Inyección de andamios de biomaterial de hidrogel en el cerebro después de un accidente cerebrovascular
Summary
El accidente cerebrovascular es un problema global con opciones de tratamiento mínimas y sin terapia clínica actual para regenerar el tejido cerebral perdido. Aquí describimos métodos para crear un accidente cerebrovascular fototrombótico preciso en la corteza motora de roedores y la posterior inyección de biomateriales de hidrogel para estudiar sus efectos sobre la regeneración de tejidos después del accidente cerebrovascular.
Abstract
El accidente cerebrovascular es la principal causa de discapacidad y la quinta causa principal de muerte en los Estados Unidos. Aproximadamente el 87% de todos los accidentes cerebrovasculares son accidentes cerebrovasculares isquémicos y se definen como el bloqueo repentino de un vaso que suministra sangre al cerebro. A los pocos minutos de la obstrucción, las células comienzan a morir y resultan en daños irreparables en los tejidos. Los tratamientos terapéuticos actuales se centran en la eliminación de coágulos o lisis para permitir la reperfusión y prevenir daños cerebrales más graves. Aunque la plasticidad cerebral transitoria puede salvar parte del tejido dañado con el tiempo, fracciones significativas de pacientes quedan con déficits neurológicos que nunca se resolverán. Existe una falta de opciones terapéuticas para tratar los déficits neurológicos causados por el accidente cerebrovascular, lo que enfatiza la necesidad de desarrollar nuevas estrategias para tratar a esta creciente población de pacientes. Los biomateriales inyectables se están diseñando actualmente para mejorar la plasticidad cerebral y mejorar la reparación endógena a través de la administración de agentes activos o células madre. Un método para probar estos enfoques es utilizar un modelo de accidente cerebrovascular de roedor, inyectar el biomaterial en el núcleo del accidente cerebrovascular y evaluar la reparación. Conocer la ubicación precisa del núcleo del accidente cerebrovascular es imperativo para el tratamiento preciso después del accidente cerebrovascular, por lo tanto, es preferible un modelo de accidente cerebrovascular que resulte en una ubicación predecible del accidente cerebrovascular para evitar la necesidad de imágenes antes de la inyección. El siguiente protocolo cubrirá cómo inducir un accidente cerebrovascular fototrombótico, cómo inyectar un hidrogel de manera controlada y precisa, y cómo extraer y crioseccionar el cerebro mientras se mantiene intacto el biomaterial. Además, destacaremos cómo estos mismos materiales de hidrogel se pueden utilizar para la co-entrega de células madre. Este protocolo se puede generalizar al uso de otros biomateriales inyectables en el núcleo del accidente cerebrovascular.
Introduction
El accidente cerebrovascular es la principal causa de discapacidad y la quinta causa principal de muerte en los Estados Unidos1. Aproximadamente el 87% de todos los accidentes cerebrovasculares son isquémicos, mientras que la mayoría del 13% restante son hemorrágicos2. Un accidente cerebrovascular isquémico se define como el bloqueo del flujo sanguíneo en una arteria al tejido circundante. Esta oclusión resulta en la privación de oxígeno y la necrosis posterior que a menudo conduce a la discapacidad permanente en los pacientes sobrevivientes. Si bien ha habido una disminución en la tasa de mortalidad del accidente cerebrovascular3,se espera que su prevalencia aumente a 3,4 millones de personas para 20304. Este aumento en los sobrevivientes discapacitados y la consiguiente carga económica ha llevado a un impulso para la investigación del accidente cerebrovascular que se centra en los mecanismos de reparación neuronal. Después del accidente cerebrovascular hay un período inflamatorio que conduce a la formación de una cicatriz que impide que la región necrótica se expanda. La región que rodea el núcleo necrótico se denomina “peri-infarto” y hay una fuerte evidencia de que la plasticidad en esta región, que incluye el aumento de la angiogénesis, la neurogénesis y la brotación axonal, está directamente relacionada con la recuperación observada en modelos animales y humanos5. Dado que no hay modelos in vitro que puedan replicar adecuadamente las interacciones complejas después del accidente cerebrovascular, los modelos animales son esenciales para la investigación del accidente cerebrovascular.
