrais malignos, que são menos comuns, menos tratáveis derrames humanos⁶. Enquanto isso, a oclusão distal da MCA requer uma cirurgia mais envolvida e craniectomia. Neste modelo, a parte distal do MCA que corre ao longo da superfície do cérebro é diretamente ocluída com uma gravata de sutura ou cauterização. Em algumas variações da técnica, as artérias carótidas são unilateralmente ou transitoriamente ocluídas bilateralmente. Um benefício do MCAo distal é que ele produz um curso de base cortical que é menos variável em tamanho do que o modelo de filamento. No entanto, o modelo distal produz uma produção comportamental mais pobre devido à transeção da artéria carótida externa (ECA), que também é uma preocupação com o FMCAo⁶.

Um modelo alternativo de avc que é conhecido por ser menos invasivo é o modelo fototrombótico (PT). O modelo PT resulta em um local bem definido de isquemia e está associado a uma alta taxa de sobrevivência⁸. A técnica conta com um corante fotosensitivo injetado intraperitoneally que permite a fotoper oxidação intravascular simplesmente irradiando o tecido desejado com uma luz ou laser⁹. Após a excitação, forma-se radicais de oxigênio que causam danos endoteliais, que ativam a agregação de plaquetas e a formação de coágulos na área irradiada^8,9. O controle rigoroso sobre o tamanho e a localização do traçado, bem como a alta reprodutibilidade do modelo PT, torna-o ideal para estudar biomateriais. Embora a precisão seja possível usando um laser e coordenadas estereotaxas, existem algumas desvantagens que podem tornar este modelo menos ideal para poucos estudos. Ao contrário do modelo fMCAo, o modelo de traçado PT não pode ser reperrido. Portanto, materiais para investigar agentes neuroprotetores específicos para danos após a reperfusão ou os mecanismos após a reperfusão não seriam úteis aqui⁸. Além disso, devido ao insulto microvascular do modelo PT, é vista penumbra isquêmica relativamente pequena. Em vez disso, ocorre o edema vasogênico local, que não é característico do AVC humano, tornando este modelo indesejável para estudos de drogas pré-cínicas focados na área peri-infarto^6,8.

O objetivo geral das estratégias de biomateriais no AVC é entregar agentes bioativos ou atuar como uma matriz extracelular substituta para o crescimento do tecido cerebral. Uma estratégia que vamos explorar usando nossos métodos é entregar hidrogel diretamente no núcleo do avc, em oposição ao tecido peri-infarto onde muitas terapias celulares atuais são fornecidas¹⁰. A justificativa para essa abordagem é que o parto no tecido necrosado encontrado no núcleo evitará interromper o tecido saudável ou em recuperação do ambiente. Assumimos que a difusão de quaisquer agentes ativos incluídos no bioma material será capaz de atingir o peri-infarto do núcleo, especialmente porque descobrimos que a entrega de biomateriais de hidrogel reduz a espessura da cicatriz^{gliaria 11}. Isso é importante, uma vez que a região peri-infarto tem sido mostrada para exibir neuroplasticidade após o AVC, tornando-se um alvo atraente. Além disso, a entrega de uma matriz substituta ao núcleo do avc pode ser carregada com¹² ou¹³ fatores angiogênicos para orientar a formação de novos tecidos, bem como células para o parto¹⁴. A entrega celular é muito aprimorada usando uma matriz porque protege as células das duras forças de injeção e do ambiente local presentes durante a entrega, além de incentivar a diferenciação e o enxerto¹⁵.