Hay varios modelos in vivo que se pueden utilizar para producir accidente cerebrovascular isquémico. Uno de los modelos más comunes utilizados en ratones es la oclusión de la arteria cerebral media, o MCAo, a través de la oclusión distal o proximal (a través del filamento intraarterial). El modelo proximal, también conocido como filamento MCAo (fMCAo), generalmente resulta en grandes accidentes cerebrovasculares isquémicos que abarcan entre el 5% y el 50% del hemisferio cerebral, dependiendo del número de factores6. En estos modelos, una sutura o filamento se avanza desde la arteria carótida interna hasta la base de la arteria cerebral media (MCA) y se mantiene en su lugar durante un período de tiempo específico. Este método de oclusión, que puede hacerse temporal o permanente, produce un infarto que se centra en el cuerpo estriado y puede o no implicar la corteza suprayacente6. El tamaño del accidente cerebrovascular resultante es muy variable, y se requieren técnicas de imagen, como el doppler láser, para confirmar la efectividad del procedimiento en cada ratón. La oclusión del filamento intraarterial o intraluminal que dura más de 30 minutos produce accidentes cerebrovasculares en el extremo más grande del rango de tamaño. Algunos investigadores se han centrado en tiempos de oclusión de filamentos más cortos, que requieren un enfoque experimental sustancial y validación de laboratorio7. Los modelos de MCAo de filamento en ratones siguen etapas similares de muerte celular, progresión isquémica y formación de una región periinfarto como se ve en los casos de accidente cerebrovascular humano; sin embargo, los accidentes cerebrovasculares más grandes se parecen más al estado de enfermedad de los infartos cerebrales malignos, que son menos comunes, menos tratables accidentes cerebrovasculares humanos6. Mientras tanto, la oclusión distal de MCA requiere una cirugía y una craniectomía más involucradas. En este modelo, la parte distal del MCA que corre a lo largo de la superficie del cerebro se ocluye directamente con una atadura de sutura o cauterización. En algunas variaciones de la técnica, las arterias carótidas se ocluyen unilateral o transitoriamente-bilateralmente. Un beneficio del MCAo distal es que produce un trazo basado en cortical que es menos variable en tamaño que el modelo de filamento. Sin embargo, el modelo distal produce una producción conductual más pobre debido a la transección de la arteria carótida externa (ECA), que también es una preocupación con fMCAo6.
Un modelo alternativo de accidente cerebrovascular que es conocido por ser menos invasivo es el modelo fototrombótico (PT). El modelo de PT da como resultado una localización bien definida de la isquemia y se asocia con una alta tasa de supervivencia8. La técnica se basa en un tinte fotosensible inyectado por vía intraperitoneal que permite la fotooxidación intravascular simplemente irradiando el tejido deseado con una luz o láser9. Tras la excitación, se forman radicales de oxígeno que causan daño endotelial, lo que activa la agregación plaquetaria y la formación de coágulos en el área irradiada8,9. El estricto control sobre el tamaño y la ubicación del trazo, así como la alta reproducibilidad del modelo PT, lo hacen ideal para estudiar biomateriales. Si bien la precisión es posible utilizando un láser y coordenadas estereotáxicas, hay algunas desventajas que pueden hacer que este modelo sea menos ideal para pocos estudios. A diferencia del modelo fMCAo, el modelo de carrera PT no se puede volver a perfundir. Por lo tanto, los materiales para investigar los agentes neuroprotectores específicos de los daños después de la reperfusión o los mecanismos posteriores a la reperfusión no serían útiles aquí8. Además, debido al insulto microvascular del modelo PT, se observa penumbra isquémica relativamente pequeña. En cambio, se produce edema vasogénico local, que no es característico del accidente cerebrovascular humano, lo que hace que este modelo sea indeseable para los estudios farmacológicos preclínicos centrados en el área del periinfarto6,8.
El objetivo general de las estrategias de biomateriales en el accidente cerebrovascular es administrar agentes bioactivos o actuar como una matriz extracelular sustituta para el crecimiento del tejido cerebral. Una estrategia que exploraremos utilizando nuestros métodos es administrar hidrogel directamente en el núcleo del accidente cerebrovascular, a diferencia del tejido periinfarto donde se administran muchas terapias celulares actuales10. La justificación de este enfoque es que la entrega en el tejido necrótico que se encuentra en el núcleo evitará interrumpir el tejido sano circundante o en recuperación. Suponemos que la difusión de cualquier agente activo incluido dentro del biomaterial podrá alcanzar el peri-infarto desde el núcleo, especialmente porque encontramos que la entrega de biomateriales de hidrogel reduce el grosor de la cicatriz glial11. Esto es importante ya que se ha demostrado que la región periinfarto exhibe neuroplasticidad después del accidente cerebrovascular, lo que la convierte en un objetivo atractivo. Además, la entrega de una matriz sustituta al núcleo del accidente cerebrovascular se puede cargar con12 factores angiogénicos o13 neurogénicos para guiar la formación de tejido nuevo, así como células para el parto14. La entrega celular se mejora en gran medida mediante el uso de una matriz porque protege a las células de las fuerzas de inyección severas y el entorno local presente durante la entrega, así como fomenta la diferenciación y el injerto15.