Esses biomateriais terapêuticos injetáveis têm relevância clínica nas aplicações do AVC, pois atualmente não existem terapias médicas que estimulem a recuperação neuronal após o AVC. Os circuitos neurais subjacentes envolvidos na recuperação estão no tecido cerebral adjacente ao núcleo do traçado^16,enquanto o próprio núcleo do derrame é desprovido de tecido neural viável. Prevemos que a entrega de um biomamaterial no núcleo do avc necrosado tem potencial para estimular o tecido adjacente em direção a processos regenerativos através de uma série de mecanismos mencionados anteriormente, incluindo a liberação de fatores de crescimento^13,estimulação do tecido em crescimento e promoção da recuperação do desenvolvimento do tecido cerebral^11,12, alteração das respostas imunes¹⁷, e entrega de terapêuticas derivadas de células-tronco^{14, 18}. No entanto, para estudar efetivamente a possibilidade dessas aplicações, é necessário um método consistente e reprodutível para induzir derrame e injetar biomateriais. O modelo de traçado PT utiliza técnicas que oferecem controle preciso sobre a orientação e localização do curso. Um laser ligado ao dispositivo estereotaxic guia orientações, e bombas ligadas aos dispositivos estereotaxicos controlam a taxa de injeção do material sem a necessidade de formas adicionais de imagem. Por isso, optamos por descrever os métodos para a realização de um AVC PT nos córtex motor de camundongos e para injetar biomateriais no núcleo do curso. Aqui, usamos hidrogéis de partículas recadas microporosas (MAP) como o biomamaterial para injeção sem células adicionadas ou fatores de crescimento. Além disso, explicamos como recuperar com sucesso o cérebro com biomaterial intacto, e discutimos ensaios de imunoquímica usados para analisar o resultado do derrame com e sem injeção de biomateriais.

Protocol

Os experimentos foram realizados de acordo com o IUCAC na Duke University e na University of California Los Angeles. Neste estudo, foram utilizados camundongos C57Bl/6J masculinos de 8 a 12 semanas. Os animais foram alojados sob temperatura controlada (22 ± 2 °C), com um período de ciclo claro-escuro de 12 horas e acesso a alimentos e ad libitum de água. Os protocolos de analgesia e sedação são descritos como aprovados pelo IUCAC, mas podem diferir dos protocolos utilizados em outros laboratórios. <p class="j…

Representative Results

O objetivo deste método era demonstrar como injetar biomateriais no cérebro após o derrame. Um modelo fototrombótico com bengala rosa e um laser de 520 nm foi utilizado para orientação controlada da lesão do derrame tanto no tamanho quanto na localização. Cinco dias após o derrame, o infarto pôde ser visualizado durante a cirurgia(Figura 1B) e por TTC e imagens de lâminas manchadas de IHC(Figura 2). Um aumento no diâmetro do laser com uma lente 2x l…

Discussion

Aqui demonstramos um modelo de derrame facilmente reprodutível, minimamente invasivo e permanente e descrevemos como injetar um biomamaterial no infarto cinco dias após o derrame. O uso do corante fototrombotico Rose Bengala e um laser collimado de 520 nm conectado ao dispositivo estereotaxico nos dá a capacidade de posicionar o curso no córtex motor do mouse com precisão aprimorada. Cinco dias após o derrame, a localização do infarto é visível pelo olho no centro da irradiação, 2,0 mm medio-lateral para o br…

Materials

10% Normal Goat Serum	VWR	100504-028	For blocking buffer
2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium	Medline	MDS090735
25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle	Fishcer Scientific	14824663	Syringes used to inject biomaterials
25uL Positive displacement pipette	Gilson	M-25
2x Beam Expander, 400-650nm	Thorlabs	GBE02-A	Laser beam expander
Adjustable Stage Platform	Kopf Instruments	901
Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit	Abcam	ab113435
Anti-Iba1 Antibody, goat	abcam	ab5076
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12"	Medsupply	367294	For perfusions
BKF12- Matte Black Aluminum Foil	Thorlabs	BKF12	To cover anything that is reflective when using laser.
Bone Iris Mini Scissors – 3-1/2"	Sklar surgical instruments	64-2035
C57BL/6 Mice	Jackson Laboratory	000664	8-12 weeks of age
Cage Assembly Rob	Thorlabs	ER3-P4	3" Long, diameter 6mm, 4 pack – for attaching laser to sterotax
Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter	Fine Science Tools	19007-05	For creating burr hole
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate	VWR	EM1.01036.0250
Compact Controller for pigtailed lasers	Thorlabs	CLD1010LP
Cotton Swabs	VWR	89031-288
CP 25 pipette tips	Gilson	F148012
Donkey anti-goat IgG H&L (488)	abcam	ab150129
Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647)	abcam	ab150075
Donkey Anti-rat IgG H&L (555)	abcam	ab150154
EMS DPX Mountant	Elecron Microscopy Sciences	13512	Mounting solution for slides
EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom	Electron Microscopy Sciences	16564	For gelatin coating slides
EMS Paraformaldehyde, Granular	VWR	100504-162	For making 45 PFA
ESD Worstation kit	Elmstat	WSKK5324SB	Need for setting up the laser
Fiber Bench Wall Plate, unthreaded	Thorlabs	HCA3	Need for connecting laser to Kopf shaft
FiberPort	Thorlabs	PAF-X-5-A	FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm
Fine Scissors – straight/sharp-blunt/10cm	Fine Science Tools	14028-10
GFAP Antibody, rat	Thermo Fisher Scientific	13-0300
Heating Plate	Kopf Instruments	HP-4M
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	H-4000	For staining slides
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center	VetEquip	901808
Iodine Prep Pads	Medx Supple	MED MDS093917H
Jewlers Forceps #5	GFS chemicals	46085
Laser Safety Glasses	Thorlabs	LG10B	Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too)
M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck	United Scope	LED-11C
Medical USP Grade Oxygen	Airgas	OX USP250
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade	Intefra Miltex	V96-118
Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer	Harvard aparatus	72-6110
Mini-pump variable flow	Thomas Scientific	70730-064	Pump for perfusions
Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm	Kent Scientific	RBMA-200c	For TTC slices
Mouse Gas Anethesia Head Holder	Kopf Instruments	923-B
Nanojet Control Box	Chemyx	10050
Nanojet pump header	Chemxy	10051	Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial
Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch	Fishcer Scientific	NC9459562
Non-rupture ear bars 60º	Kopf Instruments	922
PBS buffer pH 7.4	VWR	97062 338
Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin	Thorlabs	LP520-MF100
Positive charge glass slides	Hareta	AHS90-WH
Power engergy meter	Thorlabs	PM100D	Used to measure your mW laser output
Puralube Vet Ointment	Dr. Foster Smith	9N-76855
Rectal Probe Mouse	kopf Instruments	Ret-3-ISO
Rose Bengal Dye 95%	Sigma-Aldrich	330000-5G
Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth	Kopf Instruments	1770-02	For connecting laser to sterotaxic device
Slim photodiode power sensor	Thorlabs	S130VC	Used with power energy meter
SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining	Thorlabs	CP02	For connecting laser expander
Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL	VWR	10002-726	To inject rose bengal
StainTray Slide Staining System	Simport Scientific	M920-2	For staining slides
Sterotaxic device	Kopf Instruments	940	Small Animal Stereotaxic Instrument
Student Adson Forceps -1×2 teeth	Fine Science Tools	91127-12
Student Fine Forceps – straight/broad Shanks	Fine Science Tools	91113-10
Temperature Controller	Kopf Instruments	TCAT-2LV
Tissue-Tek OCT compound	VWR	25608-930
Triton X-100	VWR	97063-864
Upper Bracket Clamp	Kopf Instruments	1770-c	For connecting laser to sterotaxic device
Vetbond Tissue Adhessive 3mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-361931
Vogue Professional My Manicurist	Bargin Source	6400	For Burrs
VWR Bead Sterilizers	VWR	75999-328
Tissue Tek OCT compound	Sakura	4583	For tissue embeding