Estos biomateriales terapéuticos inyectables tienen relevancia clínica en aplicaciones de accidente cerebrovascular, ya que actualmente no existen terapias médicas que estimulen la recuperación neuronal después del accidente cerebrovascular. Los circuitos neuronales subyacentes involucrados en la recuperación se encuentran en el tejido cerebral que está adyacente al núcleo del accidente cerebrovascular16,mientras que el núcleo del accidente cerebrovascular en sí está desprovisto de tejido neural viable. Anticipamos que la entrega de un biomaterial en el núcleo del accidente cerebrovascular necrótico tiene el potencial de estimular el tejido adyacente hacia procesos regenerativos a través de una serie de mecanismos mencionados anteriormente, incluida la liberación de factores de crecimiento de depósito13,la estimulación del crecimiento del tejido y la promoción del desarrollo del tejido cerebral en recuperación11,12, la alteración de las respuestas inmunes17y la entrega de terapias derivadas de células madre14, 18. Sin embargo, para estudiar eficazmente la posibilidad de estas aplicaciones, se necesita un método consistente y reproducible para inducir el accidente cerebrovascular e inyectar biomateriales. El modelo de trazo PT utiliza técnicas que ofrecen un control preciso sobre la orientación y la ubicación del trazo. Un láser conectado al dispositivo estereotáxico guía las orientaciones, y las bombas conectadas a los dispositivos estereotáxicos controlan la velocidad de inyección del material sin la necesidad de formas adicionales de imágenes. Por lo tanto, hemos optado por describir los métodos para realizar un accidente cerebrovascular PT en las cortezas motoras de ratones y para inyectar biomateriales en el núcleo del accidente cerebrovascular. Aquí, utilizamos hidrogeles de partículas recocidas microporosas (MAP) como biomaterial para inyección sin células añadidas ni factores de crecimiento. Además, explicamos cómo recuperar con éxito el cerebro con biomaterial intacto, y discutimos los ensayos de inmunoquímica utilizados para analizar el resultado del accidente cerebrovascular con y sin inyección de biomateriales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí demostramos un modelo de accidente cerebrovascular permanente fácilmente reproducible, mínimamente invasivo y describimos cómo inyectar un biomaterial en el infarto cinco días después del accidente cerebrovascular. El uso del tinte fototrombótico Rose Bengal y un láser colimado de 520 nm conectado al dispositivo estereotáxico nos da la capacidad de posicionar el trazo en la corteza motora del ratón con mayor precisión. Cinco días después del accidente cerebrovascular, la ubicación del infarto es visibl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gusta reconocer a los Institutos Nacionales de Salud y al Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares por su financiación (R01NS079691).
Materials
| 10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
| 2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
| 25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
| 25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
| 2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
| Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
| Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
| Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
| BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
| Bone Iris Mini Scissors – 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
| Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack – for attaching laser to sterotax |
| Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
| Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
| Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
| Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
| CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
| Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
| Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
| Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
| EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
| EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
| ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
| Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
| FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
| Fine Scissors – straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
| IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
| Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
| Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
| Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
| M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
| Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
| Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
| Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
| Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
| Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
| Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
| Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
| Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
| Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
| Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
| PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
| Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
| Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
| Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
| Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
| Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
| Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
| Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
| SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
| Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
| StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
| Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
| Student Adson Forceps -1×2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Student Fine Forceps – straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
| Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
| Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
| Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
| VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
| Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |
References
- National Center for Health Statistics. . Health, United States, 2015: With Special Feature on Racial and Ethnic Health Disparities. , (2016).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 229 (2017).
- Rosamond, W., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2007 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 115 (5), 69 (2017).
- Ovbiagele, B., et al. Forecasting the future of stroke in the united states: A policy statement from the American heart association and American stroke association. Stroke. 44 (8), 2361-2375 (2013).
- Carmichael, S. T. Themes and strategies for studying the biology of stroke recovery in the poststroke epoch. Stroke. 39 (4), (2008).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (3), (2005).
- Qin, L., et al. An adaptive role for BDNF Val66Met polymorphism in motor recovery in chronic stroke. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2493-2502 (2014).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinshnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
- Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke. Journal of Visualized Experiments. (100), e52794 (2015).
- Tuladhar, A., Payne, S. L., Scoichet, M. S. Harnessing the potential of biomaterials for brain repair after stroke. Frontiers. 5, 14 (2018).
- Nih, L. R., Sideris, E., Carmicahel, S. T., Segura, T. Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stoke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion. Advance Materials. 29 (32), (2017).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Duel-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17, 642-651 (2018).
- Cook, D. J., et al. Hydrogel-delivered brain-derived neurotrophic factor promotes tissue repair and recovery after stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37, 1030-1045 (2017).
- Lam, J., Lowry, W. E., Carmichael, S. T., Segura, T. Delivery of iPS-NPCs to the stroke cavity within a hyaluronic acid matrix promotes the differentiation of transplanted cells. Advance Functional Materials. 24, 7053-7062 (2015).
- Nih, L. R., et al. Engineered HA hydrogel for stem cell transplantation in the brain: Biocompatibility data using a design of experiment approach. Data in Brief. 10, 202-209 (2016).
- Carmichael, S. T. The 3 Rs of Stroke Biology: Radial, Relayed, and Regenerative. Neurotherapeutics. 13, 348-359 (2016).
- Caicco, M. J., Cooke, M. J., Wang, Y., Tuladhar, A., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. A hydrogel composite system for sustained epi-cortical delivery of Cyclosporin A to the brain for treatment of stroke. Journal of Controlled Release. 166 (3), 197-202 (2013).
- Moshayedi, P., et al. Systematic optimization of an engineered hydrogel allows for selective control of human neural stem cell survival and differentiation after transplantation in the stroke brain. Biomaterials. 105, 145-155 (2016).
- Lu, H., et al. Hemodynamic effects of intraoperative anesthetics administration in photothrombotic stroke model: a study using laser speckle imaging. BMC Neuroscience. 18 (10), (2017).
- Wiersma, A. M., Winship, I. R. Induction of Photothrombotic Stroke in the Sensorimotor Cortex of Rats and Preparation of Tissue for Analysis of Stroke Volume and Topographical Cortical Localization of Ischemic Infarct. Bio-protocol. 8 (10), (2018).
- Liang, H., et al. Region-specific and activity-dependent regulation of SVZ neurogenesis and recovery after stroke. PNAS. 116 (27), 13621-13630 (2019).
- Payne, S. L., Anandakumaran, P. N., Varga, B. V., Morshead, C. M., Nagy, A., Shoichet, M. S. In vitro maturation of human iPSC-derived neuroepithelial cells influences transplant survival in the stroke-injured rat brain. Tissue Engineering Part A. 24, 351-360 (2018).
- Lee, I. H., et al. Delayed epidural transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors enhances functional recovery after stroke. Science Reports. 7, 1943 (2017).
- Somaa, F. A., et al. Peptide-based scaffolds support human cortical progenitor graft integration to reduce atrophy and promote functional repair in a model of stroke. Cell Reports. 20, 1964-1977 (2017).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2016).
- Sideris, E. Y., Aaron, C. J., Carmichael, S. T., Segura, T. Hyaluronic acid particle hydrogels decrease cerebral atrophy and promote pro-reparative astrocyte/axonal infiltration in the core after ischemic stroke. bioRxiv. , (2019).
- Yu, H., et al. Combinated Transplantation of Neural Stem Cells and Collagen Type I Promote Functional Recovery After Cerebral Ischemia in Rats. The Anatomical Record. 293 (5), 911-917 (2010).
- Jin, K., et al. Transplantation of Human Neural Precursor Cells in Matrigel Scaffolding Improves Outcome from Focal Cerebral Ischemia after Delayed Postischemic Treatment in Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30 (3), 534-544 (2009).
- Gelderblom, M., et al. Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke. Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).
- Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
- Zhang, R., et al. Activated Neural Stem Cells Contribute to Stroke-Induced Neurogenesis and Neuroblast Migration toward the Infarct Boundary in Adult Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
